一种与鸭肠粘膜氧化应激损伤相关的miRNA及其应用的制作方法

本发明涉及分子标记领域，尤其涉及一种与鸭肠粘膜氧化应激损伤相关的mirna及其应用。

背景技术：

鸭是一种胆小、易惊的家禽。随着鸭规模化、设施化养殖的发展，蛋鸭笼养成为一种重要的生产方式，逐渐在蛋鸭生产中推广应用，在标准化笼养流程中，免疫、运输、上笼、环境温度变化等各种有害刺激，可使鸭生产性能降低，极大的影响养殖效率。有害刺激易诱发氧化应激反应。在应激发生时，血液流向肌肉、脑等组织，小肠组织发生缺血，又最迟得到恢复，肠道持续缺氧造成氧化应激，不仅会影响肠道屏障和吸收功能，还可导致消化道黏膜的损伤，引发肠细菌异位，诱发多种疾病。

microrna(mirna)是一类长度约20-24nt的非编码单链小分子rna，可以通过与靶基因mrna的3’utr互补结合对靶基因进行转录后调控，在细胞增殖、分化和凋亡、细胞氧化应激应答、肿瘤形成等生理过程中发挥重要的调控作用。

mirna参与动物应激应答是通过结合靶基因mrna的3’utr进行负调控实现的。如果仅通过生物信息学分析预测，将得到大量互作基因，对其筛选和验证难度巨大，而通过同一组织，特定生理时期rna-seq和mirna-seq测序，并进行关联分析，会更加准确获得相应生理过程的功能mirna及其靶向基因，为鉴定调控组织氧化应激这类复杂生理机制提供一个全新手段。因此，本发明提出一种与鸭肠粘膜氧化应激损伤相关的mirna及其应用，以解决现有技术中的不足之处。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提出的mirna(mirna-218-5p)与鸭小肠粘膜氧化应激损伤有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，mirna-218-5p在应激组和对照组样本间的差异极显著，同时本发明提出的mirna可用于抗逆蛋(肉)鸭的辅助遗传育种中，可以实现早期辅助选择，并且本发明提出的检测mirna-218-5p表达水平的荧光定量pcr试剂盒包含了从rna提取到荧光定量实验所需的整套试剂，即方便使用，又保证了结果的一致性。

本发明提出一种与鸭肠粘膜氧化应激损伤相关的mirna及其应用，包括mirna，所述mirna为应激过程中下调的mirna(mirna-218-5p)，其核苷酸序列如seqidno.1所示，所述mirna的靶基因是醛酮还原酶7(akr7a2)，所述mirna通过上调的醛酮还原酶7(akr7a2)基因的表达，参与小肠上皮的氧化应激应答。

进一步改进在于：所述mirna在氧化应激鸭小肠上皮细胞模型中增殖和分化中的应用中是通过上调的醛酮还原酶7(akr7a2)基因的表达，在小肠上皮细胞的氧化应激损伤过程中发挥抗氧化作用。

进一步改进在于：所述mirna表达水平及其下调的醛酮还原酶7(akr7a2)基因的表达是利用rt-qpcr检测，根据鸭小肠组织中的所述mirna的表达水平，判断鸭小肠抗氧化能力并进行筛选。

进一步改进在于：检测鸭小肠组织中的所述mirna表达水平，包括如下步骤：

(1)提取待测鸭小肠组织中含有mirna的总rna；

(2)设计目标mirna和内参mirna(u6)的茎环引物，利用反转录酶进行mirna反转录；

(3)采用mirna特异的正向引物，以及通用下游引物，利用荧光定量pcr试剂盒进行mirna-218-5p和内参mirna的扩增；

(4)扩增后利用2^-△△ct法计算获得mirna-218-5p的表达水平。

进一步改进在于：所述荧光定量pcr试剂盒包括反转录试剂、mirna-218-5p的茎环引物，mirna-218-5p上游引物和下游引物、内参mirna(u6)茎环引物、u6上游引物和下游引物和荧光定量pcr反应试剂；

mirna-218-5p的茎环引物为：

ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagacatggtt；

mirna-218-5p上游引物为：ctggtaggttgtgcttgatcta；

mirna-218-5p下游引物为：tcaactggtgtcgtggagtcggc；

内参mirna(u6)的特异性茎环引物为：

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacaaaaatatg；

u6上游引物为：ctcgcttcggcagcaca

u6下游引物为：aacgcttcacgaatttgcgt。

进一步改进在于：所述mirna(mirna-218-5p)作为分子标记应用于遗传标记辅助育种和缓解鸭肠道粘膜氧化应激损伤中。

本发明的有益效果为：本发明提出的mirna(mirna-218-5p)与鸭小肠粘膜氧化应激损伤有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，mirna-218-5p表达水平在应激组和对照组样本间的差异极显著，同时本发明提出的mirna可用于抗逆蛋(肉)鸭的辅助遗传育种中，可以实现早期辅助选择，并且本发明提出的检测mirna-218-5p表达水平的荧光定量pcr试剂盒包含了从rna提取到荧光定量实验所需的整套试剂，即方便使用，又保证了结果的一致性。

附图说明

图1为本发明中akr7a2的3’utr与mirna-218-5p的结合位点示意图。

图2为本发明mirna-218-5p在应激组/对照组中的相对表达量结果示意图。

图3为本发明中akr7a2在氧化应激组/对照组中的相对表达量结果示意图。

图4为本发明mirna-218-5p靶向akr7a2基因的双荧光素酶验证结果示意图。

图5为本发明转染mirna-218-5pmimic后，进行小肠上皮细胞氧化应激处理，mirna-218-5p的表达和akr7a2表达情况示意图。

图6为本发明转染mirna-218-5pmimic后，进行小肠上皮细胞氧化应激处理，小肠上皮细胞增殖情况示意图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

实施例一

根据图1所示，本实施例提出基于ngs技术的mirna和mrna联合分析获得肠道氧化应激相关基因(akr7a2)及其调控mirna(mirna-218-5p)。

(1)实验动物和样本准备

以出雏的荆江鸭雏鸭为实验素材来源.对其进行高温运输应激处理，处理时长为8h，处理后立即屠宰，采集血液样本、小肠样本，并将采集的小肠样本部分迅速放入液氮中冻存；

将应激组和对照组小肠样本采样后，每组各选取3只雏鸭样本作为实验组小肠样本和对照组小肠样本，并将选出的实验组、对照组小肠样本利用商用试剂盒提取总rna，然后分别构建用于mirna和mrna测序的cdna文库，最后将构建好的文库送测序公司进行测序。

(2)基于高通量测序结果分析表达差异mirna和mrna

将获得的测序结果进行分析，将两组实验鸭小肠mirna测序结果中fold-change＜0.5或＞2且fpkm≥10，p＜0.05的mirna定义为差异表达mirna；将fold-change＜0.5或＞2且两组中各基因的fpkm≥10，p＜0.05的mrna定义为差异表达mrna。

(3)差异表达mirna和mrna联合分析进行关键mirna筛选

利用targetscan算法，基于ucsc数据库的鸡的全基因数据，通过测序结果基因组比对，mirna与3’utr的匹配，对所有差异表达mirna与差异表达mrna进行联合分析。通过进一步分析发现，差异表达mirna的靶基因akr7a2为醛酮还原酶超家族成员，在细胞氧化应激过程中发挥关键作用。

靶基因预测结果表明，akr7a2的3’utr区与mirna-218-5p的转录调控区有8个碱基互补结合，如图1所示。

在氧化应激过程中，akr7a2为上调基因，与对照组相比，应激组mirna-218-5p表达量降低，符合mirna具有负调控功能的特点，即mirna对能够负调控靶基因转录，因此，在小肠氧化应激过程中，mirna-218-5p表达下调，通过促进akr7a2的合成，降低氧化应激损伤。

实施例二

根据图2、3所示，本实施例提出群体验证mirna-218-5p标记与肠道应激的相关性的方法，用实时荧光定量pcr(qrt-pcr)对测序获得的关键mirna(mirna-218-5p)及基因(akr7a2)的表达进行样本鉴定。

(1)实验样本准备

取40只初生荆江鸭雏鸭，半数进行运输应激处理，半数作为对照组，经长途运输8h后进行屠宰，采集血样和小肠组织样本，小肠组织样本采集后迅速放入液氮中冻存，然后根据血液中氧化应激指标，每组选择出6只具有极端表型值的个体。

(2)mirna-218-5p差异表达验证

提取小肠总rna：利用trizol法提取小肠中的总rna，akr7a2mrna反转录及定量的条件为：利用revertraaceqpcrrtkit(toyobo，日本)试剂盒进行反转录；thunderbirdsybrqpcrmixkit(toyobo，日本)进行qrt-pcr；引物为(f：tgggtgatgccaactgtcta；r：gtgggtttgcgagtgtcttt)检测每次设置3个平行管反应；以β-actin作为内参，引物序列为(f：atgtcgccctggatttcg；r：cacaggactccatacccaagaa)。pcr程序为：98℃、10s；(94℃、15s，60℃、30s)40个循环；

mirna-218-5p定量的条件为：利用试剂盒进行反转录revertraaceqpcrrtkit(toyobo，日本)试剂盒进行反转录；

使用茎环引物进行mirna的反转录，mirna-218-5p的茎环引物为：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagacatggtt；

内参mirna(u6)的特异性茎环引物为：gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacaaaaatatg；

thunderbirdsybrqpcrmixkit(toyobo，日本)进行qrt-pcr；检测每次设置3个平行，以u6作为内参；

mirna-218-5p上游引物为：ctggtaggttgtgcttgatcta；

mirna-218-5p下游引物为：tcaactggtgtcgtggagtcggc；

u6的上游引物为：ctcgcttcggcagcaca；

u6的下游引物为：aacgcttcacgaatttgcgt；

pcr反应程序为：98℃、10s；(94℃、15s，60℃、30s)40个循环；

mirna和基因的表达量利用2^-△△ct法进行计算，统计采用t检验，p＜0.05和p＜0.01定义为有统计学意义，分析各组之间的表达差异。

qpcr结果表明，mirna-218-5p表达量在应激组和对照组间差异极显著结果如图2所示；同时akr7a2基因表达量在两组间差异极显著，结果如图3所示。

实施例三

根据图4、5、6所示，本实施例提出mirnamirna-218-5p对小肠上皮细胞akr7a2基因表达及氧化应激应答的调控。

(1)质粒的构建及mirna-218-5pmimics的合成

akr7a2载体构建：根据ensemble上鸭akr7a2的3’utr序列设计引物，提取鸭小肠中的rna，并反转录为cdna，利用pcr方法，扩增akr7a2的3’utr序列，其中包括mirna-218-5p结合位点，然后经回收、纯化等步骤，将目的片段克隆到pmirglo载体中；具体的实验步骤包括对akr7a2的3’utr序列进行酶切位点分析，并根据载体序列信息，选择pmei和xhoi两个酶切位点以及对pcr产物进行酶切、利用试剂盒进行目的片段的纯化、酶切和回收、将pcr产物与pmirglo载体连接和进行菌落pcr测序后获得akr7a2载体。

(2)双荧光素酶实验验证akr7a2与mirna-218-5p的靶向结合

以原代分离的鸭小肠上皮细胞为实验载体，采用脂质体3000将akr7a2双荧光素酶表达载体和mirna-218-5p的mimics转染细胞；

试验分为对照组和处理组，具体分组如下：a.处理组(mirna-218-5pmimic)：mirna-218-5p的mimics和akr7a2表达载体共转染；b.对照组(nc)：negativecontrol和akr7a2表达载体共转染；c.空白对照组(bc)：akr7a2表达载体转染；

在转染前一天，将细胞接种至24孔板，当细胞融合度达80％时，即可进行转染。转染体系为50μl，每孔具体转染体系如下：处理组：50μlopti-mem+1.5μllipofectamine3000+1μlmirna-218-5pmimics(20μm)+0.5μgakr7a23’utr表达载体；对照组：50μlopti-mem+1.5μllipofectamine3000+1.5μlnc(20μm)+0.5μgakr7a23’utr表达载体；空白对照组：50μlopti-mem+1.5μllipofectamine3000+0.5μgakr7a23’utr表达载体；

转染后24h，采用双荧光素酶报告系统检测过处理组和对照组的荧光活性。结果如图4所示，与对照组相比，共转染mirna-218-5pmimics和akr7a2表达载体的处理组，荧光素酶活性极显著下降。

结果表明，mirna-218-5p能够特异性结合akr7a2的3’utr，akr7a2是mirna-218-5p的靶基因之一。

(3)mirna-218-5pmimics转染后，原代培养的鸭小肠上皮细胞氧化应激模型akr7a2表达和细胞增殖的变化。

通过在小肠上皮细胞中转染20nm浓度的mirna-218-5pmimics，使mirna-218-5p过表达，转染12h后，对细胞进行氧化应激处理(150μm过氧化氢处理)，结果表明，mirna-218-5pmimics转染具能够下调akr7a2表达，结果如图5所示；

通过在小肠上皮细胞中转染20nm浓度的mirna-218-5pmimics，使mirna-218-5p过表达，转染12h后，对细胞进行氧化应激处理(150μm过氧化氢处理)，处理4h后，通过ckk-8法检测细胞增殖情况，结果表明，在氧化应激处理后，mirna-218-5pmimics转染组小肠上皮细胞活力弱于氧化应激处理组，结果如图6所示。

实施例四

检测鸭小肠组织中mirna-218-5p表达水平的荧光定量pcr试剂盒。

所述试剂盒包括：反转录试剂、mirna-218-5p和u6的茎环引物、mirna-218-5p和u6的上下游引物、荧光定量pcr反应液；

反转录试剂：购自toyobo公司的反转录试剂盒revertraaceqpcrrtkit，具体成分为：mirna-218-5p茎环引物：ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagacatggtt；u6茎环引物gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacaaaaatatg；

荧光定量pcr反应液：购自toyobo公司的thunderbirdsybrqpcrmixkit，具体成分为buffer和ddh2o；

mirna-218-5p上游引物为：ctggtaggttgtgcttgatcta；

mirna-218-5p下游引物为：tcaactggtgtcgtggagtcggc；

u6的上游引物为：ctcgcttcggcagcaca；

u6的下游引物为：aacgcttcacgaatttgcgt。

所述试剂盒的工作程序为：98℃、10s(step1)；94℃、15s，60℃、30s(step2，45个循环)；37℃、30s(step3)。

本发明提出的mirna(mirna-218-5p)与鸭小肠粘膜氧化应激损伤有很好的相关性，通过有效性和分子生物学验证，mirna-218-5p在应激组和对照组样本间的差异极显著，同时本发明提出的mirna可用于抗逆蛋(肉)鸭的辅助遗传育种中，可以实现早期辅助选择，并且本发明提出的检测mirna-218-5p表达水平的荧光定量pcr试剂盒包含了从rna提取到荧光定量实验所需的整套试剂，即方便使用，又保证了结果的一致性。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一种与鸭肠粘膜氧化应激损伤相关的mirna及其应用

<160>11

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>24

<212>rna

<213>鸭mir-217-5p(anhimidae)

<400>1

uacugcaucaggaacugauuggau24

<210>2

<211>44

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

ctcaactggtgtcgtggagtcggcaattcagttgagatccaatc44

<210>3

<211>25

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ctggtaggtactgcatcaggaactg25

<210>4

<211>23

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tcaactggtgtcgtggagtcggc23

<210>5

<211>53

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

gtcgtatccagtgcagggtccgaggtattcgcactggatacgacaaaaatatg53

<210>6

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

ctcgcttcggcagcaca17

<210>7

<211>20

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

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<210>8

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<213>人工序列(artificialsequence)

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aatgtgccacggtttcc17

<210>9

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tccttctactttctgagggtat22

<210>10

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>10

atgtcgccctggatttcg18

<210>11

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>11

cacaggactccatacccaagaa22