酪蛋白磷酸肽-葡聚糖制备方法及其在促钙吸收上的应用与流程

本发明属于生物材料与缓释技术领域，涉及酪蛋白磷酸肽-葡聚糖的制备方法及其在促钙吸收上的应用。

背景技术：

缺钙是全世界都广泛关注的营养问题，要解决这一问题必须从两方面入手。一为增加钙的摄入量，二为提高钙的吸收利用率。针对补钙这一问题，各大保健品牌大都着眼于增加钙的摄入量，摄入过多的钙会在体内发生沉淀，并不能被吸收。如何将体内摄入过多的钙先储存起来，避免其沉淀，再缓慢释放，使钙的吸收利用率更高，既是本发明要解决的技术问题。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种能促钙吸收的酪蛋白磷酸肽-葡聚糖营养递送系统，采用酪蛋白磷酸肽和葡聚糖作为原料，然后使它们进行湿法接枝，并通过控制反应的温度、时间、ph及反应物配比，最终形成二元共价复合物。制备得到的复合物可作为营养递送系统与钙离子结合形成三元络合物。将此种钙离子递送系统应用到产品中，能够增加钙含量和对的钙吸收率。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种酪蛋白磷酸肽-葡聚糖的制备方法，葡聚糖与酪蛋白磷酸肽发生接枝共聚反应，形成二元共价复合物，该二元共价复合物吸附或释放钙离子。

而且，该方法的具体步骤为：将酪蛋白磷酸肽和葡聚糖以一定的质量比加入到磷酸盐缓冲溶液中，调节酸碱度，然后于一定温度的热水浴中使其反应，反应完全后迅速用冰水降温使其停止反应，然后将冷却了的混合液离心并移除不溶沉淀物质，留上清液备用，将离心得到的上清液经蒸馏水流水透析后，置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥得到产品。

而且，酪蛋白磷酸肽与葡聚糖的质量比为1:5-1:1溶于磷酸盐缓冲溶液中，酪蛋白磷酸肽的浓度为0.5-2.5mg/ml。

而且，磷酸盐缓冲溶液的摩尔浓度为1-3mol/l。

而且，调节酸碱度至ph为7。

而且，热水浴的温度为80～100℃。

而且，在热水浴中的反应时间为2～4h。

而且，混合液冷却后采用离心机2000～4000r/min，离心10～20min，除去沉淀，得到清液。

而且，将离心得到的上清液经蒸馏水流水透析20～30h，透析袋阻截分子量为6000-8000da。

而且，冷冻干燥的时间为20～30h。

优选的，将酪蛋白磷酸肽和葡聚糖以质量比为3:5加入到2mol/l的磷酸盐缓冲溶液中。调节酸碱度，使混合液的ph至7，然后于一定温度的热水浴中使其反应，必要时磁力搅拌。反应完全后迅速用冰水降温使其停止反应，然后将冷却了的混合液离心并移除不溶沉淀物质，留上清液备用。将离心得到的上清液经蒸馏水流水透析24h后，置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥。干燥后即可得到此产品。

酪蛋白磷酸肽/葡聚糖在不同质量比下(其它条件控制为：反应温度90℃，加热时间3h，反应ph为7.0)的变化情况。随着反应物配比的增大，褐变程度和中间产物呈现不规则升高的现象，过高的浓度，将导致分子间空间位阻的增加，从而不利于反应的进行。控制好反应物配比，不仅增加反应速度，还能降低反应副产物的产生量，所以，选用适当的配比将有益于后续反应的进行。

酪蛋白磷酸肽/葡聚糖在不同加热时间条件下(其它条件控制为：反应物配比酪蛋白磷酸肽与葡聚糖质量比为3:5，反应温度90℃，反应ph为7.0)的变化情况。在反应前期可能由于多肽分子逐渐受热展开，利于酪蛋白磷酸肽与葡聚糖发生反应，但反应时间过长时将导致氨基酸被破坏以及产物发生降解，不利于接枝反应发生，接枝率有所下降。

酪蛋白磷酸肽/葡聚糖在不同加热温度时(其它条件控制为：反应物配比酪蛋白磷酸肽与葡聚糖质量比为3:5，反应时间3h，反应ph为7.0)的变化情况。随着反应温度的升高，升高温度可促进颜色加深，接枝物色泽较深，限制了接枝物的应用。

酪蛋白磷酸肽/葡聚糖在不同反应ph条件下(其它条件控制为：反应物配比酪蛋白磷酸肽与葡聚糖质量比为3:5，反应温度90℃，反应时间3h)的变化情况。较酸或较碱时，均不利于接枝反应，在酸性状态时，接枝物较易水解；碱性状态下，鉴于相邻氮原子作用，导致糖的碱基处的电子密度增大，进而导致1,2-烯醇化困难。因此中性条件为较优的制备条件。

本发明的优点和有益效果：

1、酪蛋白磷酸肽-葡聚糖二元复合物具有体外抑制磷酸钙沉淀的能力，表明其可以提高和促进小肠腔内可溶性钙的浓度，起到提高钙离子吸收率，抑制磷酸钙沉淀的作用。见图1。

2、复合物具有较大的粒径和较高的热稳定性。酪蛋白磷酸肽-葡聚糖二元共价复合物结合钙量可以达到46.8％，且复合物的钙结合量与复合物的接枝率呈现线性相关性，见图2。

3、采用酪蛋白磷酸肽和葡聚糖作为湿法接枝的原料，能够发挥多糖和蛋白质协同作用，表现出比单独使用蛋白和多糖时更为优异的性能。在这一营养系统中葡聚糖提供了保护外壳，酪蛋白磷酸肽能够远离消化环境，降低了胃部的酶解和低酸环境对酪蛋白磷酸肽的影响。

附图说明

图1(a)为不同反应物配比制备的酪蛋白磷酸肽-葡聚糖二元复合物的ph漂移曲线；

图1(b)为不同加热时间制备的酪蛋白磷酸肽-葡聚糖二元复合物的ph漂移曲线；

图1(c)为不同加热温度制备的酪蛋白磷酸肽-葡聚糖二元复合物的ph漂移曲线；

图1(d)为不同反应ph条件制备的酪蛋白磷酸肽-葡聚糖二元复合物的ph漂移曲线；

图2(a)为反应物配比对接枝共聚物接枝率的影响；

图2(b)为加热时间对接枝共聚物接枝率的影响；

图2(c)为加热温度对接枝共聚物接枝率的影响；

图2(d)为反应ph对接枝共聚物接枝率的影响；

图3为酪蛋白磷酸肽-葡聚糖二元复合物与ca²⁺螯合物在连续模拟胃肠道条件下的钙离子释放动力学曲线，酪蛋白磷酸肽与ca²⁺螯合物为空白，浓度均为50mg/l。

具体实施方式：

下面通过具体实施例对本发明作进一步详述，以下实施例只是描述性的，不是限定性的，不能以此限定本发明的保护范围。

实施例1：

具体实施方式：

步骤1：原料混合

将酪蛋白磷酸肽与葡聚糖质量比为3:5，溶解于2mol/l的磷酸盐缓冲溶液中，酪蛋白磷酸肽的浓度为1mg/ml，调节混合液ph至7。

步骤2：搅拌

将混合液置于90℃加热条件下搅拌3h，必要时磁力搅拌，使溶液充分反应。

步骤3：冷却

待反应物反应完全后，使用冰水使混合液迅速降温，停止反应。

步骤4：离心

离心机设置转速为4000r/min，将冷却后的混合液在此条件下离心15min，除去沉淀，得到上清液备用。

步骤5：透析

将离心得到的上清液经蒸馏水流水透析25h(透析袋阻截分子量为6000-8000da)。

步骤6：冷冻干燥

将蒸馏水透析24h后的物质置于冷冻干燥机中进行冷冻干燥。干燥后即得能促钙吸收的酪蛋白磷酸肽-葡聚糖营养递送系统。

表1不同反应物配比、加热时间、加热温度、反应ph条件下制备的酪蛋白磷酸肽-葡聚糖二元复合物的粒径及稳定性分析结果

注：结果以均值±标准差表示，不同小写字母表示差异有显著性(p＜0.05)

表2酪蛋白磷酸肽-葡聚糖二元复合物在模拟胃部条件下的钙离子释放性能

注：结果以均值±标准差表示，不同小写字母表示差异有显著性(p＜0.05)

以上所述的仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。