检测膀胱癌的核酸适体及其应用的制作方法

本发明属于肿瘤分子生物学技术领域，涉及一种可用于膀胱癌细胞及肿瘤活体检测的核酸适体及其应用。

背景技术：

膀胱癌(即膀胱移行细胞癌)是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是全球十大常见的癌症之一。它是全球男性中第六大常见癌症和第九大癌症死亡原因，占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位。目前，全球大约出现549000例新病例和200000例死亡。膀胱癌在男性中比在女性中更常见，男性的发病率和死亡率分别为9.6和3.2/100000，约为全球女性的4倍。南欧(希腊男性发病率最高；)，西欧(比利时和荷兰)和北美洲的两性发病率最高，而在黎巴嫩，妇女的发病率最高。除了某些经常暴露于化学和水污染物之中的职业，吸烟是导致膀胱癌的主要风险因素，至少在美国，随着女性吸烟者的增加，50％的膀胱癌病例可归因于两性吸烟。膀胱癌的诊断主要包括尿液细胞学、尿液肿瘤标志物、膀胱镜检查、ct或mri扫描成像。但这些诊断方法在一定程度上具有假阳性，灵敏度低等局限性，仍然缺乏具有高特异性的分子探针用于膀胱癌的早期诊断。膀胱癌的治疗主要包括手术、化疗和放射性治疗，此外，还有近期发展起来的免疫治疗。传统的手术、放疗和化疗容易导致一系列并发症等副作用，对人体其他健康组织器官同时造成不可挽回的损伤。免疫治疗虽然非常有效，但所用抗体免疫原性较高，可能导致全身感染等紧急医疗情况。因此，寻找膀胱癌特异性的分子探针对膀胱癌早期诊断、病情监测和治疗预后具有重要意义。近年来，核酸适体特别是细胞特异性核酸适体作为一种新型分子探针已被广泛应用于生物医学方面的研究，为恶性肿瘤的诊断和靶向治疗提供了新思路和新希望。

核酸适体(aptamer)是体外通过指数富集的配体系统进化技术(systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment，selex)从随机单链核酸序列文库中经过多轮筛选得到的与靶标分子高特异性结合的单链dna或rna。核酸适体相对蛋白抗体较为稳定，制备过程也相对容易，不存在批次间的差异。核酸适体与靶标结合时，主要借助氢键作用、范德华力、静电作用、疏水作用等分子间作用力形成一些稳定的二级结构，如发卡、茎-环、g4结构等。形成这些结构的碱基通常是影响结合活性的关键位点。

通过以细胞为靶标筛选核酸适体的方法称为cell-selex，其基本原理是通过靶细胞与体外人工合成的寡核苷酸文库相互结合，引入正常细胞去除非特异性结合寡核苷酸，利用pcr技术扩大与靶细胞结合寡核苷酸分子的容量，经过几轮或十几轮的重复筛选富集过程，获得高特异性和高亲和性的核酸适体。cell-selex技术通常是利用识别正筛选细胞(癌细胞)和负筛选细胞(正常细胞)细胞膜上细微的分子差异，从而得到能够高效区分癌细胞和正常细胞的核酸适体。通过进一步对这些核酸适体的性质表征和靶分子鉴定，有助于发现新的肿瘤生物标志物，用于肿瘤诊治。而在整个cell-selex过程中，细胞表达的所有分子都处于其天然折叠状态，所反映的状态更接近于生理条件，增强了核酸适体体内应用的成功率。

技术实现要素：

本发明的主要目的是提供一种全新的与膀胱癌细胞具有高亲和力和高特异性的核酸适体及其应用。该适体制备简单，成本低，对膀胱癌细胞选择性好，结合力强，检测灵敏度高，检测过程操作简单，结果准确。

一种检测膀胱癌的核酸适体，序列为5’

-agccctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctatcacgtggagct-3’(seqno.1)，或者在该序列两端加上引物序列。优选：

5’-cgtacggtcgacgctagccctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctatcacgtggagctcggatcc-3’(seqno.2)，命名为spl3，

所述检测膀胱癌的核酸适体spl3在25℃，1.0mmna⁺，0.5mmmg²⁺条件下具有独特的茎环结构，其结构式如下：

所述的检测膀胱癌的核酸适体，还可以是在其两端或一端进行碱基删减或者碱基替换获得与其功能相同的核酸适体。

具体包括：

5’-cctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctatcacgtggagctcggatcc-3’(seqno.3)；

或

5’-cgtacggtcgacgctagccctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctat-3’(seqno.4)；

或

5’-agccctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctatcacgtggagct-3’(seqno.5)；

或

5’-cctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctat-3’(seqno.6)；

或

5’-ttatcggtgtttatggtgtctgtcta-3’(seqno.7)。

所述的检测膀胱癌的核酸适体，优选序列如下：

5’-agccctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctatcacgtggagct-3’。

所述的检测膀胱癌的核酸适体，序列两端或一端进行包括：放射性标记、治疗性药物连接、荧光标记或生物素标记在内的修饰或改造，得到与所述核酸适体具有相同结合膀胱癌细胞能力的核酸适体衍生物。

所述的膀胱癌细胞来源于人。所述的检测膀胱癌的核酸适体包括如下应用：

(1)在制备膀胱癌检测试剂中的应用。

(2)在制备膀胱癌治疗载体试剂中的应用。

(3)在研究膀胱癌细胞与正常细胞的差异性中的应用。

(4)在研究膀胱肿瘤活体成像中的应用。

本发明的优点在于：

首先，利用cell-selex筛选技术，引入正常膀胱尿路上皮细胞作为负筛细胞，消除与膀胱癌靶细胞非特异性结合的dna，确保筛选得到的核酸适体特异性识别膀胱癌靶细胞。以活细胞作为靶标的筛选保证筛选得到的核酸适体识别靶分子的天然构象。

本发明所述人膀胱移行细胞癌细胞的核酸适体具有独特的茎环结构，并通过流式检测发现其具有较高的结合亲和力和特异性，能特异性识别膀胱癌细胞，不识别正常膀胱尿路上皮细胞及其他大多数实体瘤细胞。筛选获得的核酸适体可以进一步截短优化，分子量小，节约了合成成本，提高了亲和力，易修饰改造，无细胞毒性，结合特异型强，无免疫原性，稳定性高。

上述优点使得所述核酸适体作为膀胱癌特异性识别分子探针，用于诊断和靶向治疗膀胱癌方面具有重要的潜力。

附图说明

图1为流式检测所述核酸适体筛选富集进程情况；

在图1中横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数目；第13th轮达到最大富集，如箭头所示，。

图2为流式检测所得核酸适体spl3与人移行膀胱癌细胞及正常膀胱尿路上皮细胞sv-huc-1的结合情况；

在图2中横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数目。

图3为流式检测所得核酸适体spl3与其它实体肿瘤癌细胞的结合情况；

在图3中横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数目；

图4为流式检测所述核酸适体spl3经过一系列删减后与人移行膀胱癌细胞的结合情况；

在图4中横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数目。

图5为激光共聚焦检测核酸适体spl3c与人移行膀胱癌细胞的结合情况；

在图5中fitc代表适体荧光强度，brightfield代表细胞自身荧光信号，merge代表适体与细胞结合的合并荧光强度。

图6为流式检测核酸适体spl3c对人移行膀胱癌细胞的解离常数；

在图6中横坐标为dna浓度(nm)，纵坐标为平均荧光强度。

图7为琼脂糖凝胶对核酸适体spl3c的稳定性表征。

图8为流式检测核酸适体spl3c的靶标类型初步鉴定，靶标类型初步鉴定为蛋白；

在图8中横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数目。

图9为动物多彩成像仪检测核酸适体spl3c在人移行膀胱细胞植瘤裸鼠模型中的靶向作用。

图10为流式检测核酸适体spl3c与膀胱癌细胞t24的结合情况；

在图10中横坐标为荧光强度，纵坐标为细胞数目。

具体实施方式

以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买所得到的。

细胞来源：本实验所用到的细胞系人膀胱移行细胞癌细胞5637和t24以及人正常膀胱尿路上皮细胞sv-huc-1均来源于中科院上海细胞库，人乳头瘤状甲状腺癌细胞tpc-1、人宫颈癌细胞hela、人肺腺癌细胞h1299、人骨肉瘤细胞u2os、人急性淋巴白血病细胞cem、人乳腺癌细胞mcf-7、人胚肾细胞hek293、人b淋巴细胞瘤细胞ramos及人结直肠腺癌细胞hct116均来自长沙湘雅医院细胞库。

实施例1以cell-selex技术筛选所述核酸适体。

(1)所用核酸文库和引物的设计：

随机单链dna文库：

5’-cgtacggtcgacgctagcnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncacgtggagctcggatcc-3’(n代表a、t、g、c四种任意碱基)(seqno.8)

上游引物：5’-异硫氰酸荧光素-cgtacggtcgacgctagc-3’(seqno.9)

下游引物：5’-生物素-ggatccgagctccacgtg-3’(seqno.10)

(2)筛选过程：

本发明以人膀胱移行细胞癌细胞5637为正筛靶标，以人膀胱尿路上皮细胞sv-huc-1为反筛靶标。

2.1正筛选：

a.孵育：用结合缓冲液溶解上述随机dna文库，95℃变性5min，冰上复性10min，然后与预处理好的培养24h以上细胞融合度达90％左右的人膀胱移行细胞癌细胞5637在4℃共孵育1h。

b.分离：将孵育后上清移除，用洗涤缓冲液冲洗孵育后细胞数次，随后取无菌水刮取洗涤后细胞与离心管，95℃变性10min，冰上复性10min，5500rpm离心3min，吸取上清即分离得到5637细胞的第一轮筛选核酸文库。

c.pcr扩增文库：以步骤b中得到的文库为模板，上述引物为引物，扩增条件为：95℃，30s；55.9℃，30s；72℃，30s扩增8个循环，72℃，5min。得到初步扩增产物，而后以扩增产物为模板扩增合适循环数进行大量扩增。

d.dna单链制备：用链霉亲和素修饰的琼脂糖珠分离生物素标记的步骤c中的pcr扩增产物反义链，而后以0.2m的naoh将dna双链变性，通过脱盐收集异硫氰酸荧光素标记的正义dna单链文库。

2.2反筛：将步骤d中所得到的dna单链文库与反筛细胞sv-huc-1进行孵育，收集孵育后上清，以排除非特异性结合的核酸分子，收集上清可继续与正筛细胞孵育以进行下一筛选步骤。

2.3筛选过程的循环：重复2.1和2.2的筛选过程，直至筛选到与靶细胞5637结合较强的核酸适体文库。此过程需进行几轮到十几轮的重复。

2.4高通量测序：将筛选最后一轮结合最大的核酸文库进行高通量测序，利用流式检测所得序列与5637细胞的结合能力，从而确定核酸适体。通过流式细胞仪术进行荧光检测，dna初始随机文库作为对照。第13轮筛选产物达到最大富集，且不与正常膀胱尿路上皮细胞结合，结果如图1所示。

实施例2流式检测所得核酸适体spl3与人移行膀胱癌细胞5637及正常膀胱尿路上皮细胞sv-huc-1的结合情况

首先，分别培养5637细胞和sv-huc-1细胞24h使细胞密度达90％，再分别用0.2％edta将贴壁状态的细胞从培养皿上消化下来。分别用200μl结合缓冲液配置250nm的合成好的fam标记的spl3，95℃变性5min，冰上复性10min。与30万个5637细胞或sv-huc-1细胞在4℃共孵育1h。使用洗涤缓冲液洗涤孵育后的细胞2-3次，而后将细胞重悬于300μl洗涤缓冲液中。通过流式细胞仪术进行荧光检测，dna初始随机文库作为对照。核酸适体只结合靶细胞5637，不结合正常膀胱尿路上皮细胞sv-huc-1，结果如图2所示。

实施例3以流式检测所得核酸适体spl3与其它实体肿瘤癌细胞的结合情况。

首先，分别培养不同类型细胞24h使细胞密度达90％，再分别用0.2％edta将贴壁状态的细胞从培养皿上消化下来。分别用200μl结合缓冲液配置250nm的合成好的fam标记的spl3，95℃变性5min，冰上复性10min。与30万个细胞在4℃共孵育1h。使用洗涤缓冲液洗涤孵育后的细胞2-3次，而后将细胞重悬于300μl洗涤缓冲液中。通过流式细胞仪术进行荧光检测，dna初始随机文库作为对照。核酸适体spl3不与其他实体瘤细胞结合，结果如图3所示。

实施例4以流式检测所述核酸适体spl3经过一系列删减后与人移行膀胱癌细胞5637的结合情况。

首先，根据spl3的二级结构对spl3进行如下序列删减优化：

spl3全长序列为：

cgtacggtcgacgctagccctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctatcacgtggagctcggatcc

spl3a:5’端引物区删减18个碱基

cctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctatcacgtggagctcggatcc

spl3b:3’端引物区删减18个碱基

cgtacggtcgacgctagccctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctat

spl3c：5’端删减15个碱基,3’端删减7个碱基，保留中间茎环结构

agccctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctatcacgtggagct

spl3d：5’端引物区删减18个碱基，3’端引物区删减18个碱基

cctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctat

spl3e：5’端删减26个碱基,3’端删减19个碱基，保留其中大环结构

ttatcggtgtttatggtgtctgtcta

然后培养5637细胞24h使细胞密度达90％，再用0.2％edta将贴壁状态的细胞从培养皿上消化下来。分别用200μl结合缓冲液配置250nm的合成好的fam标记的上述截短序列，95℃变性5min，冰上复性10min。与30万个5637细胞在4℃共孵育1h。使用洗涤缓冲液洗涤孵育后的细胞2-3次，而后将细胞重悬于300μl洗涤缓冲液中。通过流式细胞仪术进行荧光检测，dna初始随机文库作为对照，结果见图4，发现核酸适体spl3c序列最短且位移最大，说明spl3c的结合能力最强。

实施例5以激光共聚焦检测核酸适体spl3c与人移行膀胱癌细胞5637的结合情况。

首先，将5637细胞以40％的融合密度接种于光学培养皿培养24h以上。分别用500μl结合缓冲液配置250nm的合成好的fam标记的spl3c，95℃变性5min，冰上复性10min，而后与接种于光学培养皿的5637细胞在4℃共孵育1h，fam标记的文库作为对照。激光共聚焦检测细胞在488nm处的荧光信号，结果如图5所示。与spl3c孵育之后，能观察到明显的荧光。

实施例6以流式检测优化后的核酸适体spl3c对人移行膀胱癌细胞5637的解离常数。

使用0nm，5nm，25nm，50nm，100nm，200nm，400nm，600nm浓度梯度的spl3c与靶细胞5637来测定解离常数(kd)。首先，培养5637细胞24h使细胞密度达90％，再分别用0.2％edta将贴壁状态的细胞从培养皿上消化下来。分别用200μl结合缓冲液配置上述各浓度的合成好的fam标记的spl3c，95℃变性5min，冰上复性10min。与30万个5637细胞或sv-huc-1细胞在4℃共孵育1h。使用洗涤缓冲液洗涤孵育后的细胞2-3次，而后将细胞重悬于300μl洗涤缓冲液中。通过流式细胞仪术进行荧光检测，同样浓度梯度的dna初始随机文库作为对照。而后用grahpadprism5软件作图，计算出所得适体spl3c的解离常数为18.99±1.73nm，结果如图6所示。

实施例7以琼脂糖凝胶对核酸适体spl3c的稳定性表征。

首先，将合成好的核酸适体spl3c溶解于含10％fbs的rpim1640完全培养基中，终浓度为3μm，于37℃分别孵育0h，2h，4h，6h，8h,10h，12h，24h，36h，48h，72h，95℃变性5min，冰上复性10min，而后保存于-80℃。用3％的琼脂糖凝胶电泳检测上述样品的稳定性。spl3c于完全培养基中孵育48h仍未完全降解，稳定性较强，结果如图7所示。

实施例8以流式检测核酸适体spl3c的靶标类型初步鉴定。

首先，培养5637细胞24h使细胞密度达90％，再分别用0.2％edta、胰酶和蛋白酶k将贴壁状态的细胞从培养皿上消化下来。分别用200μl结合缓冲液配置250nm的合成好的fam标记的spl3c，95℃变性5min，冰上复性10min。与30万个不同消化方式处理的5637细胞在4℃共孵育1h。使用洗涤缓冲液洗涤孵育后的细胞2-3次，而后将细胞重悬于300μl洗涤缓冲液中。通过流式细胞仪术进行荧光检测，同样浓度梯度的dna初始随机文库作为对照。经过蛋白酶k以及胰酶处理之后spl3c与靶细胞的结合荧光强度恢复到与文库相应位置，说明spl3c与5637细胞膜表面上的蛋白结合，结果如图8所示。

实施例9以动物多彩成像仪检测核酸适体spl3c在荷瘤小鼠模型中的应用

首先购买4-5周龄裸鼠，待裸鼠适应新环境后，每只裸鼠皮下注射7百万个5637细胞进行成瘤，约15天左右。随后通过尾静脉注射方式给荷瘤小鼠分别注射cy5标记的核酸适体spl3c5.0nmol，cy5标记的文库作为对照，以小动物多彩成像仪进行定点荧光检测，如图9所示。注射5min后，在裸鼠肿瘤部位即可观察到核酸适体spl3c的荧光富集，3h后荧光仍未完全消失，而注射对照文库组的裸鼠肿瘤部位始终未观察到荧光信号。证明核酸适体spl3c可应用于膀胱癌体内靶向。

实施例10以流式检测所得核酸适体spl3c与膀胱癌细胞t24的结合情况。

首先，培养t24细胞24h以上使细胞密度达90％，再用0.2％edta将贴壁状态的细胞从培养皿上消化下来。分别用200μl结合缓冲液配置250nm的合成好的fam标记的spl3c，95℃变性5min，冰上复性10min。与30万个细胞在4℃共孵育1h。使用洗涤缓冲液洗涤孵育后的细胞2-3次，而后将细胞重悬于300μl洗涤缓冲液中。通过流式细胞仪术进行荧光检测，dna初始随机文库作为对照。核酸适体spl3c也能够特异性识别膀胱癌细胞t24，结果如图10所示。

序列表

<110>湖南大学

<120>检测膀胱癌的核酸适体及其应用

<130>无

<160>10

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>49

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>1

agccctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctatcacgtggagct49

<210>2

<211>71

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>2

cgtacggtcgacgctagccctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctatcacgtgg60

agctcggatcc71

<210>3

<211>53

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>3

cctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctatcacgtggagctcggatcc53

<210>4

<211>53

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>4

cgtacggtcgacgctagccctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctat53

<210>5

<211>49

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>5

agccctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctatcacgtggagct49

<210>6

<211>35

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>6

cctcgggattatcggtgtttatggtgtctgtctat35

<210>7

<211>26

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>7

ttatcggtgtttatggtgtctgtcta26

<210>8

<211>71

<212>dna

<213>未知(unknown)

<220>

<221>misc_feature

<222>(19)..(53)

<223>n=aortorcorg

<400>8

cgtacggtcgacgctagcnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnnncacgtgg60

agctcggatcc71

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>9

cgtacggtcgacgctagc18

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>10

ggatccgagctccacgtg18