一种红树内生真菌中异香豆素类化合物及其制备方法与应用与流程

本发明属于红树内生真菌次级代谢产物领域，具体涉及一种红树内生真菌中异香豆素类化合物及其制备方法与应用。

背景技术：

海洋来源的内生真菌结构新颖活性独特的化合物重要来源之一。近年来，一些新的活性化合物已经从真菌penicillum中分离得到，例如：抗炎活性化合物chrysogenester，细胞毒的化合物penicimenolidesb-d和penitalarinsa-c，具有杀毒活性的化合物simpterpenoida，抗真菌化合物brocapyrrozina。前期研究发现内生真菌penicillum乙酸乙酯粗提物具有一定的抗菌活性。

技术实现要素：

本发明所述的红树内生真菌(penicillum，以下简称tgm112)分离自红树尖瓣海莲，其菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年11月9日；保藏编号：cgmccno.16499；分类命名：青霉penicilliumsp.。

本发明提供一种异香豆素类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于所述异香豆素类化合物具有化合物1-8所示的结构：

本发明的另一实施方案，提供一种同时制备化合物1-8的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)配制种子培养基，将tgm112菌株接入种子培养基，26～28℃，培养3～4天得种子培养液；

(2)将步骤(1)得到的种子培养液接入发酵培养基中，26～28℃静置培养21～24天得发酵物；

(3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；

(4)步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，其中20:80梯度洗脱得到的馏分浓缩后经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇：氯仿＝1:1，再经高效液相色谱hplc制备，色谱柱为agilentc18,9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为ch3cn:h2o＝45:55，最终得到化合物1、化合物4、化合物5、化合物6和化合物7；其中0:100梯度得到的馏分浓缩后经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇：氯仿＝1:1，再经高效液相色谱hplc制备，色谱柱为agilentc18,9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh:h2o＝45:55最终得到化合物2、化合物3和化合物8。

其中所述洗脱剂或流动相的比例均为体积比；所述种子培养基中含有葡萄糖1.5％–3.0％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；所述发酵培养基中含有葡萄糖1.6％–3.5％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；上述百分比均为重量百分比；所述种子培养基和发酵培养基均需120℃灭25–30分钟。

本发明提供一种药物组合物，其特征在于以本发明上述化合物1-8(尤其是化合物1、2、5、6、8)或其药学上可接受的盐作为活性成分。

本发明提供的上述药物组合物，还可包含其他杀虫药物；也可以包含药学上可接受的辅料(优选药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)。上述药物组合物的剂型可以是固体制剂、半固体制剂或液体制剂。

本发明的另一实施方案提供化合物1-8(尤其是化合物1、2、5、6、8)或其药学上可接受的盐在制备杀虫剂中的用途。尤其是在制备杀棉铃虫药物中的应用。

本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“saltselectionforbasicdrugs”,int.j.pharm.(1986),33,201–217。

附图说明

图1是化合物1、2的ecd谱图；

图2是化合物3-7的ecd谱图；

图3是化合物8的ecd谱图。

具体实施方式

为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。

实施例1

(1)tgm112的菌种培养

配制种子培养基：葡萄糖80g，蛋白胨8g，酵母膏8g，粗海盐10g，水4.0l，平均分装于8个1000ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。

将tgm112菌株接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；

(2)tgm112的发酵

配制发酵培养基：葡萄糖1.1kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g，水50l，平均分装于75个1000ml锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。

取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养21天得发酵物。

(3)浸膏的制备

将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；

(4)化合物1-8的提取分离

步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，其中20:80梯度洗脱得到的馏分浓缩后经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇：氯仿＝1:1，再经高效液相色谱hplc制备，色谱柱为agilentc18,9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为ch3cn:h2o＝45:55，最终得到化合物1(12.4mg)、化合物4(15.3mg)、化合物5(18.2mg)、化合物6(9.6mg)和化合物7(14.2mg)；其中0:100梯度得到的馏分浓缩后经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇：氯仿＝1:1，再经高效液相色谱hplc制备，色谱柱为agilentc18,9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh:h2o＝45:55最终得到化合物2(14.8mg)、化合物3(11.6mg)和化合物8(16.4mg)。

化合物1-8的¹h和¹³c-nmr(400/100mhz,^acd3od.^bdmso-d6)数据如下表1、表2。

表1化合物1-8的¹h-nmr(400mhz,^acd3od.^bdmso-d6)数据(ppm)

表2化合物1-8的¹h-nmr(100mhz,^acd3od.^bdmso-d6)数据(ppm)

实施例2

(1)tgm112的菌种培养

配制种子培养基(10.0l)：葡萄糖1.5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、粗海盐0.11％，其余为水；平均分装于16个1000ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。

将tgm112菌株接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养4天得种子培养液；

(2)tgm112的发酵

配制发酵培养基(100l)：葡萄糖1.6％(重量百分比，下同)、酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、粗海盐0.11％，其余为水；平均分装于150个1000ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。

取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养24天得发酵物。

(3)浸膏的制备

将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；

(4)化合物1-8的提取分离

步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，其中20:80梯度洗脱得到的馏分浓缩后经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇：氯仿＝1:1，再经高效液相色谱hplc制备，色谱柱为agilentc18,9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为ch3cn:h2o＝45:55，最终得到化合物1(26.2mg)、化合物4(31.5mg)、化合物5(37.0mg)、化合物6(20.5mg)和化合物7(29.0mg)；其中0:100梯度得到的馏分浓缩后经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇：氯仿＝1:1，再经高效液相色谱hplc制备，色谱柱为agilentc18,9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh:h2o＝45:55最终得到化合物2(29.5mg)、化合物3(23.8mg)和化合物8(33.2mg)。

实施例3

(1)tgm112的菌种培养

配制种子培养基(1.0l)：葡萄糖3.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、粗海盐0.6％，其余为水；平均分装于3个500ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。

将tgm112菌株接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养4天得种子培养液；

(2)tgm112的发酵

配制发酵培养基(10l)：葡萄糖3.5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、粗海盐0.6％，其余为水；平均分装于15个1000ml锥形瓶，120℃灭25–30分钟。

取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养22天得发酵物。

(3)浸膏的制备

将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；

(4)化合物1-8的提取分离

步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，其中20:80梯度洗脱得到的馏分浓缩后经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇：氯仿＝1:1，再经高效液相色谱hplc制备，色谱柱为agilentc18,9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为ch3cn:h2o＝45:55，最终得到化合物1、化合物4、化合物5、化合物6和化合物7；其中0:100梯度得到的馏分浓缩后经sephadexlh-20凝胶柱层析，洗脱剂为甲醇：氯仿＝1:1，再经高效液相色谱hplc制备，色谱柱为agilentc18,9.4×250mm，7μm，流速为2ml/min，流动相为meoh:h2o＝45:55最终得到化合物2、化合物3和化合物8。

实施例4本发明化合物1-8的抗虫活性的测定

试验方法：取化合物1-8对棉铃虫幼虫进行活性测试。

棉铃虫活性测试，在6孔板中加入等量混有不同浓度样品(200,100,50,25和12.5μl/孔)的人工饲料，平行三组。设置阳性组、空白组和阴性组，阳性对照组中分别加入相应的人工饲料及阳性药(200,100,50,25and12.5μl/孔)，空白对照为等量人工饲料，阴性对照为不同浓度的dmso(200,100,50,25and12.5μl/孔)。将6孔板放置室温下连续培养一周，观察棉铃虫幼虫的生长情况，每隔2天观察并记录棉铃虫生长死亡情况。木楝素(azadirachtin)为阳性对照药。

试验结果如下：

表3：

上表中：ic50：半抑制浓度(halfmaximalinhibitoryconcentration)。

azadirachtin^a为阳性药。

试验结果表明，化合物1、2、5、6、8对h.armigerahubne具有抑制活性，ic50值分别为200、200、200、100、100μg/ml，化合物3、4、7的ic50>200μg/ml。