一种山羊环状RNA及其鉴定方法和功能应用与流程

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种山羊环状rna及其鉴定方法和功能应用。

背景技术：

环状rna(circularrnas,circrna)是一种新型的内源性非编码rna，它是在mrna前体(pre-mrna)剪切过程中，外显子和(或)内含子的5’端与3’端以反向剪切(backsplicing)形式连接3’和5’磷脂键，最终形成共价闭合环状rna分子。根据构成不同，circrna分为外显子circrna(exoniccircrna)、内含子circrna(introniccircrna,cirnas)和外显子-内含子circrna(exon-introncircrna,eicirnas)。circrna在细胞核内调控来源基因(hostgene)的表达，在细胞质内则发挥cerna(competingendogenousrnas,内源性竞争rna)的作用。继mirna和lncrna后，circrna已成为非编码rna研究领域的新热点。

circrnas主要通过三种机制发挥调控功能：(1)作为mirna的海绵吸附体调控基因的表达(cerna)；(2)circrna结合rna结合蛋白(rbp)以形成rna-蛋白复合物(rpc)，调控线性亲本基因的转录；(3)已经有数篇论文研究发现circrna可编码蛋白质，发挥生物学功能。

卵泡发育机制的研究文献众多，取得了大量重要结论，但是在非编码rna，尤其是circrna调控卵泡发育的研究仍非常有限。早在1993年，capel等人就在在小鼠精子决定基因sry中发现了环状rna，并且sry也被证实可以吸附mir-138，发挥mirna海绵作用。cheng等研究发现，在孕产妇衰老过程中，人类卵巢颗粒细胞中circrna可能在葡萄糖代谢、有丝分裂细胞周期和卵巢激素生成过程中发挥作用。但circrna具有多种途径发挥调控作用，例如可以吸附mirna、通过影响其靶基因的表达来实现功能。众所周知，mirna具有强大的生物学功能，在卵泡发育中的作用已得到大量证明，因此提出circrna通过mirna来调控卵泡发育这一假设具有充足的理由。对于补充circrna在家畜卵泡发育中的作用机制、丰富卵泡发育的调控信号具有重要意义。因此，本发明提出一种山羊环状rna及其鉴定方法和功能应用，以解决现有技术中的不足之处。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提出了一种山羊环状rna，名称为circ_zcchc24，提供了一种circ_zcchc24的检测方法和功能应用，通过提供了一种山羊环状rnacirc_zcchc24的鉴定和构建超表达载体的方法，详尽的验证了山羊环状rnacirc_zcchc24是否成环及超表达载体在检测山羊卵泡颗粒细胞增殖分化过程中的作用，通过将山羊环状rnacirc_zcchc24的表达载体质粒转染山羊卵泡颗粒细胞。与空白对照组比较发现，超表达山羊环状rnacirc_zcchc24促进山羊卵泡颗粒细胞的增殖，这一新发现的山羊环状rna将为进一步解析山羊卵泡颗粒细胞发育的遗传机理提供了新的思路，对于研究山羊繁殖性状的遗传本质及培育高繁殖力山羊品种具有重要的意义。

本发明提出一种山羊环状rna，包括山羊环状rnacirc_zcchc24，所述山羊环状rnacirc_zcchc24的核苷酸序列如seqidno:1所示。

进一步改进在于：用于检测所述山羊环状rnacirc_zcchc24的引物包括上游引物(pf1)和下游引物(pr1)，所述上游引物(pf1)的核苷酸序列如seqidno:2所示，所述下游引物(pr1)的核苷酸序列如seqidno:3所示，所述山羊环状rnacirc_zcchc24的接头序列的核苷酸序列如seqidno:4所示。

一种山羊环状rna的鉴定方法，包括以下步骤：

步骤一：采集山羊山羊的肾、心、肌肉、肝、脾、卵泡和肺组织样本放入液氮带回实验室，采用组织rna提取试剂盒提取样品总rna，并检测其浓度与质量，作为待检测样品；

步骤二：将上述步骤一中的rna通过反转录试剂盒进行逆转录获得cdna；

步骤三：利用上游引物(pf1)和下游引物(pr1)对步骤二中获得的待检测样品通过实时荧光定量pcr(qrt-pcr)技术进行序列扩增，琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物的序列长度，再经由sanger测序技术，获得接头序列的真实碱基信息，与山羊环状rnacirc_zcchc24的接头序列进行比对，如果序列信息一致，则能够证明山羊环状rnacirc_zcchc24是真正成环的rna；

步骤四：利用上游引物(pf1)和下游引物(pr1)和步骤二中获得的cdna，通过qrt-pcr技术，对不同组织样本中的山羊环状rnacirc_zcchc24进行相对定量分析，取得的数据采用-2^-δδct法计算并获得不同组织样本中山羊环状rnacirc_zcchc24的相对表达量，根据不同组织样本中山羊环状rnacirc_zcchc24的相对表达量判断待测样本是否存在该环状rna及其表达水平。

进一步改进在于：所述山羊环状rnacirc_zcchc24的超表达载体包括山羊环状rnacirc_zcchc24超表达载体和山羊环状rnacirc_zcchc24的全长序列。

进一步改进在于：所述步骤一中的待检测样品rna提取过程为：采用rna提取试剂盒提取样品总rna，并检测其浓度与质量，所述步骤二中反转录获得cdna的具体实施方法为：采集山羊不同组织样本，提取rna后利用反转录试剂盒合成cdna，所述步骤三中的实时荧光定量pcr反应体系如下：iq^tmgreensupermix10ul,上游引物0.25ul，下游引物0.25ul，待检测cdna模板0.5ul，ddh2o9ul，总体系为20ul，所述步骤四中的实时荧光定量pcr反应条件为：94℃，3min；94℃，10s，60℃，10s，72℃，30s，40个循环；95℃，10s，62℃，60s，97℃，1s，1个循环。

进一步改进在于：所述山羊环状rnacirc_zcchc24超表达载体为pcd2.1-cir。

进一步改进在于：所述山羊环状rnacirc_zcchc24超表达载体的构建过程为：将环状rnacirc_zcchc24的全长序列片段，整合到环状rna超表达载体pcd2.1-cir中，得到所述山羊pcd2.1-circ_zcchc24超表达载体。

进一步改进在于：所述山羊环状rnacirc_zcchc24超表达载体的构建过程中还包括进行circ_zcchc24的全长序列片段的pcr扩增的上游引物(pf2)和下游引物(pr2)，上游引物(pf2)其核苷酸序列如seqidno:5所示，下游引物(pr2)其核苷酸序列如seqidno:6所示。

进一步改进在于：所述上游引物(pf2)核苷酸序列seqidno:5含有kpni限制性内切酶的酶切位点，所述下游引物(pr2)核苷酸序列seqidno:6含有bamhi限制性内切酶的酶切位点。

一种山羊环状rna的功能应用，所述山羊环状rnacirc_zcchc24应用于细胞核内调控来源基因的表达，并在细胞质内则发挥内源性竞争rna的作用和吸附mirna、通过影响其靶基因的表达来实现功能

本发明的有益效果为：

1、本发明根据山羊环状rnacirc_zcchc24的全长序列，设计的特异引物用于鉴定环状rna是否正确成环、分析相对表达量，研究circ_zcchc24对山羊卵泡颗粒细胞增殖的调控作用，提供了对山羊环状rnacirc_zcchc24进行定量分析所需的pcr条件，利用上述引物和方法，可以准确检测不同组织样本中circ_zcchc24是否成环及其表达水平。

2、本发明提供的山羊环状rnacirc_zcchc24超表达载体，可以稳定表达circ_zcchc24，通过转染山羊卵泡颗粒细胞，首次发现circ_zcchc24可以促进颗粒细胞增殖，为环状rna调控山羊繁殖性状的分子机制带来了更深层次的认知，运用于家畜高繁殖力分子调控机制的研究，具有较好的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例中山羊环状rnacirc_zcchc24的结构示意图。

图2为本发明实施例中山羊环状rna表达产物的琼脂糖凝胶电泳图。

图3为本发明实施例中山羊环状rna接头序列中环化位点的测序峰图。

图4为本发明实施例中山羊环状rna在肾、心、肌肉、肝、脾、卵泡和肺组织中的相对表达量示意图。

图5为环状rna超表达载体pcd2.1-cir的结构图谱。

图6为本发明实施例中超表达circ_zcchc24加快山羊卵泡颗粒细胞的增值速率示意图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例对本发明做进一步详述，本实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

根据图1、2、3、4、5、6所示，本实施例提出一种山羊环状rna，其特征在于：包括山羊环状rnacirc_zcchc24，所述山羊环状rnacirc_zcchc24的核苷酸序列如seqidno:1所示。

用于检测所述山羊环状rnacirc_zcchc24的引物包括上游引物(pf1)和下游引物(pr1)，所述上游引物(pf1)的核苷酸序列如seqidno:2所示，所述下游引物(pr1)的核苷酸序列如seqidno:3所示，所述山羊环状rnacirc_zcchc24的接头序列的核苷酸序列如seqidno:4所示。

一种山羊环状rna的鉴定方法，其特征在于：包括以下步骤：

步骤一：在湖北省农业科学院种羊场采集波尔山羊母羊的肾、心、肌肉、肝、脾、卵泡和肺组织样品各3份，经pbs清洗后放入去rna酶的样品采集管内，放入液氮带回实验室进行总rna的提取，剩余样本放置在-80℃冰箱保存；

步骤二：利用天根rnasimple总rna提取试剂盒来山羊不同组织样品中总rna的提取，操作按照试剂盒说明书进行，提取后的rna放置于-80℃冰箱保存备用，使用nanodrop2000型dna/rna浓度测定仪，测定dna浓度和od值，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性，按照所测浓度将管中的dna做相应稀释，以50ng/μl分装，于-20℃保存备用，采用takara的rtreagentkitwithgdnaeraser反转录试剂盒获得cdna模板。操作按照试剂盒说明书进行，反转录后的cdna放置于-80℃冰箱保存备用。

步骤三：由于各类数据库还未见山羊环状rna的相关信息，申请人采用转录组测序技术分析了波尔山羊和麻城黑山羊排卵前卵泡组织中的环状rna,根据转录组测序结果结合ncbi数据库中山羊基因信息得出，山羊环状rnacirc_zcchc24的全长序列是由山羊zcchc24基因的部分第一内含子和全部第二外显子环化而成，如图1所示，核苷酸序列如seqidno:1所示，山羊环状rnacirc_zcchc24的接头区域序列，核苷酸序列如seqidno:4所示；

以circ_zcchc24的全长序列为模板，利用primer5软件设计能够进行qrt-pcr鉴定山羊环状rnacirc_zcchc24的引物序列，其序列如下：

上游引物(pf1)的序列：tgtgcttcaacaaagggcacta(序列表seqidno:2)；

下游引物(pr1)的序列：ttctctctcgtgtaggcttgga(序列表seqidno:3)；

利用设计的上游引物seqidno:2和下游引物seqidno:3，步骤二中获得的山羊肾、心、肌肉、肝、脾、卵泡和肺组织cdna为扩增反应模板，采用qrt-pcr策略进行山羊环状rnacirc_zcchc24相对表达量分析，产物长度为78bp；

qrt-pcr反应程序如下表1所示：

表1qrt-pcr反应程序

pcr反应体系(20μl)如下表2所示：

表2pcr反应体系(20μl)

取5μlqrt-pcr反应中卵泡组织作为模板的扩增产物，加0.5μlloadingbuffer，混匀后点样于2％的琼脂糖凝胶上，以5μldna标准分子量dl2000marker作为参照，15v/cm电泳，电泳结束后，在凝胶成像系统中观察结果并拍照保存，如图2所示，qrt-pcr反应产物采用omegabio-tek公司的凝胶回收试剂盒切胶回收，具体操作步骤按照该试剂盒说明书进行；

克隆和测序：回收后的扩增产物连接takara公司的pmd18-t载体，连接反应总体系10μl，置于16℃条件下连接1h；

连接反应体系(10μl)如下表3所示：

表3连接反应体系(10μl)

无菌条件下取10μl连接产物加入到50μldh5α感受态细胞中，混匀后静置冰浴30min，42℃热激90s，立即置于冰上3min，加入400μl不含amp抗生素的lb液体培养基，置于37℃恒温摇床培养45min，在<5000g的环境下低速离心，留150μl上清，其余弃除,再将剩余上清吹打混匀然后均匀涂布于含有100mg/l的amp的平板上，平放于37℃恒温培养箱中1h，之后倒置过夜培养；

用小枪头挑取平板上形态正常的单菌落，置于含400μllb液体培养基含的1.5mlependorff管中，于37℃恒温摇床培养8h，取lμl菌液作为pcr扩增的模板，pcr扩增体系和程序参见步骤三，pcr扩增产物用浓度为2％的琼脂糖凝胶电泳检测，并在凝胶成像系统中拍照记录；

经菌液pcr检测，结果为阳性的含重组质粒的菌液送北京奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，测序结果与山羊环状rnacirc_zcchc24的接头区域序列进行对比分析，发现山羊环状rnacirc_zcchc24的首尾碱基正好连在一起形成环化位点，表明山羊环状rnacirc_zcchc24正确成环，成环结果如图3所示；

步骤四：上述qrt-pcr反应结束后导出数据，利用2^-δδct方法进行分析，利用graphadprism软件对分析结果进行作图，山羊肾、心、肌肉、肝、脾、卵泡和肺组织中circ_zcchc24表达结果如图4所示，结果显示，circ_zcchc24在以上组织中，除肺泡组织表达极低外，肾、心、肌肉、肝、脾、卵泡组织均有不同程度的表达。

其中，山羊环状rnacirc_zcchc24超表达载体的构建过程如下：

载体pcd2.1-cir空载体是专门用于环状rna表达的工程载体，含有环状rna表达框架如图5所示，经过大肠杆菌dh5α扩增后，使用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒(omegae.z.n.a.tmendo-freeplasmidminikitispin)进行抽提载体dna，具体步骤见试剂盒说明书；

circ_zcchc24全长序列扩增过程为：以circ_zcchc24的全长序列为模板，利用primer5软件设计能够进行touch-downpcr的引物序列，其中5’端分别引入kpnⅰ和bamhⅰ酶切位点见引物中方框部分，方框之前的2个碱基为保护碱基，下划线部分分别为上游引物的正向环化介导序列和下游引物的反向环化介导序列，其序列如下：

上游引物pf2的序列：

(序列表seqidno:5)；

下游引物pr2的序列：

(序列表seqidno:6)；

利用设计的引物seqidno:5和seqidno:6形成引物对，以山羊cdna为模板，采用touch-downpcr策略扩增circ_zcchc24全长序列(2045bp)。

touch-downpcr反应程序如表4所示：

表4touch-downpcr反应程序

pcr反应体系(50μl)如下表5所示：

表5pcr反应体系(50μl)

载体和扩增产物双酶切过程：pcd2.1-cir空载体质粒和circ_zcchc24全长序列扩增产物，分别用限制性内切酶kpnⅰ和bamhⅰ进行双酶切；

双酶切反应体系(10μl)如下表6所示：

表6双酶切反应体系(10μl)

体系于37℃酶切3h，酶切产物在2％琼脂糖凝胶电泳，采用过柱离心的方法回收；

将酶切后纯化的pcd2.1-cir空载体质粒和circ_zcchc24全长序列扩增产物，用t4连接酶16℃连接2h；

连接体系(10μl)如下表7所示：

表7连接体系(10μl)

采用步骤三中的克隆和测序方法进行重组pcd2.1-circ_zcchc24载体的克隆和测序验证；

使用去内毒素质粒小量提取抽提试剂盒进行抽提载体dna，具体步骤见试剂盒说明书。

山羊卵泡颗粒细胞的分离培养过程如下：

(1)山羊屠宰后，取出整个卵巢组织，置于装有预冷pbs的无菌培养皿中；

(2)用加有双抗的pbs缓冲液冲洗血污，漂洗3次；

(3)剥净卵巢中卵泡的外膜、结缔组织等；

(4)选取体积适中的卵泡，用无菌一次性针管抽取卵泡液；

(5)pbs洗涤抽取出的卵泡液中的颗粒细胞，重复3次；

(6)将洗涤后的颗粒细胞接种于含15％胎牛血清的dmem/f12培养基的6孔板内，测定细胞密度，调整悬浮液细胞密度为1×10⁶个/ml，置于37℃、5％co2培养箱内静置培养；

(7)颗粒细胞培养24小时后，更换新鲜含有15％胎牛血清的dmem/f12培养基，贴壁后可用于后续研究。

细胞转染过程如下：

(1)在转染前1天，5×10⁴细胞接种于24孔板内，继续培养至细胞密度到80％；

(2)将每孔转染的0.8μg质粒加入50μlopti-mem培养基中混匀，取2.0μllipofectamine2000加入50μlopti-mem培养基中混匀，室温静置5min；

(3)将(2)中的两份混合液混合均匀，室温静置20min；

(4)期间吸除各孔中原有的细胞培养基，用opti-mem清洗两遍；

(5)将每孔细胞加入(3)中混合液100μl，后用opti-mem补至为500μl；

(6)置于37℃，5％co2细胞培养箱培养，等待后续处理。

mtt法检测细胞增殖过程如下：

(1)mtt溶液的配制：用5mlmtt溶剂溶解25mgmtt，配制成5mg/ml的mtt溶液；

(2)将4.2中经转染质粒的细胞取出备用；

(3)每孔加入10微升mtt溶液，在细胞培养箱内继续孵育4小时；

(4)每孔加入100微升蓝紫色产物甲臜溶解液，适当混匀，在细胞培养箱内继续孵育3-4小时；

(5)采用酶标仪在570nm测定吸光度。

经mtt法检测发现，转染了pcd2.1-circ_zcchc24质粒的细胞增殖速率相对于pcd2.1-cir空载体和空白对照组均匀明显加快，表明过量表达山羊环状rnacirc_zcchc24可以加速山羊卵泡颗粒细胞的增值，如图6所示。综上可以得出，本发明中的山羊环状rnacirc_zcchc24基因过表达载体能够稳定表达，可以应用于检测山羊卵泡颗粒细胞中细胞增殖情况。

本发明根据山羊环状rnacirc_zcchc24的全长序列，设计的特异引物用于鉴定环状rna是否正确成环、分析相对表达量，研究circ_zcchc24对山羊卵泡颗粒细胞增殖的调控作用，提供了对山羊环状rnacirc_zcchc24进行定量分析所需的pcr条件，利用上述引物和方法，可以准确检测不同组织样本中circ_zcchc24是否成环及其表达水平，同时本发明提供的山羊环状rnacirc_zcchc24超表达载体，可以稳定表达circ_zcchc24，通过转染山羊卵泡颗粒细胞，首次发现circ_zcchc24可以促进颗粒细胞增殖，为环状rna调控山羊繁殖性状的分子机制带来了更深层次的认知，运用于家畜高繁殖力分子调控机制的研究，具有较好的应用前景。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

<110>湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一种山羊环状rna及其鉴定方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>2045

<212>dna

<213>山羊(caprahircus)

<400>1

atcccaggctttggtccaagcctacacgagagagaaaagaggcccagagagggaaagggc60

tgggccagagtcacagagcagggtgtccagggagccaagaagagtgagggctgtatcctc120

cagggaggagtgccggacctccagaggcatacatgtgtgaggtgtgggctctgtcctggt180

tggaggaggggtgtcttgattccctgggaccagctctcagcttactaccctcccttccta240

cactgaggggacacagaaaaagaactggtatgcccaagaactggagcctagtaacctgag300

ccccgtgcccaggtttgtcatcagcccctgggaagctacctctttctagtcttggcctgg360

ccccgggagaagggtctcatggccagccttactgcaggccccacctttgctgaattccag420

tgtgcctggccgcccagagcccgtgactcctataaatagaggctgtatacaccaggaggg480

ggcctgggccacgtctgctttgaagccaggcaagacatctggttcctgtcaactggaggt540

gggagaggtgagagaggtgggccgtttcctccccgggcttccagagagctggcccagact600

gggctgagggctccccggacccactgtgcacaggcgtcggcctgcaggagaccaggcaaa660

gtgccgaacttcagtgtcctcttctgtacagtggaaacgaggctgcgagctggtcacccc720

accagcacacggcagagatgcggctctcgtaggtggctttctgctgcttgtcttacctcc780

tggcagcgtgtaaagaactaatgatcaccaccgtcaccatcatcatgtactgagtacttc840

gccagtgccaggcaggaaataaagggctatgttagcctcctagaaacccttggaggtagc900

tgtcattactcctgtttactggatggggtcactggggtcccgagtggttcactggcttgt960

ccatggatgcacaactcgagcagggatttgaacatgggctccaggaagctggagcccaca1020

ggtgactaaagagtcagtatgaaactaggaatgaaaccaccatatgacccagtaatccca1080

cgcctaggcatataccctgaggaaacgaaaattgaaaaagacacacgtatcccattgttc1140

attgcaacactatttgaactatagaacatggaagcaacctagatgtccgtcaacagatga1200

atgaataaaaagttgtgtacatatacacaatggaatattatcagccataaaaagaaacac1260

atttgagtcagttctaatgaggtggatgaacttagaacctattatacagagtgaagtaag1320

tcagaaagagaaaaataaacattatattctaatgcatatatacagaatctagaaaaatgg1380

tgctgaagaatttatttgcagggcagcaatggagaaacagacttagggaatagacttatg1440

gacaggggagaggggaggagagggtgagatgtatggaaagagtaacatggaaacttatat1500

taccatatgtaaaatagatagccaacgggaatttgctgtatggctcaggaaactcaaacg1560

ggctctgtatcaacctggaggcgtgggatggggagggagatgggaggggggttcagaaga1620

gaggggatatatgtatacctatggctgattcgtgttgaggtttgacagaaagcaacaaaa1680

ttctgtaaagcaattatccttcaataaaaaataagaaaaaagaaaaatcagggaagacaa1740

aaaacaaagactgggtatgaatgcgcgtgtgtgtaggagcctgtggaagcacggctgcac1800

cttgggccgggcccccaggcctcacagcctccgtccccctcaggcgctgggcagcagcgt1860

gtacaagagcgcctcaccctacggctccctcagcaacatcgccgacggcctcagctccct1920

caccgagcacttctccgacctgaccctcgcctccgagacccgcaagcccagcaagcggcc1980

cccacccaactacctgtgccacctgtgcttcaacaaagggcactacatcaaggactgccc2040

ccagg2045

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

tgtgcttcaacaaagggcacta22

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

ttctctctcgtgtaggcttgga22

<210>4

<211>58

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

agggcactacatcaaggactgcccccaggatcccaggctttggtccaagcctacacga58

<210>5

<211>46

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

ggggtacctgaaatatgctatcttacagatcccaggctttggtcca46

<210>6

<211>45

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

cgggatcctcaagaaaaaatatattcaccctgggggcagtccttg45