基于萘酰亚胺且聚集诱导发光的化合物制备及应用的制作方法

本发明涉及有机合成与生物技术领域中的荧光成像领域，具体而言，是两种4-取代甲胺基-1，8萘二酰亚甲胺化合物的制备方法及癌细胞成像分析。

背景技术：

荧光法能够高灵敏地、非入侵地实时反映体系的信号而在样品分析中有显著优势，荧光探针与生物标记成像等技术的发展拓宽了荧光法在生物、环境、医学等领域的应用。荧光探针包括on-off以及off-on等类型，在实际检测过程中，能够导致荧光淬灭的环境因素很多，相比而言，荧光off-on型的探针或染料更能准确反应待测体系的物量或者过程变化。目前常用的商业化染料多是有机小分子，如细胞膜染料(did,dio,dii)，核酸染料(hoechst)，以及基于罗丹明或碳菁的线粒体染料等。这些染料通常兼具大的共轭结构和亲脂性，在生理条件下，特别是特异性定位染料不可避免地会聚集，然而聚集时π-π作用可能导致荧光淬灭(acq)，这类现象一方面对荧光染料的量子产率以及灵敏度提出了高要求，另一方面限制了样品检测的范围与精度，使得荧光染料的应用受到局限。

聚集诱导荧光发射(aie)的现象与上述聚集诱导荧光淬灭(acq)现象相反，具有aie性质的分子在聚集态仍能发光，甚至某些体系聚集导致发射增强(aiee)，从原理上解决了染料分子亲脂性与生理水环境的冲突、以及灵敏度与量子产率冲突等难点。此外，靶向地聚集可以避免染料分子的扩散，降级了整体的生物毒性。因此，发展聚集诱导发射型的荧光探针或染料，能够弥补聚集导致荧光淬灭型染料的缺陷，能够拓展荧光技术在生物传感检测与成像分析中的应用。

具有aie性质的染料除了唐本忠团队开发的聚四苯乙烯及类似物，一些多烷烃链修饰的萘酰亚胺类染料也逐步被报道具有aie，但目前报道aie萘酰亚胺共同点是用长烷烃链或取代烷烃链修饰了9-n，而萘酰亚胺常用的修饰位点还有4-位，而4-位修饰的aie萘酰亚胺鲜有报道。

技术实现要素：

为了开拓萘酰亚胺4-位修饰的aie分子，我们设计并合成了两种己烷链修饰4-位萘二酰亚甲胺的aie分子，同时提供了一种成像应用。

本发明提供如下技术方案：

两种基于萘酰亚胺且聚集诱导发光的化合物制备及应用其特征在于，具有如6brnmeq和6anmeq所示的结构：

上述化合物6brnmeq和6anmeq的制备方法，包括以下合成步骤：

(1)氮气状态下，将4-溴-1,8-萘酐与甲胺水溶液溶于dmso，80℃反应3h。随后将反应液置于冰水中，过滤，用去离子水洗涤滤饼，收集滤饼并干燥。最后通过柱层析得产物dinmeq为黄色固体，反应式如(i)所示：

(2)氮气状态下，将纯化的化合物dinmeq与干燥的四氢呋喃置于冰浴中，搅拌条件下加入nah，经室温并回流反应2h后，加入1,6-二溴己烷继续回流一夜。最后旋蒸反应液，并用柱层析纯化得到化合物6brnmeq，反应式如(ii)所示：

(3)氮气状态下，将化合物6brnmeq，4-(3-氯-4-氟苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-醇，以及cs2co3溶于干燥的dmf中，室温反应3h后，旋蒸除掉溶剂，用柱层析得到化合物6anmeq，反应式如(iii)所示：

具体而言，步骤(i)中的有机溶剂为dmso，4-溴-1,8-萘酐与甲胺水溶液摩尔比为1:5。

步骤(ii)中的有机溶剂为干燥的thf，2-甲基-4-甲胺基-1,8-萘二甲酰胺、nah、1,6-二溴己烷的投料摩尔比为：1:1.5:1.5。

步骤(iii)中的有机溶剂为干燥的dmf，化合物6brnmeq、4-(3-氯-4-氟苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-醇、cs2co3的摩尔比为1：1：2。

化合物6anmeq在癌细胞脂滴成像中的应用，包括以下步骤：将化合物6anmeq配成稀溶液，并加入一定体积到盛有癌细胞的玻底培养皿，化合物6anmeq与癌细胞37℃避光孵育。由于化合物的亲脂性、在小极性溶剂中量子产率高、具有聚集诱导发光性质等特点，随后将上述玻底培养皿置于荧光共聚焦显微镜下观察成像。

具体而言，化合物6anmeq稀溶液为0.5um含1％dmso的pbs7.4溶液，加入玻底培养皿的体积为1ml，孵育时间为5min。

所用的癌细胞为lm3肝癌。

目前报道的具有聚集诱导发光性质的萘酰亚胺化合物大部分是由长链烷烃取代9-位n-的衍生物，本发明6brnmeq和6anmeq是两种新的用己烷链修饰萘酰亚胺4位的化合物，其中6anmeq经6brnmeq与4-(3-氯-4-氟苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-醇发生亲核取代反应而得。两者具有明显的聚集诱导发光性质，在水溶液或固态可发出绿色荧光，并对环境极性敏感。根据这些光谱性质，我们将聚集态量子产率更高的6anmeq应用于癌细胞脂滴成像。

本发明的有益效果在于，(1)用dmso作为4-br-1,8-萘二甲酸酐与甲胺水溶液反应的溶剂，溶解性能好，比用文献报道的方法缩短了反应时间并减少副产物生成。

(3)化合物6brnmeq和6anmeq是新的具有亲脂性、对溶剂环境敏感、以及聚集诱导发光(aie)的性质。发出的绿色荧光稳定性较好，6brnmeq和6anmeq固体量子产率分别为0.15和0.22。

附图说明

图1为化合物6anmeq的单晶结构。

图2为化合物dinmeq在不同比例dmso-h2o中荧光光谱，随着h2o含量增加，荧光强度依次减弱。dinmeq是典型的聚集导致荧光淬灭化合物。

图3为化合物6brnmeq在不同比例dmso-h2o体系中的荧光光谱，当h2o含量超过50％后，荧光随之增强。化合物6brnme具有聚集导致荧光发射化合物的性质。

图4(a)为化合物6anmeq在不同溶剂中归一化的荧光光谱，以及图5为化合物6anmeq在不同比例glycerol-h20中荧光强度。随着glycerol增加，体系粘度增加，6anmeq荧光增强。

图6，化合物6anmeq分别在不同比例thf-h2o(图6(a)),以及dmso-h20(图6(b))体系中的荧光光谱图。

图7为化合物6anmeq的聚集态归一化的荧光光谱图。

图8(a)为化合物6anmeq在10％dmso-90％h2o体系中的粒径分布，图8(b)为化合物6anmeq在10％thf-90％h2o体系中的粒径分布。

图9为化合物6anmeq对a431细胞毒性检测结果。

图10为对lm3细胞染色图效果图.(a)化合物6anmeq染色，(b)脂滴染料尼罗红染色，(c)为(a)和(b)叠加的效果图。

具体实施方式

以下通过具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应将此理解为本发明上述主体的范围仅限于以下的实施例。凡基于本发明上述内容所实现的技术和应用均属于本发明范畴。

实施例1

dinmeq的制备：n2氛围下，将4-溴-1,8-萘二甲酸酐(2.77g，10mmol)和40％的甲胺水溶液(5.2ml，50mmol)加到dmso中，80℃搅拌3小时后冷却至室温，随后将反应液倒入冰水，过滤析出的沉淀并干燥。最后粗产物用柱色谱纯化(洗脱剂，石油醚：乙酸乙酯＝5:1)，得到的dinmeq为黄色固体，产率72％。

¹hnmr(600mhz,(cd3)2so)δ8.61(d，j＝9.0hz，1h),δ8.43(d,j＝7.2hz,1h),δ8.29(d,j＝8.4hz,1h),δ7.92(m,1h),δ7.68(t,j＝7.8hz,1h),δ3.35(s,3h),δ2.99(d,j＝4.8hz,3h)。

¹³cnmr(600mhz,(cd3)2so)δ164.54,163.46,151.87,134.86,131.13,129.33,128.81,124.52,122.20,120.77,108.07,103.78,29.99,26.59；

hrms(maldi-tof):m/zcalcd.for[c14h13n2o2⁺][m+h]⁺:241.0977，found241.0980.

实施例2

6brnmeq的制备：n2氛围下，冰浴条件下将nah(60％分散在煤油中，3mmol)慢慢加入到干燥的dinmeq(0.24g，1mmol)thf悬浊液中，不断搅拌并回流反应2h，随后加入1,6-二溴己烷(438ul，3mmol)并继续回流过夜反应。待大部分原料转化，旋蒸掉反应液中溶剂，固体粗产物直接用柱色谱分离纯化(洗脱剂：石油醚：乙酸乙酯＝10:1)，得到的6brnmeq为明黄色固体，产率39％。

¹hnmr(600mhz,cdcl3),δ8.50(d,j＝8.0hz,1h),δ8.60(d,8.0hz,j＝8.0hz,1h),δ8.47(d,j＝8.0hz,1h),δ7.69(t,j＝8.0hz,1h),δ7.19(d,j＝8.0hz,1h),δ3.55(s,3h),δ3.36(m,4h),δ3.06(s,3h),δ1.84(m,2h),δ1.75(m，2h),δ1.40(m，2h),δ1.35(m,2h)；

¹³cnmr(600mhz,(cd3)2so),δ164.38,163.74,156.83,132.57,131.51,130.96,129.92,125.59,125.42,122.93,114.47,114.16,56.62,41.66,35.57,32.60,27.71,27.08,26.98,25.95.

hrms(maldi-tof):m/zcalcd.for[c20h24n2o2br]⁺,[m+h]⁺:403.1021,found403.1004.

实施例3

6anmeq的制备：n2氛围下，将化合物6brnmeq(0.403g，1mmol)，4-(3-氯-4-氟苯氨基)-7-甲氧基喹唑啉-6-醇(0.32g，1mmol)，以及cs2co3(0.650g,2mmol)溶于干燥的dmf中，室温反应3h后，旋蒸除掉溶剂，柱层析(洗脱剂：二氯甲烷：甲醇＝40：1)得到化合物6anmeq，产率64％。

¹hnmr(400m,cdcl3)δ8.64(s,1h),δ8.55(d,j＝7.2hz,1h),δ8.45(d,j＝8.0hz,1h),δ8.37(d,j＝8.4hz,1h),δ7.87(m,1h),δ7.74(s,1h),δ7.62(t,j＝8.0hz,1h),δ7.56(m,1h),δ7.23(s,1h),δ7.12(t,j＝8.8hz,3h),δ3.95(m,5h),δ3.53(s,3h),δ3.35(t,j＝7.2hz,2h),δ3.04(s,3h),δ1.75(m,4h),δ1.34(m,4h)；

¹³cnmr(400m,cdcl3)δ164.98,164.42,156.97,156.22,155.22,153.26,149.18,147.29,132.54,131.16,131.02,130.02,125.72,124.98,124.17,122.91,121.78,121.71,121.08,120.90,116.54,116.39,114.82,114.44,108.87,107.70,69.32,56.78,56.06,41.42,28.96,27.22,26.94,26.61,25.61.

hrms(maldi-tof):m/zcalcd.for[c35h34n5o4clf]⁺[m+h]⁺:642.2283,found642.2282.

实施例4

将粉末状6anmeq溶于二氯甲烷和甲醇混合液中，溶剂经过缓慢蒸发得到单晶。其周期性单晶结构见图1，单个晶胞包含两分子的6anmeq的聚集体，6anmeq的分子进行交错式j聚集，几乎没有π-π相互作用导致没有聚集淬灭，而紧促的空间阻碍了萘环与己烷链c-n键的转动，这可能导致aie的原因。

实施例5

化合物dinmeq在不同比例dmso-h2o的荧光光谱，荧光强度随h2o的比例增加而减弱且荧光峰红移，见图2。dinmeq的聚集诱导荧光淬灭可能由于dinmeq分子内电荷转移引起。

实时例6

化合物6brnmeq在dmso-h2o体系中的荧光光谱，dmso对于是其良性溶剂，h2o是不良溶剂。h2o含量低于50％时，荧光强度无显著变化，高dmso比例对应于6brnmeq溶解态的单分子荧光，而当h2o含量超过50％后，荧光随之增强。表明6brnme具有聚集导致荧光发射化合物的性质。

实时例7

化合物6anmeq的光物理性质表征，包括以下内容：

(1)化合物6anmeq在不同溶剂中的的荧光光谱，见图4：随着溶剂极性增加，最大发射峰红移；

(2)化合物6anmeq在不同溶剂中的相对量子产率，见图4(b)：6anmeq在小极性溶剂中的荧光量子产率明显高于在大极性溶剂中的相对量子产率。

(3)化合物6anmeq在glycerol-etoh体系中的荧光光谱，见图5：随着glycerol增加，体系粘度增加，6anmeq荧光增强。表明分子内转动对6anmeq的荧光有影响。

(4)化合物6anmeq在thf-h2o体系中的荧光光谱，见图6(a)：h2o的含量低于50％，荧光由极性影响主导；h2o含量超过50％时，6anmeq表现出aie的典型特征。

(5)化合物6anmeq在dmso-h2o体系中的荧光光谱图，见图6(b)：h2o的含量低于50％，荧光由极性影响主导；h2o含量超过50％时，6anmeq表现出aie的典型特征。

(6)化合物6anmeq的粒径分布，见图7(a)(10％dmso-90％h2o)，平均直径是79nm，见图7(b)(9％thf-90％h2o)，平均直径是234nm。

实施例8

化合物6anmeq的凝聚态光谱性质，图8，晶体状态时的光谱比粉末状态半峰宽要大，但最大发射峰位置一致；而在水溶液中的聚集最大发射峰比晶体状态和粉末状态蓝移了5nm。

实施例8

化合物6brnmeq和6anmeq的固体量子产率如表1。

表1为6brnmeq和6anmeq在不同激发波长时的固体量子产率。

表1

实施例9

化合物6anmeq的细胞毒性，用mtt法检测了6anmeq对a431细胞的影响，在0.1～100um，6anmeq无显著毒性。见图9。

实施例10

化合物6anmeq的在lm3肝癌细胞脂质结构中荧光成像：lm3细胞用pbs7.4缓冲液洗涤后，将终浓度为0.25um的6anmeq和终浓度为0.5ug/ml的尼罗红溶液加入到含有lm3细胞的玻底培养皿中，37℃避光孵育10min。随后将该玻底培养皿置于荧光共聚焦显微镜下观察成像。化合物6anmeq与尼罗红有良好的共定位能力，而尼罗红是脂滴染料，表明6anmeq可以对癌细胞脂滴成像。见图10。