klenow(exo-)蛋白在RAA检测体系中的应用的制作方法

本发明涉及生物技术领域，更具体的说是涉及klenow(exo-)蛋白在raa检测体系中的应用。

背景技术：

重组酶介导链替换核酸扩增技术(raa技术)，是一种利用体内扩增技术实现在核酸体外快速扩增的新型扩增技术，利用从细菌或真菌中获得的重组酶，在常温下，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板dna上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链dna结合蛋白的帮助下，打开模板dna的双链结构，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链，扩增产物以指数级增长。raa技术能在常温下以较短的时间实现核酸快速扩增，扩增产物可以通过琼脂糖凝胶电泳或实时荧光检测实现目的基因的快速检测。

klenow(exo-)是一种中温聚合酶，该酶采用突变方式去除了校正核酸酶活性(3’-5’)和(5’-3’)缺口平移酶活性具有链置换活性。

因此提供一种将klenow蛋白应用于raa技术的方法，用于区分实际样本是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种基于klenow(exo-)蛋白的raa检测体系在区分实际样本中的应用，利用大肠杆菌表达系统可以获得高纯度的klenow(exo-)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低，将klenow(exo-)蛋白结合raa快速扩增技术能用于区分牦牛和水牛。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

klenow(exo-)蛋白在raa检测体系中的应用，利用klenow(exo-)蛋白作为所述raa检测体系中的聚合酶，能够用于区分牦牛和水牛。

进一步，一种基于klenow(exo-)蛋白的raa检测体系用于区分牦牛和水牛，具体步骤如下：

(1)以线粒体cytb基因(水牛：kr010068.1；牦牛：ab542193.1)为靶基因，根据水牛和牦牛序列的差异设计引物，引物序列如下：

f：5’-tgaaacttyggctcyctcctaggca-3’；seqidno：1；

r：5’-aatgatatttgtcctcatggtagtacgtat-3’；seqidno：2；

y为兼并碱基；

(2)分别以牦牛和水牛的基因组dna为模板，配制反应体系：

50ul扩增反应体系包括50pmol引物f，50pmol引物r，1mmol/ldntp，90ng/μlssb蛋白，120ng/μlreca重组酶蛋白，120ng/μlklenow(exo-)聚合酶蛋白，反应缓冲液，加水至50ul；

(3)扩增：将步骤(2)的反应体系摇匀，放置于37℃培养40min；

(4)琼脂糖凝胶电泳检测：将步骤(3)中扩增结束后的反应液进行离心，其中最上层上清为扩增产物，将所述扩增后产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测。

进一步，所述反应缓冲液的组分为：100mmol/ltricine，ph8.0；100mmol/l醋酸镁；5mmol/l二硫苏糖醇；5％peg35k；2.5mmol/latp；100ng/μl肌酸激酶。

进一步，步骤(4)所述离心方法为：12000rpm，离心5-10min。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了一种基于klenow(exo-)蛋白的raa检测体系在区分牦牛和水牛中的应用，具有如下技术优点：

本发明提供了一种基于klenow(exo-)蛋白的raa检测体系在区分牦牛和水牛中的应用，利用大肠杆菌表达系统可以获得高纯度的klenow(exo-)蛋白，目的蛋白在大肠杆菌系统中表达量较高，纯化工艺简单，生产成本极低，将klenow(exo-)蛋白结合raa快速扩增技术能用于区分牦牛和水牛。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1附图为本发明ptrc99a-klenow(exo-)质粒构建示意图；

图2附图为本发明pcr法获取突变位点；

其中，1-4：pcr片段1；5-8：pcr片段2；m：2000bp核酸marker；

图3附图为本发明overlappcr获得目的片段；

其中，1-7：overlappcr结果；m：2000bp核酸marker；

图4附图为本发明重组质粒的双酶切鉴定；

其中，1：重组质粒双酶切后；2：重组质粒双酶切前；m：2000bp核酸marker；

图5附图为本发明工程菌株诱导表达检测图；

其中，1：未诱导对照沉淀；2：未诱导对照上清；3：诱导1号菌沉淀；4：诱导2号菌上清；5：诱导2号菌沉淀；6：诱导1号菌上清；m：蛋白marker；

图6附图为本发明目的蛋白镍柱纯化图；

其中，1：破碎后沉淀；2：0mm咪唑洗脱；3：20mm咪唑洗脱；4：40mm咪唑洗脱；5：100mm咪唑洗脱；6：500mm咪唑洗脱；m：蛋白marker；

图7附图为本发明目的蛋白肝素柱纯化图；

其中，1-4：heparine柱线性洗脱目的蛋白；

图8附图为本发明基于klenow(exo-)蛋白的raa检测体系扩增结果；

其中，1，2：水牛10ng模板；3，4：牦牛10ng模板；5，6：水牛1ng模板；7，8：牦牛1ng模板；m：2000bp核酸marker；

图9附图为本发明pcr扩增结果；

其中，1，2：牦牛10ng模板；3，4：牦牛1ng模板；5，6：水牛10ng模板；7，8：水牛1ng模板；m：2000bp核酸marker。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1klenow(exo-)蛋白的表达和纯化

(1)目的片段的扩增

以大肠杆菌bl21基因组为模板，分别用引物f1，r1和f2，r2进行pcr扩增，扩增后分别获得片段1和片段2(片段1为klenow(exo-)蛋白酶i，片段2为包含两个氨基酸突变的一小段序列)，进行胶回收。通过pcr方式引入突变位点，设计引物时使两个片段带有20bp左右的同源重组区域，pcr扩增获得大小分别为1725bp的片段1(seqidno：3)，和132bp的片段2(seqidno：4)，结果见图2。片段1扩增参数为94℃5min；94℃40s，57℃40s，72℃2min，共32个循环；72℃10min。片段2扩增参数为94℃5min；94℃40s，57℃40s，72℃30s，共32个循环；72℃10min。

然后以回收的片段1和片段2等比例混合为模板，以f2和r1为上下游引物进行over-lappcr，获得大小约2000bp的klenow(exo-)目的片段(seqidno：5)，结果见图3。反应体系均为25ul，反应后产物以1.5％的琼脂糖凝胶电泳，电泳后以胶回收试剂盒回收klenow(exo-)目的片段pcr产物。over-lappcr扩增参数为94℃5min；94℃40s，54℃40s，72℃2min，共32个循环；72℃10min。

其中，引物序列如下：

f1：5’-aagcgccggtatttgcatttgctaccgcaaccgacagccttgataacat-3’；seqidno：6；

r1：5’-cccaagcttttagtgcgcctgatcccagttttcg-3’；hindiii；seqidno：7；

f2：5’-catgccatggatcatcatcaccatcaccacatgatttctta

tgacaactacgtcacca-3’；ncoi；seqidno：8；

r2：5’-aaatgcaaataccggcgctttttccag-3’；seqidno：9。

(2)重组表达质粒的构建及诱导表达

以质粒提取试剂盒提取ptrc99a质粒载体，然后以ncoi，hindiii限制性内切酶分别双酶切质粒载体和胶回收的klenow(exo-)目的片段。酶切体系如下：质粒载体或klenow(exo-)目的片段1ug，限制性内切酶各1ul，10×buffer2ul，补加去离子水至总体积20ul。酶切后产物以纯化试剂盒纯化。将酶切后的klenow(exo-)目的基因片段和线性化后的质粒载体以2:1的比例配制10ul连接体系。连接反应条件为25℃连接3h。其中，ptrc99a-klenow(exo-)质粒构建示意图如图1所示。

连接产物转化大肠杆菌克隆菌株：连接反应结束后将连接产物加入100uldh5α感受态细胞中，冰浴30min后42℃热激90s，冰浴2min，加入500ullb培养基。37℃200r/min摇床培养1h后，取200ul菌液涂布于含氨苄抗性的lb平板上，37℃恒温培养箱过夜培养。

挑取单克隆至lb培养基中，培养至od600＝0.6左右。取1ul菌液作为模板，以f2、r1为引物进行菌落pcr鉴定，阳性克隆可见2000bp的条带。对阳性克隆质粒进行双酶切，结果如4所示，经双酶切后明显可见约2000bp目的条带及4000bp线性化质粒条带。并将双酶切验证正确的阳性菌落送至杭州擎科生物科技有限公司测序，将测序正确无突变的阳性克隆菌株冻存种子并提取质粒。将提取的质粒转化至大肠杆菌rosetta(de3)表达菌株中。

挑取转化后的2个单菌落(命名为1号菌和2号菌)分别接种至5mllb培养基中，培养至od600为0.6，加入终浓度为0.5mmol/liptg，对照不加iptg，于37℃诱导4h，收集少量菌体，超声破碎菌体后离心，分离上清液与沉淀，将破碎后上清和沉淀加入loadingbuffer沸水浴3-5min后进行sds-page，鉴定诱导表达结果。sds-page结果表明，工程菌在37℃经iptg诱导4h后，超声破碎取上清及沉淀进行sds-page，在约65kda处有明显的目的蛋白条带，与预期的klenow(exo-)蛋白大小一致，结果见图5。

(3)阳性克隆菌的摇瓶发酵及klenow(exo-)蛋白的纯化

挑单克隆菌接种至100mllb培养基中，37℃200r/min过夜培养作为一级种子，然后将一级种子以2％的比例接种至600mllb培养基中，共接种6瓶。37℃200r/min培养至od600为0.6，加入终浓度为0.5mmol/liptg，于37℃诱导4h。

在4℃，6000rpm条件下离心30min，弃上清，收集菌体；用破碎缓冲液(缓冲液a：30mmpb(ph7.4)，20mm咪唑，500mm氯化钠)重悬菌体；将重悬后菌液以ats高压均质机(800mpa，4℃)破碎3次；打开离心机预冷后以4℃，16000rpm离心破碎液，离心后液体用镍柱做亲和层析。分别用缓冲液(b:30mmpb(ph7.4)，40mm咪唑，500mm氯化钠，c:30mmpb(ph7.4)，100mm咪唑，500mm氯化钠，d：30mmpb(ph7.4)，500mm咪唑，500mm氯化钠)洗脱；洗脱后将目的蛋白透析至缓冲液e中(e：20mmtris，50mm氯化钾，1mmdtt，1mmedta)。

透析后以缓冲液e为平衡液，以缓冲液f(e：20mmtris，2m氯化钾，1mmdtt，1mmedta)为洗脱液线性洗脱。洗脱后目的蛋白再次透析至e缓冲液中，sds-page检测。冻存至-80℃冰箱中待用。

镍柱亲和层析后，sds-page结果显示，在65kda处40mm，100mm咪唑洗脱液中均有明显的目的蛋白且位置正确，其中100mm咪唑洗脱的目的蛋白纯度较高，如图6所示。可用于目的蛋白的进一步纯化。

通过ge公司预装柱heparinehp除去部分目的蛋白中残留的核酸，并对目的蛋白进行进一步的精细纯化。

经上述两步纯化后获得纯度相对较高的目的蛋白，结果如图7所示，可用于进一步的活性检测。图7中1-4来源于同一个蛋白洗脱峰，其中1、4分别为蛋白刚起峰和最后峰落下来时的样品，2、3为峰最高点时的蛋白，因取样时间不同，导致浓度不同。

实施例2基于klenow(exo-)蛋白的raa检测体系在区分牦牛和水牛中的应用

(1)以线粒体cytb基因(水牛：kr010068.1；牦牛：ab542193.1)为靶基因，根据水牛和牦牛序列的差异设计引物，引物序列如下：

f：5’-tgaaacttyggctcyctcctaggca-3’；seqidno：1；

r：5’-aatgatatttgtcctcatggtagtacgtat-3’；seqidno：2；

y为兼并碱基；

f引物与水牛靶序列匹配，与牦牛靶序列在3端有两个连续突变，r序列与水牛，牦牛靶序列均完全匹配；

(2)提取基因组dna

分别称取30mg的水牛肉和牦牛肉加入组织裂解液f(biog组织dna提取试剂盒，百代生物)中，70℃水浴20min，12000rpm离心10min，取上清用水稀释至10^-1，10^-2分别检测核酸浓度约为10ng，1ng；以此为模板，配制反应体系：

50ul扩增反应体系包括50pmol引物f，50pmol引物r，1mmol/ldntp，90ng/μlssb蛋白，120ng/μlreca重组酶蛋白，120ng/μlklenow(exo-)聚合酶蛋白，反应缓冲液，加水至50ul；反应缓冲液的组分为：100mmol/ltricine，ph8.0；100mmol/l醋酸镁；5mmol/l二硫苏糖醇；5％peg35k；2.5mmol/latp；100ng/μl肌酸激酶；

(3)扩增：将步骤(2)的反应体系摇匀，放置于37℃培养40min；

(4)琼脂糖凝胶电泳检测：将上述扩增结束后的反应液进行离心，12000rpm离心5-10min，其中最上层上清为扩增产物，将所述扩增后产物用琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图8所示，表明基于klenow(exo-)蛋白的raa检测体系能明显区分牦牛和水牛。

利用pcr对牦牛和水牛分别进行检测，pcr反应体系：核酸浓度为10ng或1ng的模板，50pmol引物f，50pmol引物r，200umol/ldntp，1.5mmol/l镁离子，120ng/μltaqdan聚合酶(购自生工生物)，10×buffer5ul(购自生工生物)，加水至50ul；pcr反应条件：94℃5min，94℃40s，57℃40s，72℃2min，共32个循环，72℃延伸10min。检测结果如图9所示，pcr体系均能扩增，无法有效区分牦牛和水牛。

上述结果表明，本发明的raa反应体系对于snp的检测效果明显。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

序列表

<110>浙江善测禾骑士生物科技有限公司

<120>klenow(exo-)蛋白在raa检测体系中的应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

tgaaacttyggctcyctcctaggca25

<210>2

<211>30

<212>dna

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<400>2

aatgatatttgtcctcatggtagtacgtat30

<210>3

<211>1725

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

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cgcgagcgtgcactcgagttgctaaaaccgctgctggaagatgaaaaggcgctgaaggtc180

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atggacagcctcgcggaacgttggttgaagcacaaaaccatcacttttgaagagattgct360

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gccgccgaagatgcagatgtcaccttgcagttgcatctgaaaatgtggccggatctgcaa480

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tcacgcattgaacgtaacggtgtgaagatcgatccgaaagtgctgcacaatcattctgaa600

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tttaacctttcttccaccaagcagttacaaaccattctctttgaaaaacagggcattaaa720

ccgctgaagaaaacgccgggtggcgcgccgtcaacgtcggaagaggtactggaagaactg780

gcgctggactatccgttgccaaaagtgattctggagtatcgtggtctggcgaagctgaaa840

tcgacctacaccgacaagctgccgctgatgatcaacccgaaaaccgggcgtgtgcatacc900

tcttatcaccaggcagtaactgcaacgggacgtttatcgtcaaccgatcctaacctgcaa960

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tcgcgtgacaaaggcttgctgaccgcattcgcggaaggaaaagatatccaccgggcaacg1140

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cgggcgatgattgccgttgatgcgtggttacaggctgagcaaccgcgtgtacgtatgatc1560

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aagcagattcatcaactgatggaaaactgtacccgtctggatgtgccgttgctggtggaa1680

gtggggagtggcgaaaactgggatcaggcgcactaaaagcttggg1725

<210>4

<211>132

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

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cttgatgaagaaacactgaaagcgtggattgcgaagctggaaaaagcgccggtatttgca120

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<210>5

<211>1857

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>5

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cttgatgaagaaacactgaaagcgtggattgcgaagctggaaaaagcgccggtatttgca120

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gctcgtcgtgcagcggctgaacgtgcagccattaacgcgccaatgcagggaaccgccgcc1620

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gatgccgtcgcgaagcagattcatcaactgatggaaaactgtacccgtctggatgtgccg1800

ttgctggtggaagtggggagtggcgaaaactgggatcaggcgcactaaaagcttggg1857

<210>6

<211>49

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<400>7

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<212>dna

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<400>9

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