一种2-亚胺苯并咪唑类化合物及医药用途的制作方法

本发明涉及药物化学和药物治疗学领域，具体涉及一种2-亚胺苯并咪唑类化合物，本发明还涉及该类化合物或其药学上可接受的盐在制备与白血病有关的药物方面的应用，特别是在制备μ阿片受体拮抗剂药物方面的应用。

背景技术：

白血病(leukemia)是一类发生于造血器官，由于血液和骨髓中白细胞及其前体细胞的增殖和发育异常而引发的一种克隆性恶性肿瘤疾病。其临床症状表现为出血、贫血、感染和器官积聚和浸润现象。据相关统计，2013-2014年，白血病病发率约在67.4/10万人，好发于儿童和青年，死亡率高达4.68/10万人，在我国各年龄组恶性肿瘤的死亡率中分别占第6位(男性)和第8位(女性)，在儿童及35岁以下成人的死亡率中占第一位。尽管目前针对白血病的治疗已有一些成就，通过合理的综合性治疗，白血病的治疗现状及预后得到极大的改观，相当多的患者可以获得治愈或保持病情长期稳定。但是在完全治疗白血病方面仍面临很多障碍。例如，患者体内具有干性的白血病细胞(即白血病干细胞)无法通过常规化疗被完全清除，并且白血病患者往往会对常规的化疗产生耐受性，进展成难治性白血病。难治性白血病的化疗敏感性极差，且容易复发，是白血病临床治疗难题。因此，探讨研发新的有效治疗药物已成为当下亟待解决的问题。

阿片类药物是临床用药所关注的重要内容。已有研究证实阿片类药物除了镇痛作用之外，对肿瘤细胞，尤其是吗啡能够对细胞免疫和体液免疫都产生抑制作用。经国外实验研究，阿片类药物的用量可以影响肺癌、前列腺癌和乳腺癌患者手术后的肿瘤复发率，对心脑器官发挥保护效应。阿片类药物有μ受体、κ受体、δ和孤啡肽受体，临床阿片类药物的作用机制及临床应用是当今研究的热点。而阿片类药物中的μ阿片受体拮抗剂(μ-opioidreceptor，mor)可能影响白血病的复发是最近关注的一个课题。已经临床实验表明相关浓度的阿片类药物可以引起内皮细胞增殖和迁移，选择性外周μ阿片受体拮抗剂甲基纳曲酮(mntx)抑制血管生成，这是体内肿瘤生长所需的过程。结构依赖性μ阿片受体活性是癌症阿片镇痛效果的重要因素。

前期有结果表明了μ阿片受体拮抗剂在乳腺癌和肺癌治疗中发挥了重要作用，且有数据表明阿片类药物可能对肺癌的发展有直接影响。鉴于此，有必要探索研究μ受体拮抗剂对白血病的影响，将其作为治疗白血病的新型药物靶点，该方面的研究仍存在非常大的临床空白；μ阿片受体拮抗剂对白血病的药物作用的探索任重而道远，因此我们对于μ受体拮抗剂的开发研究势在必行。

技术实现要素：

本发明的目的是在现有技术的基础上，提供一类2-亚胺苯并咪唑类化合物，该类化合物对白血病癌细胞k562和hl-60具有明显的增殖抑制能力，促进癌细胞k562的细胞凋亡现象，对μ受体(oprm1)有明显的拮抗作用，且该拮抗作用呈现出浓度依赖性。

本发明的另一目是提供了一种药物组合物，其以本发明所述的化合物或其药学上可接受的盐、光学异构体或溶剂合物为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的辅料。

本发明的第三个目的是提供一种上述2-亚胺苯并咪唑类化合物在医药方面的用途。

本发明的技术方案如下：

式i或式ii所示的2-亚胺苯并咪唑类化合物或其药学上可接受的盐，

其中，

r¹、r²或r³分别独立地代表r⁴-x-r⁵；

r⁴代表c1-c6亚烷基或取代c1-c6亚烷基；

x代表氧、共价键或羰基；

r⁵代表氢、氰基、硝基、羟基、卤素、羧基、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环戊烷、呋喃、吡咯、吡啶、噻唑、环己烷、1,4-二氧六环、哌啶、吗啉、吲哚、苯基、萘基、联苯基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基；

取代c1-c6亚烷基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：c1-c4烷氧基、c1-c4烷基、氰基、硝基、羟基或卤素。

在一种优选方案中，r¹代表r⁶-o-r⁷、r⁸-r⁹或r¹⁰-co-r¹¹；r⁶、r⁸或r¹⁰分别独立地代表c1-c4亚烷基或取代c1-c4亚烷基；r⁷、r⁹或r¹¹分别独立地代表氢、羟基、卤素、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环戊烷、呋喃、吡咯、吡啶、噻唑、环己烷、1,4-二氧六环、哌啶、吗啉、吲哚、苯基、萘基、联苯基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基；其中，取代c1-c4亚烷基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：c1-c2烷氧基、c1-c4烷基、氰基、硝基、羟基或卤素。

r²代表r⁶-o-r⁷、r⁸-r⁹或r¹⁰-co-r¹¹；r⁶、r⁸或r¹⁰分别独立地代表c1-c4亚烷基或取代c1-c4亚烷基；r⁷、r⁹或r¹¹分别独立地代表氢、羟基、卤素、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环戊烷、呋喃、吡咯、吡啶、噻唑、环己烷、1,4-二氧六环、哌啶、吗啉、吲哚、苯基、萘基、联苯基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基；其中，取代c1-c4亚烷基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：c1-c2烷氧基、c1-c4烷基、氰基、硝基、羟基或卤素。

r³代表r⁶-o-r⁷、r⁸-r⁹或r¹⁰-co-r¹¹；r⁶、r⁸或r¹⁰分别独立地代表c1-c4亚烷基或取代c1-c4亚烷基；r⁷、r⁹或r¹¹分别独立地代表氢、羟基、卤素、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环戊烷、呋喃、吡咯、吡啶、噻唑、环己烷、1,4-二氧六环、哌啶、吗啉、吲哚、苯基、萘基、联苯基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基；其中，取代c1-c4亚烷基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：c1-c2烷氧基、c1-c4烷基、氰基、硝基、羟基或卤素。

在进一步的优选方案中，r¹代表r⁶-o-r⁷、r⁸-r⁹或r¹⁰-co-r¹¹；r⁶、r⁸或r¹⁰分别独立地代表c1-c4亚烷基或取代c1-c4亚烷基；r⁷、r⁹或r¹¹分别独立地代表氢、羟基、氟、氯、溴、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环己烷、1,4-二氧六环、哌啶、吗啉、吲哚、苯基、萘基、联苯基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基；其中，取代c1-c4亚烷基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、c1-c4烷基、羟基、氟、氯或溴。

r²代表r⁶-o-r⁷、r⁸-r⁹或r¹⁰-co-r¹¹；r⁶、r⁸或r¹⁰分别独立地代表c1-c4亚烷基或取代c1-c4亚烷基；r⁷、r⁹或r¹¹分别独立地代表氢、羟基、氟、氯、溴、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环己烷、1,4-二氧六环、哌啶、吗啉、吲哚、苯基、萘基、联苯基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基；其中，取代c1-c4亚烷基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、c1-c4烷基、羟基、氟、氯或溴。

r³代表r⁶-o-r⁷、r⁸-r⁹或r¹⁰-co-r¹¹；r⁶、r⁸或r¹⁰分别独立地代表c1-c4亚烷基或取代c1-c4亚烷基；r⁷、r⁹或r¹¹分别独立地代表氢、羟基、氟、氯、溴、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环己烷、1,4-二氧六环、哌啶、吗啉、吲哚、苯基、萘基、联苯基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基；其中，取代c1-c4亚烷基、取代苯基、取代萘基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、c1-c4烷基、羟基、氟、氯或溴。

在更进一步的优选方案中，r¹、r²或r³分别独立地代表下述基团：

r¹²代表环己烷、1,4-二氧六环、哌啶、吗啉、吲哚、苯基、萘基、联苯基、取代苯基、取代萘基、取代联苯基；其中，取代苯基、取代萘基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、c1-c4烷基、羟基、氟、氯或溴。

r¹³代表环己烷、1,4-二氧六环、哌啶、吗啉、吲哚、苯基、萘基、联苯基、取代苯基、取代萘基、取代联苯基；其中，取代苯基、取代萘基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、c1-c4烷基、羟基、氟、氯或溴。

进一步的，r¹²代表环己烷、哌啶、吗啉、苯基、萘基、联苯基、取代苯基、取代萘基、取代联苯基；其中，取代苯基、取代萘基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、甲基、乙基、叔丁基、羟基、氟、氯或溴。

r¹³代表环己烷、哌啶、吗啉、苯基、萘基、联苯基、取代苯基、取代萘基、取代联苯基；其中，取代苯基、取代萘基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、甲基、乙基、叔丁基、羟基、氟、氯或溴。

在另一种更进一步的优选方案中，r¹代表r⁸-r⁹；r⁸代表c1-c4亚烷基；r⁹代表羟基、氯、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环己烷、哌啶、吗啉、苯基、取代苯基或取代联苯基；其中，取代苯基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、甲基、乙基、叔丁基、羟基、氟、氯或溴。

r²代表r⁸-r⁹；r⁸代表c1-c4亚烷基；r⁹代表羟基、氯、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环己烷、哌啶、吗啉、苯基、取代苯基或取代联苯基；其中，取代苯基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、甲基、乙基、叔丁基、羟基、氟、氯或溴。

r³代表r⁸-r⁹；r⁸代表c1-c4亚烷基；r⁹代表羟基、氯、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环己烷、哌啶、吗啉、苯基、取代苯基或取代联苯基；其中，取代苯基或取代联苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、甲基、乙基、叔丁基、羟基、氟、氯或溴。

进一步的，r¹代表r⁸-r⁹；r⁸代表c1-c2亚烷基；r⁹代表羟基、氯、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环己烷、哌啶、吗啉、苯基或取代苯基；其中，取代苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、甲基、乙基、叔丁基、羟基或氯。

r²代表r⁸-r⁹；r⁸代表c1-c2亚烷基；r⁹代表羟基、氯、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环己烷、哌啶、吗啉、苯基或取代苯基；其中，取代苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、甲基、乙基、叔丁基、羟基或氯。

r³代表r⁸-r⁹；r⁸代表c1-c2亚烷基；r⁹代表羟基、氯、乙烯基、乙炔基、c1-c4烷基、环己烷、哌啶、吗啉、苯基或取代苯基；其中，取代苯基可任意的由下述取代基单取代或多取代：甲氧基、乙氧基、甲基、乙基、叔丁基、羟基或氯。

具体而言，本发明提到的化合物或其药学上可接受的盐，其中述化合物选自：

本发明提供了一种药物组合物，它以本发明的化合物或其药学上可接受的盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。

本发明的化合物或其药学上可接受的盐可应用于制备与白血病有关的药物方面，特别是在制备μ阿片受体拮抗剂药物方面。

除非另外说明，在说明书和权利要求中使用的以下术语具有下面讨论的含义：

“药学上可接受的盐”表示保留母体化合物的生物有效性和性质的那些盐。这类盐包括：

(1)与酸成盐，通过母体化合物的游离碱与无机酸或有机酸的反应而得，无机酸包括盐酸、氢溴酸、硝酸、磷酸、偏磷酸、硫酸、亚硫酸和高氯酸等，有机酸包括乙酸、三氟乙酸、丙酸、丙烯酸、己酸、环戊烷丙酸、羟乙酸、丙酮酸、草酸、(d)或(l)苹果酸、富马酸、马来酸、抗坏血酸、樟脑酸、苯甲酸、羟基苯甲酸、γ-羟基丁酸、甲氧基苯甲酸、邻苯二甲酸、甲磺酸、乙磺酸、萘-1-磺酸、萘-2-磺酸、对甲苯磺酸、水杨酸、酒石酸、柠檬酸、乳酸、肉桂酸、十二烷基硫酸、葡糖酸、谷氨酸、天冬氨酸、硬脂酸、扁桃酸、琥珀酸、戊二酸或丙二酸等。

(2)存在于母体化合物中的酸性质子被金属离子代替或者与有机碱配位化合所生成的盐，金属例子例如碱金属离子、碱土金属离子或铝离子，有机碱例如乙醇胺、二乙醇胺、三乙醇胺、氨丁三醇、n-甲基葡糖胺、奎宁等。

“药物组合物”指将本发明中的化合物中的一个或多个或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药与别的化学成分，例如药学上可接受的载体，混合。药物组合物的目的是促进给药给动物的过程。

“药用载体”或“药学上可接受的载体”指的是对有机体不引起明显的刺激性和不干扰所给予化合物的生物活性和性质的药物组合物中的非活性成分，例如但不限于：碳酸钙、磷酸钙、各种糖(例如乳糖、甘露醇等)、淀粉、环糊精、硬脂酸镁、纤维素、碳酸镁、丙烯酸聚合物或甲基丙烯酸聚合物、凝胶、水、聚乙二醇、丙二醇、乙二醇、蓖麻油或氢化蓖麻油或多乙氧基氢化蓖麻油、芝麻油、玉米油、花生油等。

“烷基”表示1-20个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“1-20”，是指该基团，此时为烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括20个碳原子)。更优选的是，烷基是有1-10个碳原子的中等大小的烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、戊基等。最好是，烷基为有1-8或1-6个碳原子的低级烷基，例如甲基、乙基、丙基、2-丙基、正丁基、异丁基或叔丁基等。烷基可以是取代的或未取代的。当是取代的烷基时，该取代基优选是一或多个，更优选1-3个，最优选1或2个取代基。

“亚烷基”表示与两个基团相连接的1-20个碳原子的饱和的脂烃基，包括直链和支链基团(本申请书中提到的数字范围，例如“1-20”，是指该基团，此时为亚烷基，可以含1个碳原子、2个碳原子、3个碳原子等，直至包括20个碳原子)。更优选的是，亚烷基是有1-10个碳原子的中等大小的亚烷基，例如亚甲基、亚乙基、亚丙基、亚2-丙基、亚正丁基、亚叔丁基、戊基等。最好是，烷基为有1-8或1-6个碳原子的低级亚烷基。亚烷基可以是取代的或未取代的。当是取代的亚烷基时，该取代基优选是一或多个，更优选1-3个，最优选1或2个取代基。

“羟基”表示-oh基团。

“硝基”表示-no2基团。

“氰基”表示-cn基团。

“羧基”表示-cooh基团。

“烷氧基”表示-o-(未取代的烷基)和-o-(未取代的环烷基)。代表性实例包括但不限于甲氧基、乙氧基、丙氧基、丁氧基、环丙氧基、环丁氧基、环戊氧基、环己氧基等。

“卤素”表示氟、氯、溴或碘，优选为氟或氯。

采用本发明的技术方案，优势如下:

本发明提供一类2-亚胺苯并咪唑类化合物，该类化合物对白血病细胞k562和hl-60具有明显的增殖抑制能力，促进癌细胞k562的细胞凋亡现象，对μ受体(oprm1)有明显的拮抗作用，且该拮抗作用呈现出浓度依赖性。

附图说明

图1是本发明中不同浓度下化合物n3对白血病细胞k562的细胞凋亡实验结果；

图2是本发明中不同浓度下化合物n3对k562的细胞凋亡率实验结果；

图3是本发明中化合物n3对μ受体(oprm1)蛋白的拮抗作用实验结果。

具体实施方式

通过以下实施例对本发明的2-亚胺苯并咪唑类化合物作进一步的说明，但这些实施例不对本发明构成任何限制。

实验方法与结果

一、细胞活力实验

实验原理：试剂中含有wst-8，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯(1-methoxypms)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(formazandye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。

实验步骤：

1.铺板：取对数生长期的mm细胞系接种96孔板，每孔细胞悬液100μl，细胞数为1×10⁴/孔，空白对照组只加100μl含10％fbs完全培养基rpmi-1640，每组设置3～5个复孔。

2.不同浓度梯度小分子化合物处理的骨髓瘤细胞系置于细胞培养箱(37℃、5％co2)培养，24h后每孔加入5μlcck-8溶液，继续培养3小时后酶标仪检测；

3.检测：将空白对照组调零，检测450nm波长下的吸光度(od值)，重复2-3次，取平均值，绘制细胞活力柱状图，计算给药化合物的ic50值。

实验结果：如下表1所示，本发明中的化合物n3、n7、n11、n12、n13和n15对白血病细胞k562和hl-60具有明显的增殖抑制能力，尤其是化合物n11、n12和n13的ic50值甚至是nm级别。本发明中的化合物对k562的细胞增殖能力稍强于hl-60细胞系。

表1本发明的16个化合物对白血病癌细胞k562和hl-60增殖的抑制能力(ic50值)

二、细胞凋亡检测

实验原理：在正常细胞中，磷脂酰丝氨酸(ps)只分布在细胞膜脂质双层的内侧，而在细胞凋亡早期，细胞膜中的磷脂酰丝氨酸(ps)由脂膜内侧翻向外侧。annexinv是一种分子量为35～36kd的ca²⁺依赖性磷脂结合蛋白，与磷脂酰丝氨酸有高度亲和力，故可通过细胞外侧暴露的磷脂酰丝氨酸与凋亡早期细胞的胞膜结合。因此annexinv被作为检测细胞早期凋亡的灵敏指标之一。

实验步骤：

1.铺板：取对数期生长的特定肿瘤细胞，以1×10⁶/孔接种六孔板，将其置于细胞培养箱(37℃、5％co2)培养24h；

2.次日，以不同浓度药物加入到六孔板中，处理48h；

3.收集细胞：分别将每种细胞系的细胞置于6个1ml离心管，离心(1000rpm，5min)收集，pbs离心(1000rpm；5min)反复洗涤2次；

4.染色：bindingbuffer重悬细胞，调整细胞密度为1～5×10⁶/ml，取100μl细胞悬液，加5μlannexinv，室温避光孵育15min后，用bindingbuffer洗细胞1次，用200μlbindingbuffer重悬细胞，加入5μlpi混匀bindingbuffer重悬细胞，注意加入5μlpi混匀，要在避光条件下进行；

5.上机检测：在双变量流式细胞仪的散点图上，左下象限为正常细胞(annexinv-/pi-)；右下象限为早期凋亡细胞(annexinv+/pi-)；右上象限为晚期凋亡细胞(annexinv+/pi+)，重复3次，取平均值。

实验结果：本发明中的化合物有较好的促进白血病细胞k562的细胞凋亡现象，且存在浓度依赖性。例如n1、n3、n5、n7、n9、n11、n12、n13和n15。图1和图2所示，本发明中的化合物n3有较好的促进白血病细胞k562的细胞凋亡现象，且存在浓度依赖性。化合物n3在5μm的浓度时表现出明显的促凋亡现象。

三、蛋白免疫印迹实验

实验原理：通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。实验步骤：

1.配制好sds-page胶，铺板收集细胞悬液，pbs1000rpm，5min离心洗涤两遍，根据细胞的数量加入不同体积的ripa裂解液，裂解液至少30μl，冰上裂解2min，漩涡器涡旋1min，交替进行40min，4℃、5000rpm离心15min，收集上清液，加入等体积2×sds上样缓冲液，煮沸10min，-20℃保存；

2.按照顺序使用微量上样器小心加入样品(每孔50μg蛋白总蛋白)，恒压80v，待蛋白ladder稍分开，调整电压120v到溴酚蓝跑到凝胶底部停止，关闭电源，卸下玻璃板，取出胶；

3.根据蛋白marker大小及蛋白分子量的大小裁剪膜，将pvdf膜和滤纸按照从上往下的顺序放置于电转盒，恒压100v，持续90min。

4.配制蛋白封闭液，将蛋白印迹过的pvdf膜正面朝下置于封闭液中，封闭60min。

5.按照1:5000配制抗体β-actin体积3ml，1:1000比例配制oprm1单抗3ml,置于摇床上缓慢摇动室温孵育1h，4℃过夜孵育；

6.次日上午回收一抗，tbst洗涤3遍，每次5min，按照1:5000比例使用tbst配制辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗鼠抗体3ml；同时按照1:1000比例tbst稀释下的辣根过氧化物酶(hrp)标记的羊抗兔抗体3ml，室温孵育1h；

7.tbst洗膜，洗涤3次，每次5min，滤纸将pvdf膜表面水分吸干净，置于保鲜膜上，ecl底物混合均匀滴加于pvdf膜上，imagequantlas4000minisystem成像仪拍照保存。

实验结果：本发明中的化合物对μ受体(oprm1)有明显的拮抗作用，且该拮抗作用呈现出浓度依赖性。例如n1、n3、n5、n7、n9、n11、n12、n13和n15。如图3所示，本发明中的化合物n3对μ受体(oprm1)有明显的拮抗作用，且该拮抗作用呈现出浓度依赖性。化合物n3在5μm的浓度时体现出明显地oprm1拮抗作用。本发明中的化合物可能作为μ受体拮抗剂进而发挥明显的抗白血病的作用。