一种菊花内生真菌的分离提纯方法与流程

本发明涉及微生物技术领域，具体来说，涉及一种菊花内生真菌的分离提纯方法。

背景技术：

菊花是一种重要的要用植物，具有抗菌、抗炎、抗氧化、舒血管、降血脂、抗肿瘤、驱铅等多种药理作用。随着国内外医药加工业的迅猛发展，药用菊花用量急剧增加。而近年来，在菊花种植的主产区已经出现菊花生长势下降，致其抗病性若，产量急剧下降的现象，无法满足市场需求。研究发现，植物为内生菌提供光合产物和矿物质。

中国发明专利cn103122331a公开的一种植物内生菌的分离方法，采用组织研磨方法进行培养，但在实际操作中，对植物组研磨处理往往采取的是经验值，并未充分考虑到不同植物或植物的不同组织，在不同的生育期因其结构或生理特性的不同而造成的处理效果特异性，造成不合适的机械外力操作导致菌株细胞损伤或使得内生真菌不能充分释放出来，因而，常常导致所分离获取的植物内生菌种类和数量降低。另外，含菌液涂布培养过程中，若浓度过高而出现真菌生长相互干扰的问题；若浓度过低而出现消耗大量培养基，增加人力和物力成本。

针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

技术实现要素：

针对相关技术中的问题，本发明提出一种菊花内生真菌的分离提纯方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。

为此，本发明采用的具体技术方案如下：

一种菊花内生真菌的分离提纯方法，包括以下步骤：

选用健康的菊花植物进行采集，采集部位包括根、茎、叶和花；所述根和茎的长度为5cm以上，所述叶和花的面积为1.5cm以上×1cm以上；

将准备好的菊花原材料均匀分成两份，得到叶和花的原材料一和根和茎的原材料二；

将所述原材料一去除边缘，裁剪成组织块，无菌水冲洗后，即得待分离内生真菌的叶花样品，将其存放无菌袋中于4℃保存；

将所述菊花叶花样品以有效氯含量为10-15％的次氯酸钠水溶液浸泡3-4min，无菌水洗涤3-5次，再以体积百分比为70-75％的酒精水溶液浸泡1-1.5min，无菌水洗涤3-5次进行消毒；

将消毒后的叶花样品边缘部分去除，得到待分离菊花样品；

将所述待分离菊花样品平放于pda基板中，将pda基板放置在23±2℃的恒温培养箱中培养，制得培养基一；

待所述培养基一的组织边缘长菌后进行内生真菌分离纯化操作，制得菌落培养基；

将所述原材料二剪取嫩茎，并用清水冲洗晾干后，用无菌水对原材料二清洗2～4次，将样品边缘部分去除，内部或中心部分切分成1cm×1cm大小的组织块，得到株茎样品；

将所述株茎样品在25℃黑暗条件下放入三角瓶中培养3-6天后，制得培养基二，并将所述培养基二置于预先准备好的恒温培养箱中培养；

将所述菌落培养基采用预先准备好的打孔器制得菌片，同时将所述菌片放置在所述培养基二中进行培养，并设置平行组和对照组；

根据所述平行组和所述对照组中有无菌丝的产生及菌丝的多少进行筛选分离操作；

将筛选分离后的培养基二长出真菌后，挑入斜面培养基中进行纯化培养，通过3～6次连续的菌丝尖端转移进行纯化，制得纯化后的内生真菌；

将得到的菊花内生真菌进行its测序鉴定，并在25℃黑暗条件下培养4-7天后，放无菌袋中于4℃保存。

进一步的，所述组织块的长宽大小为0.5厘米*0.5厘米，并且，所述组织块的茎上含有2-3个侧芽。

进一步的，所述菊花样品在消毒时依次采用75％的乙醇和0.1％的汞进行表面擦拭操作。

进一步的，所述pda基板在制作时，用电子秤称取预先准备好的去皮的土豆100克，煮沸30分钟，采用纱布过滤，并将过滤后的滤液进行加热，并加入琼脂7.5克，待琼脂完全融化后加入预先准备好的葡萄糖10克，待冷却后加入500毫升蒸馏水，制得所述pda基板。

进一步的，所述pda基板在使用之前采用高温灭菌操作。

进一步的，所述嫩茎在消毒时依次采用75％的乙醇表面擦拭1分钟和0.1％的汞表面擦拭7分钟操作。

进一步的，所述培养基二置于所述恒温培养箱中培养时，其温度为23-25摄氏度，相对湿度为60％-70％，光照时间为12小时，光照强度开灯为1500-2500勒克斯或不开灯为200-500勒克斯。

进一步的，所述打孔器的直径为0.45毫米，并且，所述打孔器在所述菌落培养基的表面选取菌落较多位置处进行打孔制得菌片。

进一步的，所述平行组为四组，所述对照组为两组。

进一步的，当所述平行组产生少量菌丝时，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一培养基二中培养。

本发明的有益效果为：

(1)、通过对菊花样品中的内生真菌进行分离，从而较为真实地反映菊花内生菌的生物学特征，通过这种方法分离得到的菊花内生真菌的比例显著高于目前普遍采用的抗生素平板分离法。

(2)、实现了无孢内生真菌的有效分离，提高了菊花内生真菌的比例，克服了现有菊花内生真菌的分离方法存在的菊花内生真菌丢失的缺陷。

(3)、根据不同菊花样品采用不同的表面消毒处理，菊花样品的表面消毒方法既能保证充分消毒，达到充分去除表面污染菌的目的，避免表面菌污染，又能避免表面消毒过头，将部分内生真菌杀死，既解决了环境污染菌或表面菌干扰的问题，又克服了现有菊花内生真菌的分离方法存在的某些菌种的丢失的缺陷。

(4)、本发明的提供的菊花内生真菌的分离方法，操作简单快捷，成本较低。

(5)、本发明提供的菊花内生真菌的分离方法，能够有效分离菊花内生真菌，利用分离得到的内生真菌通过发酵技术生产相应的活性物质，对环境资源可持续发展有很重大的意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是根据本发明实施例的一种菊花内生真菌的分离提纯方法的流程图之一；

图2是根据本发明实施例的一种菊花内生真菌的分离提纯方法的流程图之二。

具体实施方式

为进一步说明各实施例，本发明提供有附图，这些附图为本发明揭露内容的一部分，其主要用以说明实施例，并可配合说明书的相关描述来解释实施例的运作原理，配合参考这些内容，本领域普通技术人员应能理解其他可能的实施方式以及本发明的优点，图中的组件并未按比例绘制，而类似的组件符号通常用来表示类似的组件。

根据本发明的实施例，提供了一种菊花内生真菌的分离提纯方法。

现结合附图和具体实施方式对本发明进一步说明，如图1-2所示，根据本发明实施例的菊花内生真菌的分离提纯方法，包括以下步骤：

步骤s101，采集部位包括根、茎、叶和花；所述根和茎的长度为5cm以上，所述叶和花的面积为1.5cm以上×1cm以上；

步骤s103，将预先准备好的菊花原材料均匀分成两份，得到叶和花的原材料一和根和茎的原材料二；

步骤s105，将所述原材料一去除边缘，裁剪成组织块，无菌水冲洗后，即得待分离内生真菌的叶花样品，将其存放无菌袋中于4℃保存；

步骤s107，将所述菊花叶花样品以有效氯含量为10-15％的次氯酸钠水溶液浸泡3-4min，无菌水洗涤3-5次，再以体积百分比为70-75％的酒精水溶液浸泡1-1.5min，无菌水洗涤3-5次进行消毒；

步骤s109，将消毒后的叶花样品边缘部分去除，得到待分离菊花样品；

步骤s111，将所述待分离菊花样品平放于pda基板中，将pda基板放置在23±2℃的恒温培养箱中培养，制得培养基一；

步骤s113，待所述培养基一的组织边缘长菌后进行内生真菌分离纯化操作，制得菌落培养基；

步骤s115，将所述原材料二剪取嫩茎，并用清水冲洗晾干后，用无菌水对原材料二清洗2～4次，将样品边缘部分去除，内部或中心部分切分成1cm×1cm大小的组织块，得到株茎样品；

步骤s117，将所述株茎样品在25℃黑暗条件下放入三角瓶中生根培养3-6天后，制得培养基二；

步骤s119，将所述菌落培养基采用预先准备好的打孔器制得菌片，同时将所述菌片放置在所述培养基二中进行培养，并设置平行组和对照组；

步骤s121，根据所述平行组和所述对照组中有无菌丝的产生及菌丝的多少进行筛选分离操作；

步骤s123，将筛选分离后的培养基二长出真菌后，挑入斜面培养基中进行纯化培养，通过3～6次连续的菌丝尖端转移进行纯化，制得纯化后的内生真菌；

步骤s125，将得到的菊花内生真菌进行its测序鉴定，并在25℃黑暗条件下培养4-7天后，放无菌袋中于4℃保存。

在一个实施例中，所述培养基一和所述培养基二均为天然培养基。

在一个实施例中，所述组织块的长宽大小为0.5厘米*0.5厘米，并且，所述组织块的茎上含有2-3个侧芽。

在一个实施例中，所述菊花样品在消毒时依次采用75％的乙醇和0.1％的汞进行表面擦拭操作。

在一个实施例中，所述pda基板在制作时，用电子秤称取预先准备好的去皮的土豆100克，煮沸30分钟，采用纱布过滤，并将过滤后的滤液进行加热，并加入琼脂7.5克，待琼脂完全融化后加入预先准备好的葡萄糖10克，待冷却后加入500毫升蒸馏水，制得所述pda基板。

在一个实施例中，所述pda基板在使用之前采用高温灭菌操作。

在一个实施例中，所述嫩茎在消毒时依次采用75％的乙醇表面擦拭1分钟和0.1％的汞表面擦拭7分钟操作。

在一个实施例中，所述培养基二置于所述恒温培养箱中培养时，其温度为23-25摄氏度，相对湿度为60％-70％，光照时间为12小时，光照强度开灯为1500-2500勒克斯或不开灯为200-500勒克斯。

在一个实施例中，所述打孔器的直径为0.45毫米，并且，所述打孔器在所述菌落培养基的表面选取菌落较多位置处进行打孔制得菌片。

在一个实施例中，所述平行组为四组，所述对照组为两组。

在一个实施例中，当所述平行组产生少量菌丝时，及时采用菌丝尖端挑取法将其转入另一培养基二中培养。

综上所述，借助于本发明的上述技术方案，通过对菊花样品中的内生真菌进行分离，从而较为真实地反映菊花内生菌的生物学特征，通过这种方法分离得到的菊花内生真菌的比例显著高于目前普遍采用的抗生素平板分离法。实现了无孢内生真菌的有效分离，提高了菊花内生真菌的比例，克服了现有菊花内生真菌的分离方法存在的菊花内生真菌丢失的缺陷。根据不同菊花样品采用不同的表面消毒处理，菊花样品的表面消毒方法既能保证充分消毒，达到充分去除表面污染菌的目的，避免表面菌污染，又能避免表面消毒过头，将部分内生真菌杀死，既解决了环境污染菌或表面菌干扰的问题，又克服了现有菊花内生真菌的分离方法存在的某些菌种的丢失的缺陷。本发明的提供的菊花内生真菌的分离方法，操作简单快捷，成本较低。本发明提供的菊花内生真菌的分离方法，能够有效分离菊花内生真菌，利用分离得到的内生真菌通过发酵技术生产相应的活性物质，对环境资源可持续发展有很重大的意义。

在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置”、“连接”、“固定”、“旋接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。