本发明属于有机化学合成与医药化工领域，具体涉及一种结构新颖的单分散六臂聚乙二醇修饰的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐的制备与应用。
背景技术：
骨质疏松症是一种以骨量低下，骨微结构损坏，导致骨脆性增加，易发生骨折为特征的全身性疾病初次发生骨折的患者，未来数年内再次发生骨折的风险增加3-5倍。骨质疏松性骨折与传统骨折大不相同，骨质疏松性骨折的重要诱因是局部骨强度减低，所以增强局部骨强度是预防骨质疏松性骨折的根本。现有的骨质疏松治疗最终目的是增强全身骨强度，不能对易骨折部位进行局部增强，利用缓释材料包裹抗骨质疏松药物进行局部缓释治疗将很好地解决该问题。双磷酸盐是目前公认的一线预防骨质疏松的药物，此类药物共同的药理作用机制是通过抑制破骨细胞的活性来减慢骨转换速度，进一步增加骨密度来减少骨折的风险。阿仑膦酸钠是第3代双磷酸盐类药物，是目前国际防治骨质疏松症的一线药物，有研究证明规律服药后可以明显增加骨密度，并减少局部骨折的风险。阿仑膦酸钠的主要作用机制是与附着于骨重吸收表面的羟基磷灰石结合，通过抑制破骨细胞活性并促进破骨细胞凋零，进一步增加骨密度。但是阿仑膦酸钠的口服利用率较低，有研究统计为0.7％，并且需要长期服药，患者药物依从性差，有发生消化道溃疡的危险，最主要的是长期服用可引起全身骨转换的过度抑制。
唑来膦酸是一种对骨具有特异性的双磷酸化合物，它能抑制破骨细胞活性而降低骨吸收。其主要作用机制是：通过抑制破骨细胞的活化及其增生来抑制骨质吸收，减少骨基质生长因子的释放；唑来膦酸类似焦磷酸盐的生物活性骨架对骨具有强烈的亲和力，特别是在骨骼代谢率高的部位，易于被具有破骨作用的破骨细胞摄取，因此在骨内十分稳定，作用持久；唑来膦酸具有抑制破骨细胞吸收骨的能力，通过降低破骨细胞对骨骼表面的吸附作用，抑制其生物活性，减少破骨细胞寿命，从而抑制破骨细胞对骨小梁的溶解和破坏，抑制溶骨性病变、降低骨吸收、缓解疼痛；通过抑制甲醛戊酸途径以及干扰细胞周期，唑来膦酸还可以诱导破骨细胞和其前体细胞的凋亡过程，达到抗骨质吸收的目的。体外实验证明，唑来膦酸也可以作用于人类成骨细胞(osteoblast)促进骨的合成代谢，并能影响成骨细胞前体的分化与增殖，促进骨的再生与形成。第3代双膦酸类药物——唑来膦酸是目前较为高效的抗骨吸收药物，通过短时(15min)静脉输注给药，患者有良好的耐受性，最大程度保证了药物的依从性和持续性，能够有效缓解骨痛，并逐渐增加骨密度(bmd)，进而降低骨折发生的风险。
静脉输注唑来膦酸后，常见的不良反应为类似流感的症状(如发热、关节痛、肌痛和骨痛)、疲乏、胃肠道反应、贫血、体虚、呼吸困难、水肿、心动过缓、味觉倒错、口渴等，大多为轻中度反应，一般给予支持治疗即可。使用唑来膦酸有可能发生肾功能损害，这与双膦酸盐的快速肾排泄作用相关。近年来，也有报道其他的不良反应，如对颌骨骨质的影响、全身皮疹、药物性肝损伤等。
现有技术中，中国专利申请号(200780041801.0)提到了唑来膦酸联合给药的方案；
现有技术中，中国专利申请号(200680036080.x)公开了peg作为载体与唑来膦酸物理混合给药；
现有技术中，中国专利申请号(200980122359.3)公开了唑来膦酸和peg衍生物的混合给药；
上述技术方案均没有提到将单分散六臂聚乙二醇修饰的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐,用于降低唑来膦酸的副作用。
技术实现要素：
鉴于上述情况，为提高唑来膦酸的安全性，减少不良反应，同时综合利用阿伦磷酸钠和唑来膦酸的优点，本发明的目的在于提供一种新型的水溶性的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐，降低其在临床应用中的副作用。
本发明的技术方案可以通过以下技术措施来实现：
—种单分散六臂聚乙二醇修饰的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐，其结构如结构通式i所示：
其中n为12-47之间的整数,
所述通式i所示的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐的合成方法包括以下步骤：
1)使单分散聚乙二醇双对甲苯磺酸酯与氨丁三醇反应得到单分散六臂聚乙二醇衍生物；2)所得到的单分散六臂聚乙二醇衍生物在有机溶剂中与n,n'-琥珀酰亚胺基碳酸酯反应得到六臂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。3)往六臂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯中加入阿伦磷酸钠、碱、溶剂，在50℃条件下反应得到六臂聚乙二醇阿伦磷酸钠衍生物。4)往六臂聚乙二醇阿伦磷酸钠衍生物的有机溶剂中加入唑来膦酸搅拌数小时即可得到所示通式i的六臂聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐。
优选地，所述的碱为4-二甲氨基吡啶、哌啶、三甲胺、n，n-二异丙基乙胺、碳酸氢钠、磷酸氢二钾。
优选地，所述的溶剂为丙酮、四氢呋喃、乙腈、n，n-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、n，n-二甲基苯胺。
上述阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐在作为经静脉或静脉外途径对动物或人产生抗骨质疏松药物中的应用。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将进一步阐述本发明的具体实施例。
实施例1六臂十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐的制备
1.单分散六臂十四(n＝12)聚乙二醇衍生物的合成。
将1mmol单分散十四聚乙二醇双对甲苯磺酸酯充分溶于乙腈溶剂中，同时加入碱碳酸氢钠2mmol,常温搅拌6小时，往反应体系中加入4mmol的氨丁三醇反应，加热至回流反应16小时，tlc监测反应进程，反应结束后，通过柱层析纯化得到单分散六臂聚乙二醇衍生物；1hnmr(400mhz,chloroform)δ3.58(m,12h)3.56-3.52(d,j＝5.0hz,48h),3.49(s,4h),2.76(s,4h)。
2.六臂十四(n＝12)聚乙二醇琥珀酰亚胺酯的合成。
1mmol单分散六臂十四聚乙二醇衍生物充分溶解于四氢呋喃中，往反应中加入10mmol的n,n'-琥珀酰亚胺基碳酸酯，常温反应12小时，反应液浓缩，粗品通过柱层析得到六臂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。1hnmr(400mhz,chloroform)δ4.28(m,12h),3.56-3.49(d,j＝5.2hz,52h),3.49(s,4h),2.76(s,24h)。2.72(m,4h).
3.六臂十四(n＝12)聚乙二醇阿伦磷酸钠衍生物的合成。
往1mmol六臂十四聚乙二醇琥珀酰亚胺酯的dmso溶液中加入10mmol的阿伦磷酸钠，搅拌十分钟后，往反应液中加入4mmol有机碱哌啶，在50℃条件下反应24小时。反应结束，粗品通过柱层析和重结晶纯化得到六臂聚乙二醇阿伦磷酸钠衍生物。1hnmr(400mhz,chloroform)δ8.0(s,6h,nh),4.12(m,12h,ch2),3.56-3.49(d,j＝5.2hz,52h),3.49(s,4h),2.96(s,12h,ch2),2.72(m,4h).1.55-1.5(m,24h,ch2)
4.六臂十四(n＝12)聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐的制备。
将1mmol六臂十四聚乙二醇阿伦磷酸钠衍生物溶于50ml水中,往反应体系中加入6mmol的唑来膦酸搅拌12小时，反应结束后，用二氯甲烷萃取水相，有机相用蒸馏水充分洗涤，即可得到六臂聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐。1hnmr(400mhz,chloroform)δ7.54(s,6h,ch＝ch),7.01-6.97(m,12h,)4.12(m,12h,ch2),3.90(m,12h,ch2),3.56-3.49(d,j＝5.2hz,52h),2.96(m,12h,ch2),2.72(m,4h).1.55-1.5(m,24h,ch2)
实施例2六臂二十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐的制备
1.单分散六臂二十四(n＝22)聚乙二醇衍生物的合成。
将1mmol单分散二十四聚乙二醇双对甲苯磺酸酯充分溶于丙酮溶剂中，同时加入碱磷酸氢二钾2mmol,常温搅拌6小时，往反应体系中加入4mmol的氨丁三醇反应，加热至回流反应16小时，tlc监测反应进程，反应结束后，通过柱层析纯化得到单分散六臂聚乙二醇衍生物；1hnmr(400mhz,chloroform)δ3.59(m,12h)3.56-3.52(d,j＝5.0hz,88h),3.50(s,4h),2.78(s,4h)。
2.六臂二十四(n＝22)聚乙二醇琥珀酰亚胺酯的合成。
1mmol单分散六臂二十四聚乙二醇衍生物充分溶解于乙腈中，往反应中加入10mmol的n,n'-琥珀酰亚胺基碳酸酯，常温反应12小时，反应液浓缩，粗品通过柱层析得到六臂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。1hnmr(400mhz,chloroform)δ4.28(m,12h),3.56-3.49(d,j＝5.2hz,88h),3.45(s,4h),2.77(s,24h)。2.70(m,4h).
3.六臂二十四(n＝22)聚乙二醇阿伦磷酸钠衍生物的合成。
往1mmol六臂四十八聚乙二醇琥珀酰亚胺酯的dmso溶液中加入10mmol的阿伦磷酸钠，搅拌十分钟后，往反应液中加入4mmol有机碱dmap，在50℃条件下反应24小时。反应结束，粗品通过柱层析和重结晶纯化得到六臂聚乙二醇阿伦磷酸钠衍生物。1hnmr(400mhz,chloroform)δ8.0(s,6h,nh),4.12(m,12h,ch2),3.58-3.50(d,j＝5.2hz,88h),3.48(s,4h),2.98(s,12h,ch2),2.73(m,4h).1.56-1.52(m,24h,ch2)
4.六臂二十四(n＝22)聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐的制备。
将1mmol六臂四十八聚乙二醇阿伦磷酸钠衍生物溶于50ml水中,往反应体系中加入6mmol的唑来膦酸搅拌12小时，反应结束后，用二氯甲烷萃取水相，有机相用蒸馏水充分洗涤，即可得到六臂聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐。1hnmr(400mhz,chloroform)δ7.54(s,6h,ch＝ch),7.01-6.97(m,12h,)4.12(m,12h,ch2),3.90(m,12h,ch2),3.56-3.49(d,j＝5.2hz,88h),2.98(m,12h,ch2),2.73(m,4h).1.55-1.51(m,24h,ch2)
实施例3六臂四十八聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐的制备单分散六臂四十八(n＝46)聚乙二醇衍生物的合成。
将1mmol单分散四十八聚乙二醇双对甲苯磺酸酯充分溶于dmf溶剂中，同时加入碱n，n-二异丙基乙胺2mmol,常温搅拌6小时，往反应体系中加入4mmol的氨丁三醇反应，加热至回流反应16小时，tlc监测反应进程，反应结束后，通过柱层析纯化得到单分散六臂聚乙二醇衍生物；1hnmr(400mhz,chloroform)δ3.59(m,12h)3.56-3.52(d,j＝5.0hz,184h),3.50(s,4h),2.78(s,4h)。
六臂四十八(n＝46)聚乙二醇琥珀酰亚胺酯的合成。
1mmol单分散六臂四十八聚乙二醇衍生物充分溶解于dmf中，往反应中加入10mmol的n,n'-琥珀酰亚胺基碳酸酯，常温反应12小时，反应液浓缩，粗品通过柱层析得到六臂聚乙二醇琥珀酰亚胺酯。1hnmr(400mhz,chloroform)δ4.29(m,12h),3.58-3.50(d,j＝5.2hz,184h),3.51(s,4h),2.78(s,24h),2.73(m,4h).
3.六臂四十八(n＝46)聚乙二醇阿伦磷酸钠衍生物的合成。
往1mmol六臂四十八聚乙二醇琥珀酰亚胺酯的dmso溶液中加入10mmol的阿伦磷酸钠，搅拌十分钟后，往反应液中加入4mmol有机碱哌啶，在50℃条件下反应24小时。反应结束，粗品通过柱层析和重结晶纯化得到六臂聚乙二醇阿伦磷酸钠衍生物。1hnmr(400mhz,chloroform)δ8.0(s,6h,nh),4.13(m,12h,ch2),3.58-3.50(d,j＝5.2hz,52h),3.50(s,4h),2.98(s,12h,ch2),2.73(m,4h).1.56-1.51(m,24h,ch2)
4.六臂四十八(n＝46)聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐的制备。
将1mmol六臂四十八聚乙二醇阿伦磷酸钠衍生物溶于50ml水中,往反应体系中加入6mmol的唑来膦酸搅拌12小时，反应结束后，用二氯甲烷萃取水相，有机相用蒸馏水充分洗涤，即可得到六臂聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐。1hnmr(400mhz,chloroform)δ7.55(s,6h,ch＝ch),7.02-6.97(m,12h,)4.14(m,12h,ch2),3.90(m,12h,ch2),3.56-3.49(d,j＝5.2hz,184h),2.98(m,12h,ch2),2.73(m,4h).1.55-1.51(m,24h,ch2)
实施例3溶解度测定实验
1.1造模与分组
将50只大鼠随机分成4组，即对照组、模型组、阿伦磷酸钠组10mg/(kg.2周)、唑来膦酸组10mg/(kg.1周)，二十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐10mg/(kg.2周)，每组10只。后3组用10％水合氯醛溶液按0.3ml/100g体重腹腔注射麻醉后，取背侧切口，纵行切开1cm，于深部脂肪层中可发现粉红色卵巢，结扎并切断子宫角，摘除卵巢。对照组仅切除周围少量脂肪组织。术后分笼饲养。
1.2药物干预
造模7d后，阿伦磷酸钠组折算大鼠等效给药量为14mg/kg，唑来膦酸组折算大鼠等效给药量为12mg/kg,阿伦磷酸钠组每两周灌胃1次，唑来膦酸组每周灌胃1次。二十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐每两周灌胃1次。对照组、模型组灌服10ml/kg生理盐水。给药后每周称量体重1次，根据体重调整受试药物剂量。
1.3样本收集
连续给药12周，麻醉后，酒精浸泡下半身消毒，仔细分离左侧股骨，彻底剔除软组织后，37度生理盐水纱布包裹后放入ep管中，-20度冰箱保存，检测前取出解冻。
1.4指标检测
体重测量测量治疗前以及治疗期间体重变化。离体骨密度测量应用小动物专用双能x线骨密度仪(hologic)对各组大鼠左侧股骨进行离体骨密度测量。
离体股骨力学性能检测测量骨密度后，左侧股骨测量骨密度结束后，样本用温生理盐水包裹，进行左侧股骨干三点弯实验检测股骨皮质骨的力学性能。
1.5结果
治疗12周后，模型组的最大载荷、屈服载荷、刚度均低于对照组(均为p<0.01)。阿伦磷酸钠组和唑来膦酸组以及二十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐组最大载荷(p＝0.048和p＝0.050以及p＝0.052)、屈服载荷(p＝0.011和p＝0.016以及p＝0.015)、刚度(p＝0.046和p＝0.044以及p＝0.042)高于模型组。
可以看出，对照组大鼠体重变化平稳，模型组和二十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐组一直增长，阿伦磷酸钠组和唑来膦酸组第12周开始下降。在各组的bmd比较中发现，治疗12周后，模型组的总bmd值低于对照组，对照组、二十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐组总bmd高于模型组，对照组、二十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐组总bmd之间无统计学差异。说明去势大鼠bmd下降，二十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐组可提高去势大鼠bmd。二十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐组对提高股骨干bmd更有优势。在各组的股骨力学性能比较中发现，最大载荷是产生骨折时的力，屈服载荷是骨产生永久性损伤时的力，刚度是载荷和位移的比例，治疗12周后，模型组的最大载荷、屈服载荷、刚度均低于对照组。二十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐组最大载荷、屈服载荷、刚度均高于模型组。对照组、二十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐组无统计学差异。说明去势大鼠股骨力学性能下降，二十四聚乙二醇碳酸酯型的阿伦磷酸钠的唑来膦酸盐组提高去势大鼠力学性能。