一种抗人CD47单克隆抗体的制备及其应用的制作方法

本发明涉及生物
技术领域：
，具体涉及一种抗人cd47单克隆抗体的制备及其应用。
背景技术：
：cd47(clusterofdifferentiation47)又叫做整合素相关蛋白，广泛表达于正常细胞表面，是目前已知的免疫检查点之一。cd47作为受体与血小板反应蛋白-1(thrombospondin-1)结合时能够影响包括细胞迁移，粘附，增殖及凋亡在内的细胞相关功能，同时还能调节血管生成与炎症反应。当它作为配体和巨噬细胞表面的信号调节蛋白α(signal-regulatoryprotein-α,sirpα)结合时，能够传递抑制性信号抑制巨噬细胞对相关细胞的吞噬。由于cd47表达的减少，血液循环中老化的红细胞更容易被巨噬细胞清除。研究表明，cd47不仅在各类组织中广泛表达，并且在肿瘤细胞表面高表达，临床报告显示cd47在肿瘤组织中的高表达与预后不良有关。肿瘤细胞表面高表达的cd47与sirpα结合时产生的抑制性信号促使肿瘤细胞逃离巨噬细胞的吞噬，从而诱导了肿瘤的发生与发展，是肿瘤微环境中介导肿瘤细胞逃离免疫监视的主要分子之一。通过阻断肿瘤细胞表面cd47与sirpα结合所传递的抑制性信号通路，恢复或者加强巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬功能，能促进巨噬细胞介导的细胞免疫反应，从而为肿瘤免疫治疗提供新的理论和方法。人cd47(由基因cd47编码)是免疫球蛋白超家族的成员，目前已经明确了人cd47的胞外功能区结构和cd47与其配体sirpα的晶体结构。cd47由五个跨膜区和一个细胞外n端的igv结构域组成，胞外区包括139个氨基酸，根据胞内区长短具有四种剪接体形式分布在不同组织中，其中以最广泛表达的剪接体2的形式分布于循环细胞和免疫细胞中。sirpα胞内区具有基于酪氨酸的免疫受体酪氨酸抑制作用模式体(itim)，当与cd47结合后，该模式体被磷酸化并且招募抑制性分子如shp-1等进而阻止免疫细胞的激活。cd47在肿瘤免疫逃避机制中扮演了至关重要的角色。现有研究结果已经明确了cd47参与肿瘤的发生发展，并视其为肿瘤免疫治疗的重要靶点。通过流式细胞术和免疫组织化学分析，已经在人的血液瘤包括急慢性骨髓系白血病和非霍奇金淋巴瘤和实体肿瘤中发现了cd47的高表达，这些实体肿瘤包括肉瘤，结肠癌，肾癌，多发性骨髓瘤以及包括膀胱癌，肺癌等。由此可见，分析cd47在肿瘤疾病中的表达对肿瘤的预后评估具有极为重要的临床意义。近年来针对cd47与其配体sirpα信号轴介导的肿瘤逃离机制进行的药物研发成为了继pd-1/pd-l1之外的肿瘤免疫治疗的热门，cd47的抗体开发目前也已经进入临床前期。然而，目前正在开发的抗人cd47单克隆抗体还存在亲和力较低，副作用较大，作用靶点如抗原表位不明确的缺点。技术实现要素：本发明所要解决的主要技术问题是目前抗cd47单克隆抗体存在的亲和力较低，作用靶点如抗原表位不明确的缺点，提供了一种抗人cd47单克隆抗体的制备及其应用。本发明的第一方面提供了一种抗人cd47单克隆抗体，所述抗人cd47抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述抗cd47抗体具有如下技术特征中的一项或多项：<1>重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如seqidno.1所示的cdrh1；<2>重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如seqidno.2所示的cdrh2；<3>重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如seqidno.3所示的cdrh3；<4>轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如seqidno.4所示的cdrl1；<5>轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如seqidno.5所示的cdrl2；<6>轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如seqidno.6所示的cdrl3。cdr(互补决定区，complementaritydeterminingregion)通常指抗体中在空间结构上可以与抗原决定簇形成互补的区域。抗体中的可变性通常并不均匀地分布在整个抗体的可变区中，单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区通常均具有3个超变区(hypervariableregion，hvr)，这些区域在空间结构上通常可以与抗原决定簇形成互补，所以超变区也被称为互补决定区(complementaritydeterminingregion，cdr)，即重链可变区通常包括三个互补决定区，即cdrh1、cdrh2和cdrh3，轻链可变区通常包括三个互补决定区，即cdrl1、cdrl2和cdrl3。在一种实施方式中，所述抗人cd47的单克隆抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如seqidno.1所示的cdrh1、氨基酸序列如seqidno.2所示的cdrh2和氨基酸序列如seqidno.3所示的cdrh3；和/或，所述抗人cd47的单克隆抗体的轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如seqidno.4所示的cdrl1、氨基酸序列如seqidno.5所示的cdrl2和氨基酸序列如seqidno.6所示的cdrl3。在一种实施方式中，所述抗人cd47的单克隆抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如seqidno.1所示的cdrh1、氨基酸序列如seqidno.2所示的cdrh2和氨基酸序列如seqidno.3所示的cdrh3。在一种实施方式中，所述抗人cd47的单克隆抗体的轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如seqidno.4所示的cdrl1、氨基酸序列如seqidno.5所示的cdrl2和氨基酸序列如seqidno.6所示的cdrl3。在一种实施方式中，所述抗人cd47的单克隆抗体的重链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如seqidno.1所示的cdrh1、氨基酸序列如seqidno.2所示的cdrh2和氨基酸序列如seqidno.3所示的cdrh3，轻链可变区的互补决定区包括氨基酸序列如seqidno.4所示的cdrl1、氨基酸序列如seqidno.5所示的cdrl2和氨基酸序列如seqidno.6所示的cdrl3。在一种实施方式中，所述抗人cd47的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区中还可以包括框架区，所述框架区可以位于互补决定区之间，也可以位于互补决定区的两端。在一种实施方式中，所述抗人cd47的单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列如seqidno:7所示，轻链可变区的氨基酸序列如seqidno:8所示。本发明的第二方面提供了一种核苷酸分子，编码如上所述的抗人cd47的单克隆抗体。在一种实施方式中，所述核苷酸分子编码抗人cd47单克隆抗体的重链的核苷酸序列如seqidno:9所示，编码轻链可变区的核苷酸序列如seqidno:10所示。本发明的第三方面提供了一种表达载体，含有如上所述的核苷酸分子。本发明中的表达载体通常指本领域熟知的各种市售表达载体，例如可以是细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒或其他载体。本发明的第四方面提供了一种宿主细胞，含有如上所述的表达载体或或基因中整合有外源的所述核苷酸分子。任何适用于表达载体进行表达的细胞都可以作为宿主细胞，例如，所述宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。进一步举例，可以是bl21(de3)细胞和293f、cos、cho细胞等。本发明的第五方面提供了一种如上所述的抗人cd47的单克隆抗体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：在适合表达所述抗体的条件下，培养如上所述的宿主细胞，从而表达出所述的单克隆抗体，纯化分离出所述的单克隆抗体。所述宿主细胞在合适的表达条件下表达所述的抗人cd47单克隆抗体或者是通过杂交瘤技术获取稳定分泌抗人cd47单克隆抗体的杂交瘤细胞。本发明中所用的宿主细胞均为现有技术，可通过商业途径直接获取，培养中所用的培养基亦为各种常规培养基，本领域技术人员可根据经验选择适用的培养基，在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(hplc)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。本发明的第六方面提供了如上所述的抗cd47抗体在制备抗肿瘤治疗药物中的用途、或制备诊断肿瘤药物中的用途。所述肿瘤治疗药物通过阻断cd47来促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的功能从而杀伤肿瘤细胞。所述肿瘤治疗药物可以是以肿瘤细胞表面功能性表达的cd47抗原为靶标，结合或作用于cd47抗原，从而治疗和/或预防肿瘤的药物。所述肿瘤包括但不限于：肺癌、胃癌、宫颈癌、b淋巴瘤。所述治疗肿瘤的药物可以用于高表达cd47的肿瘤细胞，用本发明所述的抗人cd47单克隆抗体与肿瘤细胞共孵育之后加入巨噬细胞进行吞噬，其使用浓度根据不同细胞有所调整。常规剂量是20-50μg抗体/105个肿瘤细胞。所述诊断肿瘤药物可以是在以肿瘤细胞表面功能性表达的cd47抗原为靶标，本发明所述的抗人cd47单克隆抗体作为一抗和荧光二抗如fitc偶联的山羊抗鼠抗体联合使用进行检测，其使用浓度根据不同细胞有所调整。常规剂量是10-100μg抗体/106个细胞。本发明的第七方面提供了一种抗人cd47的单克隆抗体的靶向抗原，其特征在于，所述靶向抗原的抗原表位氨基酸序列如seqidno:11所示。本发明的第八方面提供了上述抗人cd47单克隆抗体的的靶向抗原的鉴定方法。鉴定方法包括：鉴定靶向抗原的抗原表位，具体的，可以为：a)扩增抗原片段截短体，可以运用分子克隆技术如pcr方法，或者人工全序列合成的方法得到抗原片段截短体核苷酸分子。b)利用分子克隆技术将抗原片段截短体构建至表达型原核载体如pgex-4t-1中，再用化学转化方式转化至大肠杆菌如bl21中进行表达。c)取b)中表达的抗原片段截短体进行蛋白免疫印，根据结果分析抗体所识别的抗原表位。本发明所用试剂耗材均市售可得。本发明的有益效果为：本发明提供的抗人cd47单克隆抗体具有良好的结合活性，能有效识别肿瘤细胞表面cd47表达，并且能在蛋白水平有效识别重组人cd47胞外区蛋白。同时该单克隆抗体的抗原表位鉴定较为明确，能有效运用于cd47靶标分子的诊断及抗人cd47单克隆抗体药物的制备开发中。附图说明图1为目的蛋白表达条件摸索结果。图2为目的蛋白纯化结果。图3为目的蛋白复性后纯度检测结果。图4为流式细胞术检测肿瘤细胞表面cd47抗原表达。图5为iptg诱导目的蛋白和gst的表达结果。图6为westernblot鉴定抗原表位结果。图7为iptg诱导目的蛋白表达结果。图8为westernblot进一步鉴定抗原表位结果。图9为单克隆抗体体外抗肿瘤效果。具体实施方式本文所用的术语“单克隆抗体(单抗)”指从一类基本均一的群体获得的抗体，即该群体中包含的单个抗体是相同的，除少数可能存在的天然发生的突变外。单克隆抗体高特异性地针对单个抗原点。而且，与常规多克隆抗体制剂(通常具有针对不同决定簇的不同抗体)不同，各单克隆抗体是针对抗原上的单个决定簇。除了它们的特异性外，单克隆抗体的好处还在于它们是通过杂交瘤培养来合成的，不会被其它免疫球蛋白污染。修饰语“单克隆”表示了抗体的特性，是从基本均一的抗体群中获得的，这不应被解释成需要用任何特殊方法来产生抗体。本文所用的术语“抗体”和“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150,000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(l)和两个相同的重链(h)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(vh)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端由可变区(vl)，另一端有恒定区：轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸在轻链和重链的可变区之间形成界面。本文所用的术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(cdr)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为架构区(fr)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个fr区，它们大致上呈p一折叠构型，由形成接连环的三个cdr相连，在某些情况下可形成部分p折叠结构。每条链中的cdr通过fr区紧密地靠在一起并与另一链的cdr一起形成了抗体的抗原结合部位，恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。单克隆抗体可用本领域技术人员熟知的各种方法来获得。例如，单克隆抗体可用杂交瘤方法(由kohler等，nature,256:495(1975)首先提出)制得，或用重组dna方法(美国专利no.4,816,567)制得。单克隆抗体也可用例如clackson等，nature，352：624-628(1991)和marks等，j.mol.biol.，222：581-597(1991)所述的技术从噬菌体抗体库中分离获得。所得单克隆抗体可用常规手段来鉴定。单克隆抗体的结合特异性可用免疫沉淀或体外结核试验分析来测定。以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其它优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围；在本发明说明书和权利要求书中，除非文中另外明确指出，单数形式“一个”、“一”和“这个”包括复数形式。当实施例给出数值范围时，应理解，除非本发明另有说明，每个数值范围的两个端点以及两个端点之间任何一个数值均可选用。除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本
技术领域：
技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据本
技术领域：
的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本
技术领域：
常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组dna技术及相关领域的常规技术。实验材料：6-8周balb/c雌鼠，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供；细胞系：mkn-45细胞(人胃癌细胞系)、a549细胞(人肺腺癌细胞系)、hela细胞(人宫颈癌细胞系)、raji细胞(b淋巴瘤细胞系)和293f细胞系(人胚肾细胞系)、sp2/0(小鼠骨髓瘤细胞系)；其中mkn-45细胞、hela细胞用rpmi1640培养基，其中含有细胞生长所需的必需营养胎牛血清(10％)以及一定含量的双抗(1％，青霉素和链霉素溶液)；其他来源的细胞系都用dmem培养基来培养，其余的都与上述成分及比例相同；细胞培养基(包括dmem培养液和rpmi1640培养液)，胎牛血清，0.25％胰酶溶液，青霉素和链霉素溶液(100×，双抗)，freestylemax转染试剂和293ffreestyle培养基，ecl发光底物均来自于赛默飞公司(thermo，中国)。夹心法酶联免疫吸附测定(elisa)试剂：抗原包被缓冲液(ph9.60.05m碳酸盐缓冲液)：碳酸钠1.59克，碳酸氢钠2.93克，加蒸馏水至1000ml；洗涤缓冲液(ph7.4pbs)：0.15m磷酸二氢钾0.2克；十二水磷酸氢二钠2.9克，氯化钠8.0克，氯化钾0.2克，0.05％吐温200.5ml，加蒸馏水至1000ml；封闭液：牛血清白蛋白(bsa)2克，加洗涤缓冲液至100ml；终止液(2m硫酸)：蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml；底物缓冲液(ph5.0磷酸及柠檬酸)：0.2m十二水磷酸氢二钠(28.4克/l)25.7ml，0.1m柠檬酸(19.2克/l)24.3ml，加蒸馏水50ml；tmb(四甲基联苯胺)使用液：tmb溶液(10mgtmb溶解于5ml无水乙醇中)0.5ml，底物缓冲液(ph5.0)10ml，0.75％h2o232μl；hrp-山羊抗鼠igg抗体购自jackson公司，作为elisa二抗。elisa包被用平板，biofil公司。其他：trizolrna提取试剂，sigma公司gel/pcr纯化试剂盒，fagck001，favorgen；质粒dna小提试剂盒，fapde300，favorgen；revertraaceqpcrrtkit，fsq-101，toyobo；kod-neo-plμs高保真pcr酶，toyobo；脱脂奶粉，bd；牛血清白蛋白bsa，v900933，sigma公司；dh5α感受态，bl21感受态，上海唯地生物技术有限公司；硫酸卡那霉素，ni-nta琼脂糖重力柱，生工生物工程(上海)；重组鼠集落刺激因子，近岸蛋白，配置成100μg/ml母液分装于-80摄氏度冰箱。弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂，peg1500，sigma公司；8-氮鸟嘌呤，sigma公司，用于sp2/0细胞系的稳定筛选培养；bca测定试剂盒，碧云天公司；小鼠免疫球蛋白分型试剂盒，bdpharmingen。甲醇、无水乙醇、异丙醇、三氯甲烷、30％过氧化氢溶液、二甲基亚砜、氯化钠、甘氨酸、tris、sds、尿素等试剂均购买自国药集团。实施例1重组人cd47胞外区抗原的制备利用trizol法提取mkn-45细胞中的rna：提前一晚将1x106个mkn45种于3cm培养皿中，第二天弃掉培养基上清，1xpbs润洗后，用1mltrizol消化后于冷冻高速离心机中以12000×g的转速，在4℃的温度下离心5分钟，小心取出离心后的管子，稍稍倾斜然后用枪头将最上层的液体吸取到另外一个无rna酶的灭菌过的1.5ml离心管中，按照氯仿与trizol体积比是1:5的比例加入氯仿，上下颠倒充分混匀液体使其成为乳白色；室温放置3分钟后，于冷冻高速离心机中以12000×g的转速，在4℃的温度下离心15分钟，小心取出离心后的管子，此时可见管子里出现了分层，将上层水相(含有rna)加到已经标记好对应名称的另一个无rna酶的灭菌过的离心管中，尽量不要吸取中间层，放止rna被蛋白污染；之后按照每毫升trizol里500μl异丙醇的体积比例在管子里面小心加入异丙醇，上下来回颠倒十次左右使液体充分混合均匀，然后在室温下静置10分钟，之后在冷冻离心机中于4℃，以12000×g的转速离心10分钟，轻轻倒掉上清；接着按照每毫升trizol加1ml75％乙醇(depc水配制，即7.5ml无水乙醇与1.5mldepc水混合即可，然后放在4℃冰箱中预冷)的比例加入75％乙醇，轻弹管壁使沉淀悬浮，沉淀呈白色羽毛状；随后将离心管以4℃，7500×g离心5分钟；离心后吸掉上清后，倒置在无尘纸上室温放15分钟保证溶剂尽量挥发干净，最后在离心管加入50μldepc水溶解沉淀，用nanodrop测定rna浓度。使用revertraaceqpcrrt试剂盒，将mkn-45细胞中提取的总mrna反转录进而获得人cd47cdna：利用primer5软件设计聚合酶链反应(pcr)的正向引物：gatatcatatgcagctactatttaataaaacaaaa(seqidno.12)和反向引物：gatatctcgagttatggagaaaaccatgaaacaac(seqidno.13)扩增人cd47胞外区蛋白。利用核酸电泳进行产物纯度大小的分析；将pcr产物用gel/pcr纯化试剂盒进行产物快速回收纯化，然后将pet28a(+)载体(novagen，darmstadt，germany)和目的基因进行bamhi和xhoi双酶切，在4℃下进行载体和目的基因的连接，过夜。第二天进行转化，挑约10个单菌落至相应抗性画有方格编号的lb平板，培养约3h后做菌落pcr检测，用之前的pcr产物做阳性对照的pcr模板。取pcr阳性克隆至37℃细菌摇床中培养过夜。第二天用质粒dna小提试剂盒进行质粒抽提，通过限制酶酶切和测序验证阳性克隆。验证正确后，将质粒转化至bl21感受态细胞中。将转化的菌落接种于含有50μg/ml卡那霉素的10mllb培养基中，并在37℃，220rpm过夜培养。第二天，用10mllb以1：100的比例至5个新的50ml管(标记为“ct1”，“1”，“2”，“3”，“4”)的比例接种细胞。将这些管在37℃，220rpm下孵育3小时左右，直至od600值在0.5～0.8之间。然后将5个标记的管在5种不同条件下孵育：37℃，5小时，用异丙基-β-d-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)(0.5mm和0.1mm)诱导，16℃用iptg(0.5mm和0.1)诱导16小时。在没有iptg诱导的情况下，在37℃下培养5小时。将细胞以4,000rpm在4℃离心20分钟以除去上层，将沉淀物重新悬浮于2ml磷酸盐缓冲盐水(pbs，ph7.4)中并进行超声裂解。然后将裂解物在4℃下以13,000g离心10分钟以上清液。各取40μl裂解物和上清液溶解于10μl5x上样缓冲液中，99℃煮样10min；取20μl混合液进行12％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析，用考马斯亮蓝染色1小时，然后使用含45％(v/v)甲醇和10％(v/v)乙酸的脱色液脱色过夜，以评估靶蛋白的最佳表达条件，结果见图1。如图1所示，“t”表示裂解物，“s”表示上清液，目的蛋白在16℃用iptg0.5mm诱导时候表达量较高，且大部分未在上清液中，需从包涵体中纯化目的蛋白。对于大量表达的cd47抗原：将过夜细菌培养物(8ml)全部接种到800ml新鲜培养基中，并用0.5mmiptg在16℃诱导16小时。将来自细胞裂解物的包涵体沉淀用pbs洗涤3次，然后通过变性缓冲液(8m尿素，5mmedta，20mmtris，ph8.0)变性，使用超声裂解和剧烈摇晃促进包涵体的溶解变性，之后在4℃下以13,000g离心10分钟收集上清液即为溶解的包涵体蛋白。使用预加载的ni-nta琼脂糖重力柱进行变性cd47胞外区蛋白的纯化，先将蛋白上清液缓慢流过重力柱，收集流传液；再分别用1ml20mm、1ml50mm、10ml300mm的咪唑溶液(溶于pbs中)进行洗脱和收集。纯化后，各取40μl洗脱液溶解于10μl5x上样缓冲液中，99℃煮样10min；进行sds-page分析洗脱液中目的蛋白的大小和纯度，结果见图2。如图2所示，样品2至7的条带比较单一，纯度较高。cd47抗原的复性：合并较为纯的洗脱的样品，并使用bca测定试剂盒将其调节至0.5mg/ml的浓度，然后转移到透析袋中。通过使用恒流泵(流速：1ml/min)滴加1l缓冲液a(6m尿素，5mmedta，20mmtris,ph8.0)开始进行cd47ecd的折叠复性；24h后加入滴加1l缓冲液b(5mmedta，20mmtris,ph8.0)；24小时弃掉一半液体，再加入1l缓冲液b静止24h；弃掉一半液体然后加入1l缓冲液c(5mmedta，20mmtris，ph8.0)静止12小时，然后弃掉所有液体，加入1l缓冲液c(5mmedta，20mmtris，ph8.0)12小时，用磁力搅拌器低速搅拌。然后收集样品并在13,000rpm，4℃下离心20分钟以除去蛋白聚集沉淀物，然后进行sds-page分析蛋白的大小和纯度，结果见图3。由图3所示，复性后的蛋白“2”大小与复性前蛋白“1”大小相吻合，且纯度较高。使用3kdaamicon离心过滤器浓缩蛋白溶液。bca测定试剂盒用于测定蛋白质浓度。之后将纯化复性后的重组人cd47蛋白分装到-80℃进行保存。实施例2用重组人cd47胞外区抗原免疫小鼠第一次免疫将含有50μg重组人cd47抗原的pbs溶液与等体积的弗氏完全佐剂进行超声乳化，总体积200μl，皮下多点注射balb/c雌鼠。每次免疫5只鼠。3周后进行第二次加强免疫：每只小鼠抗原量25μg与等体积弗氏不完全佐剂配成总体积200μl，进行超声乳化，皮下多点注射。两周后进行第三次免疫：按每只小鼠抗原量25μg，与等体积弗氏不完全佐剂配成总体积200μl进行超声乳化，皮下多点注射。所有小鼠在三次免疫后取血清。小鼠血清的获取：第三次免疫过后一周，将小鼠固定，剪去一小部分鼠尾，用1.5mlep管收集尾部血液约100μl，11,000rpm离心5min，取上清进行检测用双抗夹心法elisa检测小鼠血清中的滴度。实验前一晚用浓度为10μg/ml浓度的cd47抗原溶液(溶解于包被液中)，100μl/孔，4度包被过夜；第二天，弃掉抗原包被液，pbs洗涤缓冲液充满各孔，静止5min后拍干，洗涤3次；每孔加200μl封闭液，37℃，孵育1h；弃掉封闭液，pbs洗涤缓冲液充满各孔，静止5min后拍干，洗涤3次；加待测样品，用pbs按照200、2000、20000、200000倍的比例稀释血清，每孔加待测样品100μl，pbs为空白对照。37℃，孵育2h；弃掉血清样品，pbs洗涤缓冲液充满各孔，静止5min后拍干，洗涤3次；加hrp-山羊抗鼠抗体，用1:5000稀释。100μl/孔，37℃，孵育1h；弃掉抗体溶液，pbs洗涤缓冲液充满各孔，静止5min后拍干，洗涤3次；现用现配tmb显色液，100μl/孔，室温暗处放置15min，呈现蓝色；每孔加50μl终止液，终止反应，显黄色，用酶标仪在450nm波长测吸光值，结果见表1。如表1所示，按吸光度与空白对照组相比大于0.2即为阳性，小鼠1、2、4、5的血清抗体滴度大于20,000。取血后一周，取抗体滴度大于20,000的小鼠进行冲击免疫，腹腔注射含25μg抗原的pbs。表1:小鼠三次免疫后血清抗体滴度的测定实施例3杂交瘤细胞的融合和筛选冲击免疫3天后，准备取脾脏进行细胞融合。将处死的小鼠浸没到70％的酒精中，并放置在解剖板上，将小鼠的脾脏从腹腔的左上方取出，将脾脏置于含有3ml完全dmem培养基的60mm直径的培养皿中；将盛放脾脏的培养皿转移至超净台，用一套无菌的剪刀镊子小心地将脾脏表面的脂肪和其他组织剥离干净；将脾脏转移到细胞过滤筛中，将筛子置于含有10mldmem的100mm的培养皿中；使用3ml注射器带有26g针头，将2mldmem注射到脾脏的不同位置；用无菌剪将充满dmem的脾脏剪几处；用3ml注射器的栓塞将脾脏撵至只剩下纤维组织保留在筛子的表面，被碾压通过筛子的组织被收集在下面的无菌培养皿中；用2ml完全dmem培养基漂洗筛子一次；将脾细胞悬液转移到15ml离心管中，用5ml的移液管吹打几次使结团分开；将悬液在室温静置3min；转移95％的细胞悬液至15ml离心管中；使用台盼蓝染色检测活细胞的数目，记录活细胞的比例(忽略掉红细胞，其大小明显小于有核细胞)；转移1x108个活的脾细胞至15ml离心管中；用完全dmem培养基将杂交瘤细胞漂洗2遍，200g离心5min，5ml完全培养基重悬细胞；将脾细胞加到骨髓瘤细胞的50ml离心管中，加满dmem；200g室温离心5min；同上用50mldmem重悬细胞沉淀，离心；将离心管放在小烧杯中，置于37℃水浴锅温浴2min，轻弹管底使沉淀松散。使用无菌的peg溶液融合脾细胞和骨髓瘤细胞：在第1min内，加1ml37℃预热的peg溶液，轻轻混合(边旋转管子边加peg溶液)；2min中内，100g离心(离心总时间2min)；3min内逐滴加入4.5ml完全dmem；2min内再加入5ml完全dmem之后加满完全dmem；100g室温离心5min后除去上清，使用35mlhat，即含次黄嘌呤(h)、氨基蝶呤(a)和胸腺嘧啶核苷(t)的培养液(含20％胎牛血清)选择培养基重悬细胞沉淀；将细胞悬液置于37℃，8％co2，98％湿度的培养箱中，至少30min后进行细胞铺板和培养：96孔板中心的60个，每孔加100μl细胞悬液，周围的30孔，每孔加100μl无菌的1xpbs。将96孔板在37℃，8％co2，98％相对湿度的培养箱中培养，此为第1天。在培养的第5天，每孔加100μl的hat培养基。用hat选择培养基培养杂交瘤细胞2周，两周后换成ht培养基，在前两轮有限稀释克隆培养杂交瘤细胞的过程中均使用ht培养基。在培养的第7天，每孔弃掉100μl旧的培养基，补加100μl新鲜培养基，每隔一天重复次操作直到每孔内细胞的汇合率达到10％～50％，此时可开始用夹心法elisa方法检测抗体。将有阳性的细胞孔置于24孔板中扩大培养并且进行第一轮有限稀释：将每个阳性孔内细胞吹打重悬，血球计数板进行密度的测定；取出需要的细胞量，对细胞悬液进行逐级稀释，每次稀释的倍数不要超过100倍，直到最小浓度8个细胞/ml直到最小浓度8个细胞/ml；先将96孔板周围的30孔，每孔加100μl无菌的1xpbs。然后用排枪将里面60孔的上面50个加100μl/孔的8个/ml浓度的细胞悬液，底面10个孔加80个/ml浓度的细胞悬液,100μl/孔，在37℃，8％co2，98％的相对湿度中培养，此为第1天。第6天每孔补加100μl的培养基，如果必需，隔天可换液，即弃100μl旧培养基，再补加100μl新鲜培养基；当细胞的汇合率达到10％-50％时，挑选仅有单个克隆细胞簇的孔，用夹心法elisa检测上清中的特异性抗体。经过3轮的有限稀释和单克隆培养后获取单克隆杂交瘤细胞，将获得的单克隆细胞株扩大培养，并冻存至液氮中。实施例4腹水抗体的制备与纯化腹水抗体的制备：取6-8周balb/c雌鼠，在腹腔注射杂交瘤细胞前，用22g针头每只鼠腹腔注射0.8ml弗氏不完全佐剂；一周后，将培养至对数期杂交瘤细胞收集，将细胞轻轻吹打下来，细胞悬液转移至50ml离心管中1500rpm，室温离心5min；弃去上清液，将细胞重悬到50ml无菌pbs中，在1500rpm，室温离心5min；去掉上清液，重复洗涤两次；将细胞重悬到5mlpbs中，台盼蓝细胞计数细胞存活率；用pbs调节活细胞浓度到2.5x106/毫升，每只小鼠腹腔注射2ml细胞悬液，等待1到2周，每天观察腹水产生情况；收取腹腔液，4℃离心腹腔液10min，3000rpm。收集上清液弃掉沉淀，将腹腔液收集并在4℃冰箱保存；用夹心法elisa检测腹腔液中单克隆抗体的滴定度；按照1:10比例用结合液稀释之后再用0.45μm滤器滤过除菌。腹水抗体的纯化：将上述腹腔液体按照1:10比例用结合液稀释之后，再用0.45μm滤器过滤，即可上预加载1mlproteing琼脂糖凝胶的重力柱进行纯化；纯化前先分别用5ml水和5mlbindingbμffer对柱料进行洗涤和稳定，然后加入稀释后的腹腔液，同时收集流传液进行分析；用洗脱液进行洗脱，按1ml一管收集10ml，每管加入60μl1mtris-hcl(ph9.0)进行中和；纯化后，各取40μl洗脱液溶解于10μl5x上样缓冲液中，99℃煮样10min；进行sds-page分析洗脱液中目的蛋白的大小和纯度；合并较为纯的洗脱的样品，然后转移到透析袋中用1l的1xpbs进行透析，12h后换液继续透析一次。收集透析后的样品，用bca试剂盒测定蛋白浓度，分装到-80℃保存。实施例5鼠源抗人cd47单克隆抗体亚型鉴定首先将单克隆抗体特异结合的对应抗原用1xpbs缓冲液包被酶标微孔板，每孔100μl合100ng左右，置4℃放置12小时，随后甩去包被液用pbs-t洗一遍。37℃下，5％bsa封闭液封闭2小时；将待测的腹水抗体(稀释15，000倍)每种加一排共计8孔，每孔100μl，置37℃温育30分；而后吸去样品液用pbs-t洗5遍，此时将6种酶标记物(goatanti-moμseig(g1\g2a\g2b\g3\m\a\κ\λ)*hrp)每种加1孔每孔100μl共12孔(或6孔)，置37℃温育30分后继续吸去酶标抗体液用pbs-t洗5遍，随后加tmb显色液37℃避光显色20分钟；用2m硫酸终止反应后用酶标仪450纳米双波长读数判定，结果见表2。由表2可知，该单克隆抗体重链属于igg2b亚型，轻链属于κ链。表2:鼠抗人cd47单克隆抗体亚型鉴定亚型odigg10.501igg2a0.95igg2b1.616igg30.161igm0.099iga0.057κ1.352λ0.047实施例6对肿瘤细胞表面cd47的检测培养mkn-45、a549、hela和raji细胞系至对数增长期后，收集2x106，加入20μg上述纯化所得抗体，4℃孵育半小时后加入fitc-山羊抗小鼠igg二抗，4℃孵育半小时后加入1xpbs洗一遍，进行流式细胞术分析，结果见图4。如图4所示，虚线代表正常小鼠igg阴性对照，实线表示纯化所得单克隆抗体，可见单克隆抗体孵育之后荧光强度有明显的右移，表示单克隆抗体对肿瘤细胞表面cd47抗原的识别。实施例7鼠源抗人cd47单克隆抗体序列的测定按照实施例1中的方法提取杂交瘤细胞株的rna并反转录成cdna。根据zhou等，nucleicacidsres.,22(5):888-9(1994)所述的scfv抗体库构建方法，设计多对引物进行pcr扩增抗体可变区，进行测序后获得了鼠源抗人cd47蛋克隆抗体的重链可变区与轻链可变区。经过比对之后确定了3个抗原决定互补区和4个框架区。其中，重链互补决定区的氨基酸序列为cdrh1:gytftdyw(seqidno:1),cdrh2:idtsdsyt(seqidno:2),cdrh3:asghtsfty(seqidno:3)；轻链互补决定区的氨基酸序列为cdrl1：qslvhsngnty(seqidno:4)，cdrl2:kvsn(seqidno:5)，cdrl3:sqsthvpwt(seqidno:6)。实施例8抗人cd47人鼠嵌合抗体的构建与亲和力分析利用pcr方法将重链可变区与轻链可变区分别pcr扩增；利用融合pc和同源重组的方法将重链可变区和轻链可变区分别插入到含有人igg轻重链恒定区的载体中；将该重组质粒进行转化扩增，同时培养293f细胞系至对数增长期，准备293f细胞转染。转染前24h传代细胞，密度5x105～6x105个/ml，293ffreestyle培养基，用细胞摇床130rpm摇动100ml体积摇瓶，置于37℃，8％co2中培养；转染前台盼蓝染色确定活细胞数目，活力必须在95％以上；使用40μm的细胞滤膜过滤细胞，得到均一的单细胞悬液；用预热的293ffreestyle培养基稀释细胞，以1x106个/ml的密度接种至新的摇瓶，体积30ml。轻轻地颠倒freestylemax试剂数次以混匀后，加入50μg质粒，并用optiprosfm培养基补齐至1.5ml，轻轻混匀。另取一新的5ml离心管，加50μlfreestylemax试剂，optiprosfm培养基补齐至1.5ml，轻轻混匀。立即将稀释的freestylemax溶液加入到质粒稀释溶液中，将枪头完全浸入到质粒溶液中，边搅拌边慢慢释放转染试剂溶液。轻轻涡旋混匀，室温静置10min以形成dna-脂质体复合物；将3mldna-脂质体溶液逐滴地加入细胞摇瓶，边加边轻轻地晃动摇瓶。继续将摇置于130rpm，37℃，8％co2培养环境中培养细胞。转染5-7天后，收集细胞悬液离心去除沉淀，上清液经过0.45μm滤膜过滤之后，加入预加载1mlproteing琼脂糖凝胶的重力柱进行纯化，纯化方式同小鼠腹腔液抗体纯化；将纯化所得的抗体用夹心法elisa进行亲和力分析，结果见表3。如表3所示，b6h12为市售的抗人cd47单克隆抗体，1x、1/10x、1/100x分别表示纯化所得的抗体原液，稀释10所得倍液体以及稀释100倍所得液体，od数值表明嵌合抗体对重组人cd47抗原具有较高的结合活性。表3:嵌合抗体对重组人cd47抗原的结合活性检测组别odpbs0.6712b6h121.65841x2.63921/10x2.59811/100x2.5495实施例9抗人cd47单克隆抗体的抗原表位鉴定针对人cd47胞外区19-139氨基酸序列共121个氨基酸进行截短体的构建：片段1包括19-79氨基酸序列，片段2包括49-109氨基酸序列，片段3包括79-139氨基酸序列；设计上下游引物，构建至pgex-4t-1载体中。待测序正确后，转化至bl21菌种进行表达：将成功构建的三种重组质粒和空载体转化至bl21中，挑单克隆摇菌过夜表达；第二天取菌液按1：100体积比接种至5mllb培养基中，继续在中培养。2.5h左右后，加入1miptg至终浓度为0.3mm，继续培养5h。然后离心收集菌体沉淀，同时取未加iptg诱导的细菌悬液离心收集菌体沉淀，各自用1ml1xpbs重悬；取40μl重悬液加入10μl5x上样缓冲液，99℃煮10分钟使其变性后，进行sds-page分析是否有目的蛋白表达，结果见图5。如图6所示，“1”、“2”、“3”、“g”分别代表片段1、2、3和gst空载体对照，“-”和“+”分别代表未加iptg诱导与iptg诱导，可见iptg成功诱导出目的蛋白和gst的表达。用蛋白免疫印迹法(westernblot)进行抗人cd47单克隆抗体的抗原表位鉴定：取过表达的带有三个截短体蛋白样品和gst空载体对照蛋白样品进行sds-page跑胶：跑胶结束后进行转膜,转膜结束后进行封闭。之后按1:1000稀释比例稀释纯化所得的抗体作为一抗，孵育上一抗后至于4℃摇床过夜；第二天将膜取出，先用1xtne洗膜液洗膜3次，每次10分钟；洗膜结束后孵育相应的二抗，采用hrp标记的山羊抗鼠igg的二抗，按照1:5000稀释比例配制后室温孵育2小时；之后再用1xtne洗膜液洗膜5分钟，1次。随后进行显影,结果见图6。如图6所示，“p”、“g”、1”、“2”、“3”分别代表cd47胞外区抗原，gst空载体对照和片段1、2、3，显影结果见到片段3有明显条带，所以该单克隆抗体识别主要识别片段3即79-139氨基酸序列。抗原表位的进一步确定：针对人cd47胞外区61-121氨基酸序列共61个氨基酸进行截短体的构建：片段1包括19-79氨基酸序列，片段2包括49-109氨基酸序列，片段3包括79-139氨基酸序列，片段4包括19-79氨基酸序列，片段5包括19-79氨基酸序列，片段6包括19-79氨基酸序列，片段7包括19-79氨基酸序列，片段8包括19-79氨基酸序列，片段9包括19-79氨基酸序列，片段10包括19-79氨基酸序列；设计上下游引物，构建至pgex-4t-1载体中。待测序正确后，转化至bl21菌种进行表达，进行sds-page分析是否有目的蛋白表达，结果见图7。如图7所示，泳道“1”至“10”分别代表片段1至10，“-”和“+”分别代表未加iptg诱导与iptg诱导，可见iptg成功诱导出目的蛋白的表达。取表达的样品进行westernblot，使用按1:1000稀释比例稀释纯化所得的抗体作为一抗，显影结果见图8。如图8所示，该单克隆抗体识别片段1至8，但不识别片段9、10，可以推定该单克隆抗体抗原表位氨基酸序列，即seqidno:11。实施例10抗人cd47单克隆抗体的抗肿瘤活性分析首先从balb/c小鼠中进行巨噬细胞的分离：取balb/c小鼠腿骨，用1xpbs冲洗骨髓收集细胞，加入终浓度为50ng/ml的m-csf进行刺激7天后诱导为骨髓来源的巨噬细胞。吞噬实验前一天铺孔1x10^5细胞至24孔板中。培养raji细胞系至对数增长期后，收集2x105细胞加入cfse染料按照终浓度为2μm标记30min后加入1xpbs洗一遍。然后加入20μg-50μg上述纯化所得抗体，37℃孵育半小时后将细胞悬液加入bmdm中，共孵育1至2小时后，弃掉体系上清，加入1xpbs洗一遍，收集培养皿中的细胞加入anti-mousef4/80-apc流式抗体4℃孵育半小时后，进行流式细胞术分析，结果见图9。如图9所示，以正常小鼠igg作阴性对照，可见单克隆抗体孵育之后巨噬细胞的在cfse绿色荧光范围内有明显的右移，表示纯化所得的单克隆抗体具有促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞能力。以上的实施例是为了说明本发明公开的实施方案，并不能理解为对本发明的限制。此外，本文所列出的各种修改以及发明中方法、组合物的变化，在不脱离本发明的范围和精神的前提下对本领域内的技术人员来说是显而易见的。虽然已结合本发明的多种具体优选实施例对本发明进行了具体的描述，但应当理解，本发明不应仅限于这些具体实施例。事实上，各种如上所述的对本领域内的技术人员来说显而易见的修改来获取发明都应包括在本发明的范围内。序列表<110>上海交通大学<120>一种抗人cd47单克隆抗体的制备及其应用<160>13<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>8<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>1glytyrthrphethrasptyrtrp15<210>2<211>8<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>2ileaspthrseraspsertyrthr15<210>3<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>3alaserglyhisthrserphethrtyr15<210>4<211>11<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>4glnserleuvalhisserasnglyasnthrtyr1510<210>5<211>4<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>5lysvalserasn1<210>6<211>9<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>6serglnserthrhisvalprotrpthr15<210>7<211>116<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>7glnvalglnleuglnglnproglyalagluleuvalmetproglyala151015servallysmetsercyslysalaserglytyrthrphethrasptyr202530trpmethistrpvallysglnargproargglnglyleuglutrpile354045glyalaileaspthrseraspsertyrthrsertyrasnglnasnphe505560lysglylysalathrleuthrvalaspgluserserserthralatyr65707580metglnleuserserleuthrsergluaspseralavaltyrtyrcys859095alaserglyhistyrserphethrtyrtrpglyglnglythrleuval100105110thrserleugln115<210>8<211>111<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>8aspvalphegluthrglnthrproleuserleuprovalserleugly151015aspglnalaserilesercysargserserglnserleuvalhisser202530asnglyasnthrtyrleuhistrptyrleuglnlysproglyglnser354045prolysleuleuiletyrlysvalserasnargpheserglyvalpro505560aspargpheserglyserglyserglythraspphethrleulysile65707580serargvalglualaalaaspleuglyvaltyrphecysserglnser859095thrhisvalprotrpthrpheglyglyglythrlysargserarg100105110<210>9<211>348<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9caggtccaactgcagcagcctggggctgagcttgtgatgcctggggcttcagtgaagatg60tcctgcaaggcttctggctacacattcactgactactggatgcactgggtgaagcagagg120cctagacaaggccttgagtggatcggagcgattgatacttctgatagttatactagctac180aatcaaaacttcaagggcaaggccacattgactgtagacgaatcctccagcacagcctac240atgcagctcagcagcctgacatctgaggactctgcggtctattactgtgcaagtggccat300tactcctttacttactggggccaagggactctggtcacgtctctgcaa348<210>10<211>334<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gatgttttcgagacccaaactccactctccctgcctgtcagtcttggagatcaagcctcc60atctcttgcagatctagtcagagccttgtacacagtaatggaaatacctatttacattgg120tacctgcagaagccaggccagtctccaaagctcctgatctacaaagtttccaaccgattt180tctggggtcccagacaggttcagtggcagtggatcagggacagatttcacactcaagatc240agcagagtggaggctgcggatctgggagtttatttctgctctcaaagtacacatgttccg300tggacgttcggtggaggcaccaagcgatcacgtt334<210>11<211>12<212>prt<213>人工序列(artificialsequence)<400>11leulysglyaspalaserleulysmetasplysser1510<210>12<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12gatatcatatgcagctactatttaataaaacaaaa35<210>13<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13gatatctcgagttatggagaaaaccatgaaacaac35当前第1页12