检测马、驴、骡源性成分的荧光定量PCR方法及试剂盒与流程

本发明涉及荧光定量pcr检测技术，具体地说，涉及一种检测马、驴、骡源性成分的荧光定量pcr方法及试剂盒。

背景技术：

驴肉及其制品因具有极高的营养价值和独特的味道而深受人们喜爱。同时毛驴生长周期长，因此驴肉资源缺乏，其价格不断攀升。由于马、驴、骡同属于马科动物，很难从肌肉组织结构方面进行准确辨识，驴肉掺假问题随之而来，以价格较为便宜的马肉和骡肉来代替驴肉的掺假现象最为普遍。因此，建立快速、准确、可靠的鉴别马、驴、骡肉方法显得尤为重要和紧迫。

目前，国内外基于分子生物学为基础的动物源性检测技术日益成熟。这些技术基本是以动物线粒体为靶标。因线粒体既有保守区又有可变区，多拷贝，可提高检测灵敏度，适合于加工制品的分析。这些基于dna的检测技术突破了依据动物纤维结构形态的局限性，更具有客观性和准确性，适用于物种的分类鉴定。国内针对驴肉及其制品源性成分检测标准方法主要有：《sn/t3730.5-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第5部分：马成分检测实时荧光pcr法》；《sn/t3730.4-2013食品及饲料中常见畜类品种的鉴定方法第4部分：驴成分检测实时荧光pcr法》。相关的研究文献也有陆续发表。这些检测方法能分别快速、准确鉴别驴源性和马源性成分。

在针对一些特殊物种，如杂交动物骡子的鉴别时，基于线粒体为靶标的检测方法存在一定程度局限性。线粒体呈严格的母系遗传。骡子是马和驴正反交所生，受精卵的质基因不同，马骡主要由母马卵细胞的线粒体提供，驴骡主要由母驴卵细胞的线粒体提供。因此，利用线粒体基因，仅能区分驴和马源性，无法鉴别骡子源性。因此，以线粒体为靶标的检测方法无法实现骡源性的检测识别。

目前，国内外尚无以核基因为靶标检测马、驴、骡肉源性的荧光定量pcr法的相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种检测马、驴、骡源性成分的荧光定量pcr方法及试剂盒。

为了实现本发明目的，发明人从驴、马及骡子的遗传背景分析入手，以核基因为靶标开展马、驴及骡源性检测方法研究。无论驴骡还是马骡均来自马与驴正反交的产物，受精卵的核基因相同，是由马的32条染色体和驴的31条染色体提供；核基因特别是一些管家基因，如编码肌型肌酸激酶基因(creatinekinasemuscletype，ckm)，具有高度保守性，单拷贝，马和驴此管家基因同源序列遗传具有明显差异性。基于此，以马和驴ckm基因为靶标，建立马、驴及骡源性成分多重荧光定量pcr检测方法，为食品安全监管提供技术支持和保障。

第一方面，本申请提供检测马、驴源性成分的通用引物，包括上游引物和下游引物，核苷酸序列分别如seqidno：1-2所示。

第二方面，本申请提供与上述通用引物配合使用的荧光探针，用于检测马源性成分的荧光探针为5’-f1-aaacaaccggatctttcaagt-q1-3’，用于检测驴源性成分的荧光探针为5’-f2-aaataactggatcttttaagt-q2-3’。

其中，f1、f2为不同的荧光基团，q1、q2为荧光淬灭基团。

在本发明的一个具体实施方式中，f1为fam，f2为vic，q1和q2均为mgb。

第三方面，本申请提供检测马、驴源性成分的试剂盒，所述试剂盒中含有上述通用引物和/或上述荧光探针。

第四方面，本申请提供上述通用引物或上述荧光探针的以下任一应用：

1)在检测畜肉及其制品中马、驴源性成分中的应用；

2)在制备马、驴源性成分的检测试剂或试剂盒中的应用。

第五方面，本申请提供一种检测马、驴、骡源性成分的荧光定量pcr方法，利用上述通用引物和上述荧光探针对单一源性成分样品进行荧光定量pcr检测。

所述方法包括以下步骤：

1)提取待测样品中的dna；

2)以步骤1)中提取的dna为模板，进行荧光定量pcr反应；

3)根据扩增结果判定样品中单一源性成分所对应的物种。

优选地，荧光定量pcr反应的反应体系为：

荧光定量pcr反应的反应程序为：95℃3min；95℃3s，62℃32s，40个循环。

本方法每次检测样本时须设立阴性对照和阳性对照。阴性对照无fam和vic荧光信号检出，无ct值，无扩增曲线；阳性对照中，马、驴阳性对照对应只出现fam、vic荧光信号，各荧光信号有明显扩增曲线，且ct值<35.0；骡阳性对照同时出现fam、vic荧光信号，各荧光信号有明显扩增曲线，且ct值<35.0；如阴性对照和阳性对照条件不满足上述条件，此次实验视为无效。

步骤3)扩增结果的判断标准如下：若检出马源性探针对应的扩增曲线，无驴源性探针对应的扩增曲线，且ct值＜35.0，表明待测样品中含有马源性成分；若检出驴源性探针对应的扩增曲线，无马源性探针对应的扩增曲线，且ct值＜35.0，表明待测样品中含有驴源性成分；若同时检出马源性探针和驴源性探针对应的扩增曲线，且ct值＜35.0，表明待测样品中含有骡源性成分；

若ct值≥35.0判定为阴性，或者无马源性、驴源性探针对应的扩增曲线，且无ct值，判定为阴性，表明待测样品中不含有目标动物源性成分。

第六方面，本申请提供检测马、驴、骡源性成分的试剂盒，所述试剂盒中至少含有上述通用引物、上述荧光探针以及阳性模板，所述阳性模板为马基因组dna、驴基因组dna和骡基因组dna。

进一步地，本申请提供所述试剂盒在荧光定量pcr检测畜肉及其制品中马、驴、骡源性成分中的应用。

本发明的试剂盒可以是由多个隔断所形成，以容纳固定一个或多个如管或小瓶的容器。这些容器之一或者多个可以装有本发明的引物以及荧光探针，根据需要该引物和荧光探针可以是冻干形式或溶于缓冲液中的状态。另外，本发明的试剂盒中还可以包括用于荧光定量pcr反应的一种或多种酶/试剂，以及实施本发明所需要的其它成分及用具，例如dna裂解液、荧光定量反应液、阴性模板、阳性模板，所述阴性模板为双蒸水，所述阳性模板为马基因组dna、驴基因组dna、骡基因组dna。

本发明提供了一种检测马、驴、骡源性成分的双重荧光pcr方法，该方法以肉制品dna为模板，利用通用引物和荧光探针进行双重荧光定量pcr扩增，根据ct值判定结果。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明试剂盒特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度好，为畜肉及其制品中马、驴、骡源性成分的检测提供了新的方法。本发明提供的荧光定量pcr检测技术可以准确快速地实现对畜肉及其制品中骡源性成分的鉴别，1-2h内即可完成检测，具有快速、特异、敏感、高通量、稳定性好等优点，不仅为检测马、驴、骡源性食品提供了新方法，而且能有效抵御肉制品掺假，加大对消费者利益的保护力度。

附图说明

图1为本发明实施例2中马ckm基因两重定量pcr扩增曲线。

图2为本发明实施例2中驴ckm基因两重定量pcr扩增曲线。

图3为本发明实施例2中骡ckm基因两重定量pcr扩增曲线。

图4为本发明实施例3中引物和探针特异性扩增曲线。

图5a-图5c分别为本发明实施例4中两重荧光定量pcr法检测马、驴、骡源性成分的灵敏度扩增曲线。

图6为本发明实施例1中马、驴ckm基因部分序列比对结果。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如sambrook等分子克隆实验手册(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1引物和探针的设计

马和驴属于马属动物，在其骨骼肌中存在许多与运动相关的基因，肌型肌酸激酶基因(creatinekinasemuscleckm)属于在心机和骨骼肌高表达的基因，其编码的肌酸激酶催化磷酸肌酸将adp磷酸化产生atp，为肌肉收缩供能，是转录组表达最为丰富的基因，以此为靶标设计检测引物和探针。从ncbi网站genbank查找马、驴、牛、羊等多种动物ckm基因序列并下载，采用bioedit软件进行序列比对，确定靶区域。同时，考虑马和驴属于马属，亲缘关系近，选取共同的保守序列设计引物通用引物，尽量减少多重pcr体系中引物间的干扰。设计mgb探针增强马和驴探针特异性。共设计了3条引物和3条探针，经过筛选优化，最终确定seqidno:1-4所示引物和探针检测效果最佳。扩增片段长度为217bp，位于ckm基因(genbank:hq336263.1)第281～497位碱基之间。此段序列既含有马、驴共有的保守序列(可据此设计通用引物)，又含有可变碱基序列(用于设计各自探针)。马、驴此段序列的比对结果见图6。

马、驴ckm特异性引物对和taqmanmgb探针，分别命名为马驴ckm:f(p1)、马驴ckm:r(p2)、马核基因ckm探针(p3)、驴核基因ckm探针(p4)。用于双重taqmanmgb实时荧光pcr扩增的引物和探针序列如下(seqidno：1-4)：

马、驴核基因ckm通用引物：

f:5’-tcatcgtagcatcgagggga-3’

r:5’-agcagagcaggaagggagt-3’

马探针p1：5’-fam-aaacaaccggatctttcaagt-mgb-3’

驴探针p2：5’-vic-aaataactggatcttttaagt-mgb-3’

实施例2荧光定量pcr检测方法的建立

(一)提取样品dna

1.取骡肉样本0.2g，尽量剪碎。置于1.5ml离心管中加入1ml的细胞裂解缓冲液，20μl蛋白酶k(500ug/ml)，混匀。在65℃恒温水浴锅中水浴30min，间歇振荡离心管数次。于台式离心机以12000rpm离心5min，取上清液入另一离心管中。

2.加等量的酚，氯仿混合液振荡混匀，12000rpm离心10min。

3.取上层溶液至另一管，加入等体积的氯仿，振荡混匀，12000rpm离心5min。

4.取上层溶液至另一管，加入1/10体积的3m乙酸钠和2倍体积的无水乙醇，混匀后室温沉淀10min，12000rpm离心10min。

5.用移液枪小心吸净上清液。

6.用1ml75％乙醇洗涤沉淀物，12000rpm离心5min。

7.重复步骤5和6。

8.用移液枪器吸净上清液，将沉淀室温干燥5min。

9.加50ulte或ddh2o重新溶解沉淀物，然后置于4℃或-20℃保存备用。

(二)采用实施例1的通用引物和2条探针，以上述dna为模板，以马基因组dna和驴基因组dna为阳性对照，以无核酸双蒸水为阴性对照，建立荧光定量pcr检测体系。

20μl反应体系为：

反应程序为：95℃3min；95℃3s，62℃32s，40个循环。扩增结束后，扣除本底荧光信号后取同一阈值分析数据，确定各样本的ct值。

本方法每次检测样本时须设立阴性对照和阳性对照。阴性对照无fam和vic荧光信号检出，无ct值，无扩增曲线；阳性对照中，马、驴阳性对照对应只出现fam、vic荧光信号，各荧光信号有明显扩增曲线，且ct值<35.0；骡阳性对照同时出现fam、vic荧光信号，各荧光信号有明显扩增曲线，且ct值<35.0；如阴性对照和阳性对照条件不满足上述条件，此次实验视为无效。

扩增结果的判断标准如下：若检出马源性探针对应的扩增曲线，无驴源性探针对应的扩增曲线，且ct值＜35.0，表明待测样品中含有马源性成分(图1)；若检出驴源性探针对应的扩增曲线，无马源性探针对应的扩增曲线，且ct值＜35.0，表明待测样品中含有驴源性成分(图2)；若同时检出马源性探针和驴源性探针对应的扩增曲线，且ct值＜35.0，表明待测样品中含有骡源性成分(图3)。

若ct值≥35.0判定为阴性，或者无马源性、驴源性探针对应的扩增曲线，且无ct值，判定为阴性，表明待测样品中不含有目标动物源性成分。

实施例3特异性试验

采用实施例1的引物和探针，以马、驴、骡基因组dna为阳性对照，以猪、牛、羊、鸡、鸭、鹅、鹿、狐狸的dna为阴性对照，检测探针和引物的特异性。

具体实验方法参照实施例2。

实验结果如图4所示除马、驴、骡有扩增曲线且ct值＜30，其他动物来源模板均无扩增。由此可见，本发明提供的引物和探针特异性良好，与其他物种无交叉反应。

实施例4灵敏度试验

两重荧光定量pcr体系灵敏度和重复性测定:

分别提取马、驴和骡基因组，用nanodrop定量到100ng，做10倍梯度稀释，每个梯度均取2μl为模板量，按照优化好的试验反应体系和条件，分别检测马、驴及骡源性成分以考察本方法的检测灵敏度。将每组检测设立3个平行样，每个样品重复3次试验，每次试验的结果一致才能确定检测限灵敏度；提取骡子的dna作为模板，按照实施例2中的反应体系与反应条件进行实时荧光pcr反应，同一模板同时进行3次反应，每隔一天做一次，共重复15次，分析同一个样本的方差来评价体系的再现性及重复性。

实验结果如图5所示，当模板dna用量最低为0.01ng时，马肉、驴肉及骡肉核基因ckm有明显的扩增曲线，当模板dna用量为0.001ng时均无扩增，由此确定本方法的检测灵敏度为0.01ng。

实施例5重复性试验

同一模板同时进行3次荧光定量pcr反应，每隔一天做一次，共重复15次，分析同一个样本的方差来评价体系的再现性及重复性。

实验结果见表1，马、驴源性成分ct值的平均值分别为24.4和26.3，标准偏差分别为0.2和0.3，变异系数为0.8％、1.1％。以上结果表明，本方法检出限扩增结果精准稳定，可用于马、驴、骡源性成分检测。

表1

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110>北京市食品安全监控和风险评估中心（北京市食品检验所）

<120>检测马、驴、骡源性成分的荧光定量pcr方法及试剂盒

<130>khp181116436.1

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

tcatcgtagcatcgagggga20

<210>2

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agcagagcaggaagggagt19

<210>3

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aaacaaccggatctttcaagt21

<210>4

<211>21

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

aaataactggatcttttaagt21