一种降低分析背景信号的荧光探针的制作方法

本发明属于生物化学与分子生物学领域，具体涉及一种降低分析背景信号的荧光探针。
背景技术：
：当一个荧光分子(又称为供体分子)的荧光光谱与另一个荧光分子(又称为受体分子)的激发光谱相重叠时，供体荧光分子的激发能诱发受体分子发出荧光，同时供体荧光分子自身的荧光强度衰减，这种现象称为荧光共振能量转移(fret)现象。fret程度与供、受体分子的空间距离紧密相关，一般为7～10nm时即可发生fret；随着距离延长，fret呈显著减弱。fret杂交探针可用于对待测序列进行检测(matthews,jaanalyticalbiochemistry169(1988)1-25)，其特征为同时使用与待测序列同一链互补相邻位点互补的两个单链杂交探针对，两个探针用不同荧光成分标记，当特定波长激发时，第一种成分(供体)将吸收的能量转移到第二种成分(受体)上，通过检测第二种成分的荧光发射量对待测序列的量进行检测。当退火到靶序列时，杂交探针之间必须非常接近，通常第一个探针标记的3`端和第二个探针的5`端间隙为1-5个碱基，约10-100埃。除进行实时pcr外，fret杂交探针还可用于熔解曲线分析，当杂交探针结合到靶序列上时，受体基团通过fret原理发射出荧光，在解链温度时，杂交探针从靶序列上脱离，受体集团的荧光信号降低，通过求导观察荧光信号降低的最大值来判读熔解温度(tm)值。fret杂交探针一般使用两个荧光基团分别作为供体和受体，通过检测受体基团荧光信号的上升来判读结果，而非使用一个荧光基团和一个无荧光淬灭基团，通过检测供体荧光信号的下降来判读结果。主要原因之一是当携带荧光集团的单链探针与靶序列杂交时，互补序列上的寡核苷酸尤其是鸟嘌呤可有效淬灭荧光基团，造成荧光明显下降，从而干扰另一条探针的淬灭基团对荧光基团的淬灭效果，即荧光基团可同时被互补的寡核苷酸和淬灭基团淬灭，从而无法判断荧光信号的下降是否由淬灭基团淬灭引起。针对这种现象，wo2002014555a2提供了一种探针修饰及检测方法，即舍弃无荧光淬灭基团修饰的探针，只使用一条荧光基团修饰的探针，利用互补序列上的碱基尤其是鸟嘌呤淬灭荧光，通过供体基团的荧光变化来检测核酸，从而规避了供体基团的荧光被双重淬灭无法区分的问题，但使用单条探针杂交检测的特异度明显不如同时使用两条探针同时杂交的特异度高，可能因为非特异性杂交导致出现假阳性信号，其次由于不同荧光基团化学性质不一，受互补链寡核苷酸淬灭的效果不如特定的淬灭基团明显，从而影响了其使用范围。技术实现要素：本发明的目的是提供一种能避免荧光基团被互补链上的碱基淬灭，使该荧光基团的荧光变化仅由第二条探针上的无荧光淬灭基团所影响，从而保证了荧光信号变化来源的单一性，使检测结果更为可靠的荧光探针。本发明通过在携带供体荧光基团的探针上增加一段不与待检测靶序列或第二条携带无荧光淬灭基团探针互补的空间子(碱基片段或其它化学结构)，使携带供体荧光基团的碱基或其它化学基团在探针杂交时处于游离状态，避免与待检测靶序列杂交并保持一定空间距离，从而避免了该荧光基团被互补链上的碱基淬灭，使该荧光基团的荧光变化仅由第二条探针上的无荧光淬灭基团所影响，从而保证了荧光信号变化来源的单一性，使检测结果更为可，从而实现了本发明的目的。本发明的第一个目的是提供一种荧光探针，包括探针序列和探针序列3`端的供体荧光基团，其特征在于，在探针序列和荧光供体基团之间还连有一个空间子，所述的空间子为一段不与待检测靶序列或第二条携带无荧光淬灭基团探针互补的碱基片段或其它化学结构。优选，所述的荧光探针，是探针序列、空间子、腺嘌呤a和供体荧光基团顺序相连。优选，所述的空间子优选为3-8个碱基的碱基片段。本发明的第二个目的是提供一种fret杂交探针，其包括上游探针和下游探针，其特征在于，所述的上游探针，其包括探针序列和探针序列3’端的供体荧光基团，其特征在于，在探针序列和荧光供体基团之间还连有一个空间子，所述的空间子为一段不与待检测靶序列或第二条携带无荧光淬灭基团探针互补的碱基片段或其它化学结构；所述的下游探针，包括探针序列和5’端的无荧光淬灭基团。本发明利用对携带供体荧光基团的探针进行修饰，使携带供体荧光基团的空间子不与待检测的核酸序列杂交，从空间上远离互补链上的寡核苷酸，从而降低携带供体荧光基团的荧光探针与互补链杂交时产生的荧光变化，借此消除互补链寡核苷酸对荧光基团淬灭的影响，使该荧光基团的荧光变化仅由第二条探针上的无荧光淬灭基团所影响，使检测结果更为可靠，在荧光实时监控和后续熔解曲线分析过程中检测背景降低，从而提高检测质量。与一般设计方法的fret探针相比，本发明使用无荧光淬灭基团作为受体基团，无荧光淬灭基团可有效淬灭供体荧光基团的荧光，通过荧光实时监测或熔解曲线分析，可有效检测待检测靶序列，且当携带无荧光淬灭基团的第二条探针并未杂交时，没有明显的背景信号，不会因为供体荧光基团的荧光被核苷酸淬灭而出现假阳性结果。附图说明：图1是seq1和seq3同时与seq4杂交后熔解曲线分析；图2是seq1单独与seq4杂交后熔解曲线分析；图3是seq2和seq3同时与seq4杂交后熔解曲线分析；图4是seq2单独与seq4杂交后熔解曲线分析。具体实施方式：以下实施是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。实施例1：1、设计并合成以下序列：seq1：ccggcgcatcgct-fam；seq2：ccggcgcatcgct-sp18-a-fam；seq3：bhq1-gactcggccatgtgtctatttactaccaaggtgcggcctctcacaagg-pho；seq4：ccttgtgagaggccgcaccttggtagtaaatagacacatggccgagtcccggtgtaggctgagcgatgcgccggtcgta。seq1为通常方法设计的fret探针，3`端携带供体荧光基团fam。seq2为本方法设计的fret探针，在本实施例中为在seq1基础上3`端连接一个空间子sp18，再连接一个腺嘌呤a，在连接一个供体荧光基团fam。seq3为第二条fret探针，5`端携带无荧光淬灭基团bhq1作为受体探针，3`端磷酸化封闭。seq4为seq1或seq2，与seq3可同时互补杂交的反向互补序列。2、设置以下实验组：a、seq1和seq3同时和seq4杂交；b、seq1单独与seq4杂交；c、seq2和seq3同时与seq4杂交；d、seq2单独与seq4杂交；杂交反应体系为：2x杂交缓冲液12.5ul杂交序列5pmol/每种ddh2o补齐至25ul反应程序为：95度2分钟30-85度8秒每度，收集荧光再检测荧光信号，a、b、c、d组的实验结果如图1、2、3、4所示，从图1、2、3、4可见与一般设计的fret探针相比，本发明可明显降低荧光供体探针被互补链上的核苷酸荧光淬灭的现象，当第二条探针未与待检测序列杂交时，荧光强度在荧光供体探针杂交或解离时没有明显变化。而一般设计的fret探针由于上述原因，即时携带无荧光淬灭基团的受体探针并未杂交时，仍出现明显的荧光变化，造成背景干扰。在整个熔解曲线分析中，低温杂交时，荧光供体探针(携带供体荧光基团的探针)，荧光受体探针(无荧光淬灭基团作为受体基团)分别与互补链连接，空间位置接近，发生fret现象，荧光供体探针供体基团发出的荧光被荧光受体基团的受体基团吸收，供体基团荧光下降，受体基团荧光上升。随着温度逐渐增加，供体基团和受体集团逐渐从互补链上解离，fret现象逐渐消失，供体基团荧光下降和受体基团荧光上升程度不断减弱，在tm值温度附近达到最高峰，形成图上的熔解峰。最终荧光供体探针和荧光受体探针完全从互补链解离，空间距离增大，fret现象消失。当前第1页12