一种高活性抑制PCSK9表达的微小RNA的用途的制作方法

本发明属于生物医药工程领域，涉及一种人的内源性非编码微小rna(microrna，mirna，mir)及其应用，具体涉及人hsa-mir-99a-5p及其生物活性功能片段或变体或化学衍生物在制备诊断、预防和治疗高血脂症、动脉粥样硬化等心脑血管疾病、脂肪肝及其它与pcsk9升高相关的疾病如肥胖、2型糖尿病以及肾病综合症及蛋白尿等慢性肾病药物中的应用，属于生物医药领域。

背景技术：

家族性高胆固醇血症(familialhypercholesterolemia，fh)是一种常见的常染色体显性遗传性疾病，主要表现为血浆低密度脂蛋白胆固醇(lowdensitylipoproteincholesterol，ldl-c)水平异常升高，是心血管疾病(cvd)的主要危险因素(naturereviewsdiseaseprimers2017,3:17093)。已有研究证实低密度脂蛋白受体(lowdensitylipoproteinreceptor，ldlr)、前蛋白转化酶枯草溶菌素9(pcsk9)和apob为fh的3个易感基因(eurheartj2013,34(45):3478-3490a；circulationresearch2014,114(6):1022-1036)。

他汀类药物是临床最常用的降胆固醇药物，它主要通过抑制胆固醇合成过程中的限速酶羟甲基戊二酸单酰辅酶a(hmg-coa)还原酶发挥降胆固醇作用(science2001,292(5519):1160-1164)，但临床上仍有10-20％的患者难以耐受他汀类药物治疗或难以耐受更高给药剂量以达到预期的治疗效果(jama2012308(23):2497-2506)。

前蛋白转化酶枯草溶菌素9(proproteinconvertasesubtilisin/kexintype9,pcsk9)是一种分泌型丝氨酸蛋白酶，是前蛋白转化酶枯草溶菌素家族的第九个成员，主要在肝脏和肠道中表达，然后分泌到血液中与肝细胞表面的ldlr相结合，阻止ldlr再循环并增加其在溶酶体中的降解，从而导致肝细胞表面ldlr减少，降低肝脏结合和清除ldl-c的能力。因此，pcsk9已成为治疗高胆固醇血症的重要治疗靶点，通过抑制pcsk9可以治疗高胆固醇血症等相关疾病。

目前已有多种pcsk9抑制剂处于研发阶段或已获批上市成为治疗高胆固醇血症的药物，主要有以下几种：(1)单克隆抗体和模拟肽，原理是阻断pcsk9与ldlr的结合；(2)小分子干扰rna(smallinterferingrna，sirna)和反义寡核苷酸，原理是通过基因沉默作用来抑制pcsk9的生物合成；(3)小分子物质(naturereviewsdrugdiscovery2012,11(5):367-383)。

此外，最新研究显示，pcsk9升高与肥胖及2型糖尿病(pediatrdiabetes2017,18(8):755-760；diabetesmetabresrev2016,32(2):193-199.)密切相关，也与肾病综合症及蛋白尿等慢性肾病(inturolnephrol2017,49(6):1015-1024)密切相关，因此，通过抑制pcsk9可以成为预防和治疗这些与其相关的疾病的重要手段。

微小rna(microrna，mirna，mir)是真核生物中一类长度约为22个核苷酸的单链非编码rna，通过作用于靶基因的mrna起到转录后抑制作用，对细胞增殖、分化和凋亡等生命过程发挥着广泛且重要的调控功能(cell2004,116(2):281-297)。mirna具有高度保守性、时序表达特异性和组织表达特异性等特征。目前已有报道多个mirna参与了脂质代谢调节，其中，mir-122是肝脏中含量最多的mirna，也是第一个被发现参与脂质代谢调控的mirna(atherosclerosis2013,227(2):209-215)，mir-33位于固醇调节元件结合蛋白(srebps)内含子区域，与靶基因三磷酸腺苷结合盒转运体a1(abca1)3′utr结合，抑制abca1翻译，从而抑制胆固醇流出(thejournalofbiologicalchemistry2010,285(44):33652-33661)。

人的内源性非编码微小rnahsa-mir-99a-5p的前体rna(pre-mirna)即hsa-mir-99a定位于人基因组的21号染色体(chromosome21)(genes&development2002,16:720-728)。已有报道，hsa-mir-99a-5p在肝癌(hepatocellularcarcinoma，hcc)中的表达显著低于正常肝组织(oncogene2012,31:4517-4526)，其在hcc中直接靶向ago2蛋白(argonaute-2)mrna3′utr从而抑制ago2基因转录后翻译(oncogenesis2014,3:e97)。此外，mir-99a可靶向akt1蛋白激酶介导的信号通路抑制人非小细胞型肺癌(non-smallcelllungcancer，nsclc)细胞的转移(journalofcellularbiochemistry2015,116:268-276)。至今未见hsa-mir-99a-5p参与调控pcsk9表达的报道。

本发明首次证明hsa-mir-99a-5p可与人pcsk9基因转录的mrna的3′端非翻译区(3′utr)结合，抑制pcsk9基因转录后翻译，显著下调pcsk9蛋白表达，可以作为一种新型的药物组合物用于高血脂症、动脉粥样硬化等心脑血管疾病、脂肪肝等与pcsk9表达升高相关疾病的预防和/或治疗。

技术实现要素：

本发明公开了一种人的内源性非编码微小rnahsa-mir-99a-5p在制备诊断、预防和治疗与pcsk9升高相关的疾病药物中的应用以及在转录后水平抑制pcsk9蛋白表达的方法。

本发明具体技术方案如下：

一种人的内源性非编码微小rnahsa-mir-99a-5p在制备诊断、预防和治疗与pcsk9升高相关的疾病药物中的应用。所述与pcsk9升高相关的疾病选自高血脂症、动脉粥样硬化等心脑血管疾病、脂肪肝、肥胖、2型糖尿病或慢性肾病(如肾病综合症和蛋白尿)。

本发明所述hsa-mir-99a-5p的序列为包含下述seqidno：1所示的核苷酸序列的核酸或者其生物活性功能片段或变体或化学衍生物：5′-aacccguagauccgaucuugug-3′。优选地，所述hsa-mir-99a-5p的序列进行了甲氧修饰、硫代修饰或胆固醇修饰。

本发明所述hsa-mir-99a-5p可由其前体mirna(pre-mirna)即hsa-mir-99a在宿主内加工形成，所述hsa-mir-99a序列(seqidno：5)由mirbase(http://www.mirbase.org/)提供，序列为：5′-cccauuggcauaaacccguagauccgaucuuguggugaaguggaccgcacaagcucgcuucuaugggucugugucagugug-3′。

本发明所述hsa-mir-99a-5p可通过化学合成方法制备，也可将其序列(seqidno：1)或其前体序列(seqidno：5)克隆到质粒或病毒表达载体进行表达。

本发明所述的hsa-mir-99a-5p可与人pcsk9的mrna的3′utr(3′端非翻译区)结合从而抑制pcsk9基因转录后翻译，显著下调pcsk9的蛋白表达水平。

本发明提供的采用hsa-mir-99a-5p有效抑制人肝脏等细胞组织中pcsk9蛋白表达的方法，可显著降低pcsk9对人肝细胞ldlr的降解活性，显著增强人肝细胞组织中ldlr水平和对ldl-c的吸收功能，可作为一种新型的药物组合物应用于制备预防和治疗高血脂症、动脉粥样硬化等心脑血管疾病及脂肪肝的药物。

本发明提供的采用hsa-mir-99a-5p有效抑制细胞和组织中pcsk9蛋白表达的方法，也可作为一种新型的药物组合物应用于制备预防和治疗与pcsk9升高相关的其它疾病如肥胖、2型糖尿病、肾病综合症及蛋白尿等慢性肾病的药物。

附图说明

图1：hsa-mir-99a-5p下调人肝细胞中pcsk9蛋白表达水平。(图1a：targetscan7.1软件预测人pcsk93′utr存在一个hsa-mir-99a-5p作用靶位点，此靶位点在人和黑猩猩(chimpanzee)中具有序列保守性；图1b-d：westernblot结果显示hsa-mir-99a-5p和anti-mir-99a可分别下调和上调人肝癌细胞hepg2中pcsk9蛋白表达；图1e-f：免疫荧光技术检测显示hsa-mir-99a-5p和anti-mir-99a可分别下调和上调人肝癌细胞hepg2中pcsk9蛋白表达；图1g-i：westernblot结果显示hsa-mir-99a-5p和anti-mir-99a分别下调和上调人正常肝细胞lo2中pcsk9蛋白表达；图1j-k：免疫荧光技术检测显示hsa-mir-99a-5p和anti-mir-99a分别下调和上调人正常肝细胞lo2中pcsk9蛋白表达。pcsk9-m：maturepcsk9；pcsk9-p：precursorpcsk9。注：^**表示与对照组相比p<0.01；(n＝3，mean±sem))。

图2：hsa-mir-99a-5p与人pcsk9基因转录的mrna3′端非翻译区(3′utr)结合并抑制其蛋白表达。(图2a：双荧光素酶表达重组质粒pmirglo-pcsk93′utr示意图，该质粒由人pcsk93′utr基因克隆于双荧光素酶表达载体pmirglo(promega公司)得到；图2b：软件miranda预测的人pcsk9基因转录的mrna的3′utr存在hsa-mir-99a-5p作用靶位点；

图2c-d：双荧光素酶报告基因分析实验确证人pcsk93′utr存在hsa-mir-99a-5p直接作用靶位点，即当双荧光素酶表达重组质粒pmirglo-pcsk93′utr中包含野生型人pcsk93′utr序列时，hsa-mir-99a-5p可显著降低双荧光素酶报告基因表达，而当双荧光素酶表达重组质粒pmirglo-pcsk93′utr中包含的野生型人pcsk93′utr序列中的靶位点突变后，hsa-mir-99a-5p不能降低双荧光素酶报告基因的表达。pgk：phosphoglyceratekinase；wt(wildtype)：pmirglo-pcsk93′utr中3′utr片段(1098bp)为野生型；pm(pointmutations)：pmirglo-pcsk93′utr中3′utr片段(1098bp)为突变体。注：^**表示与对照组相比p<0.01；(n＝3，mean±sem))。

图3：hsa-mir-99a-5p抑制人肝癌细胞hepg2及人正常肝细胞lo2中pcsk9对ldlr的降解。(图3a-f：hsa-mir-99a-5p抑制人肝癌细胞hepg2中pcsk9对ldlr的降解，其中a-c为westernblot检测结果，d-e为免疫荧光染色检测结果，f为流式细胞术检测结果。图3g-l：hsa-mir-99a-5p抑制人正常肝细胞lo2中pcsk9对ldlr的降解，其中g-i为westernblot检测结果，j-k为免疫荧光染色检测结果，l为流式细胞术检测结果。注：^**表示与对照组相比p<0.01；(n＝3，mean±sem))。

图4：hsa-mir-99a-5p增强人肝癌细胞hepg2及人正常肝细胞lo2对dii-ldl的摄取。lipofectamine3000转染试剂瞬时转染50nmconmir或50nmmir-99a或50nmconinh或50nmanti-mir-99a至hepg2细胞(图4a)或lo2细胞(图4b)，72h后每孔加入20μg/mldii-ldl，于37℃、5％co2培养箱中避光孵育4h，采用全波长荧光酶标仪(varioskanflash，美国thermo产品)以520nm为激发光波长、580nm为发射光波长，检测hepg2和lo2细胞对dii-ldl的摄取。dii-ldl：dii标记的低密度脂蛋白。注：^*及^**分别表示与对照组相比p<0.05和p<0.01；(n＝3，mean±sem))。

具体实施方式

以下通过实施例说明本发明的具体步骤，但不受实施例限制。

在本发明中所使用的术语，除非另有说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例并参照数据进一步详细描述本发明。应理解，该实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂、仪器设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下面结合具体实施例进一步说明本发明。

实施例1靶向人pcsk93′utr的mirna预测及靶位点同源性分析

采用targetscan7.1(http://www.targetscan.org/vert_71/)、miranda(http://www.microrna.org/microrna/home.do)、mirwalk(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/)、mirdb(http://www.mirdb.org/mirdb/)和starbase(http://starbase.sysu.edu.cn/)等在线软件，预测靶向人pcsk9mrna(refseqid：nm_174936；ensemblid：ensg00000169174/enst00000302118.5)3′utr的mirna，结果显示人pcsk93′utr存在一个hsa-mir-99a-5p作用靶位点。该hsa-mir-99a-5p序列为：5′-aacccguagauccgaucuugug-3′(seqidno:1)。

在此基础上，利用targetscan7.1软件对hsa-mir-99a-5p靶位点(seedsequence)同源性进行分析，结果显示hsa-mir-99a-5p靶位点在人和黑猩猩(chimpanzee)中呈现序列保守性(如图1a所示)。

实施例2hsa-mir-99a-5p及其拮抗剂(anti-mir-99a)对人pcsk9蛋白表达水平的调控

由上海吉玛制药技术有限公司(genepharma)提供以下化学合成的mirna及其对照品：

(1)hsa-mir-99a-5pmimics(mir-99a)(cat.no.b02001)，序列为：5′-aacccguagauccgaucuugug-3′(seqidno:1)；

(2)mirnamimics的阴性对照(conmir)(cat.no.b04002)，序列为：5′-uucuccgaacgugucacgutt-3′(seqidno:2)；

(3)hsa-mir-99a-5pinhibitor(anti-mir-99a)(cat.no.b03001)，序列为：5′-cacaagaucggaucuacggguu-3′(seqidno:3)；

(4)mirnainhibitor的阴性对照(coninh)(cat.no.b04003)，序列为：5′-caguacuuuuguguaguacaa-3′(seqidno:4)。

在此基础上，采用lipofectamine3000转染试剂瞬时转染50nm的mir-99a或conmir或anti-mir-99a或coninh至人肝癌细胞hepg2或人正常肝细胞lo2，转染72h后，采用westernblot、免疫荧光染色技术检测细胞中pcsk9蛋白表达水平。结果表明：hsa-mir-99a-5p可显著下调人肝癌细胞hepg2和人正常肝细胞lo2中pcsk9蛋白的表达(如图1b-k所示)。

具体操作如下：

1材料

1.1细胞和质粒来源

本发明所用人肝癌细胞hepg2、人正常肝细胞lo2均购自中国医学科学院基础医学研究所基础医学细胞中心。本发明所用双荧光素酶表达载体pmirglo为美国promega公司产品。

1.2主要试剂

本发明主要用到以下试剂：胎牛血清(fetalbovineserum，fbs)、mem培养基、dmem培养基、opti-mem培养基、lipofectamine3000为thermo产品；β-actin单克隆抗体(#4970)，cellsignalingtechnology公司产品；anti-pcsk9单克隆抗体(#ab181142，用于westernblot)、anti-pcsk9多克隆抗体(#ab95478，用于免疫荧光检测)、anti-ldlr单克隆抗体(#ab52818)为abcam公司产品；hrp标记山羊抗兔igg(h+l)(fms-rb01)、alexa488标记山羊抗兔igg(h+l)(fms-rbaf48801)购自南京福麦斯生物技术有限公司；dii标记低密度脂蛋白(dii-ldl)购自广州奕元生物技术有限公司；双荧光素酶报告检测系统(dual-reporterassaysystem)(#e1910)为美国promega公司产品。

1.3主要仪器

本发明主要用到以下仪器：pcr仪，eppendorf公司产品；tanon5200全自动化学发光图像分析系统，上海天能科技有限公司产品；激光共聚焦扫描显微镜(lsm700)，德国zeiss产品；化学发光微孔板读数仪(luminoskanascent)，美国thermo产品；easycyte6-2lbenchtopflowcytometer流式细胞仪，美国millipore公司产品。

2方法

2.1细胞培养

hepg2细胞培养于含10％fbs的mem培养基，lo2细胞培养于含10％fbs的dmem培养基，均于37℃、5％co2培养箱培养。

2.2细胞转染

将2×10⁵个处于对数生长期的hepg2细胞或lo2细胞接种于6孔板中，于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。待细胞汇合度达到60-80％时，将原培养基换成opti-mem培养基，每孔900μl，于37℃、5％co2培养箱中培养1h。使用50μlopti-mem培养基稀释5μl的lipofectamine3000，轻轻混匀，室温孵育5min；使用50μlopti-mem培养基稀释2.5μl浓度为20μm的hsa-mir-99a-5pmimics(mir-99a)储存液，轻轻混匀，室温孵育5min。在已稀释的lipofectamine3000试剂中加入稀释的mir-99a，轻轻混匀，室温孵育15-20min以形成转染复合物。将转染复合物逐滴加入待转染的细胞中，轻轻混匀。37℃、5％co2培养箱中培养4h后，将培养基换成完全培养基。转染相应时间后进行检测。

2.3hsa-mir-99a-5p下调人肝细胞中pcsk9蛋白表达水平的检测

将2×10⁵个处于对数生长期的hepg2细胞或lo2细胞接种于6孔板或玻底培养皿(20mm)中，于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。待细胞汇合度达到60-80％时，用lipofectamine3000将50nmconmir或50nmmir-99a或50nmconinh或50nmanti-mir-99a转染hepg2细胞或lo2细胞。转染48h后，去除细胞培养液中的培养基，用pbs小心润洗细胞一次，换成opti-mem培养基，于37℃、5％co2培养箱中培养24h进行检测。

2.3.1westernblot检测人肝细胞中pcsk9蛋白表达水平

(1)细胞总蛋白提取

去除细胞培养液中的培养基，用4℃预冷的pbs小心润洗细胞三次。每孔加入100μlripa细胞裂解液(pmsf:ripa＝1:100)，冰上裂解30min，用细胞刮将细胞从6孔板上刮下，收集细胞裂解液于1.5ml离心管中。将裂解后的样品于4℃、12000rpm条件下离心10min，取上清。用bca法测定各样品蛋白浓度，根据实验要求，计算样品的上样体积。分别取适量5×loadingbuffer与相应的蛋白样品混匀，100℃水浴锅中煮沸5min，以确保各蛋白样品充分变性，可立即进行后续实验，也可-80℃保存备用。

(2)sds-page电泳

按10％分离胶和5％浓缩胶制备sds-page胶，当浓缩胶凝固之后，将其装入密封袋中，置于4℃冰箱中，第二天使用。每孔上样量为20-30μg蛋白样品，在蛋白样品两侧可以加入不同体积的预染marker，区分上样顺序。对样品进行电泳分离，电泳条件为：80v电泳30min左右，120v继续电泳，直至溴酚兰完全跑出时，停止电泳。

(3)转膜

电泳结束后剥胶，用直尺测量其长度和宽度，并把凝胶小心地浸泡到转膜缓冲液中。剪取相应大小的pvdf膜和滤纸，并将pvdf膜浸泡到甲醇中30s以活化表面基团，再将pvdf膜和滤纸都转移到转膜缓冲液中。转膜夹板的正极朝下，由负极到正极依次放置：多孔性垫片、3层滤纸、凝胶、pvdf膜、3层滤纸、多孔性垫片，并确保各层之间不能存在气泡，将转膜夹安装到转膜槽中，加入转膜缓冲液。将电泳槽置于合适的容器中，周围放入碎冰，110v恒压转膜120min。

(4)封闭

转膜结束后，将pvdf膜取出，用tbst洗膜5min；弃去tbst，加入5％脱脂奶粉，室温缓慢封闭1h。

(5)洗膜

封闭结束后，将pvdf膜取出，用tbst洗膜三次，5min/次，以完全去除残留的封闭液。

(6)抗体孵育

取出anti-pcsk9单克隆抗体(用5％脱脂奶粉按1:2000稀释)、β-actin单克隆抗体(用含5％bsa的tbst按1:1000稀释)，将pvdf膜置于相应的一抗中，将其放到摇床上，4℃孵育过夜。回收一抗，将pvdf膜取出，用tbst洗膜三次，5min/次。取出hrp标记山羊抗兔igg(h+l)(用含1％bsa、0.05％吐温20的pbs按1:5000稀释)，将pvdf膜置于二抗中，将其置于37℃的恒温摇床上，缓慢孵育1h。

(7)洗膜

将pvdf膜取出，用tbst洗膜三次，10min/次。

(8)显色成像

取出pvdf膜，将其置于凝胶成像仪的相应位置，将ecl显色液均匀地加到pvdf膜上，调整凝胶成像仪的参数后，进行曝光，保存结果，并用imagej软件进行分析。

2.3.2免疫荧光染色法检测离体人肝细胞中pcsk9蛋白表达水平

去除细胞培养液中的培养基，用pbs小心润洗细胞三次，5min/次。加入4％多聚甲醛固定细胞，室温静置25min，用pbs小心润洗细胞三次，5min/次。加入通透液(含0.1％tritonx-100的pbs)，室温静置20min，用pbs小心润洗细胞三次，5min/次。加入封闭液(含1％bsa、10％山羊血清、0.3m甘氨酸的pbst)，室温封闭1h。加入anti-pcsk9多克隆抗体(用含1％bsa的pbs按1:50稀释)，4℃孵育过夜，用pbs小心润洗细胞三次，5min/次。加入alexa488标记山羊抗兔igg(h+l)(用含1％bsa的pbs按1:300稀释)重悬细胞，37℃避光孵育1h，用pbs小心润洗细胞三次，5min/次。加入dapi，室温避光孵育10min，用pbs小心润洗细胞三次，5min/次。加入300μlpbs，于激光共聚焦扫描显微镜(zeisslsm700，德国)下观察拍照。

实施例3hsa-mir-99a-5p与人pcsk93′utr靶位点直接作用的实验确证

(1)pmirglo-pcsk93′utr重组质粒的构建

采用pcr技术扩增人pcsk93′utr片段(1098bp)，酶切后克隆到双荧光素酶报告基因表达载体pmirglo的xhoi/xbai位点，构建成包含野生型人pcsk93′utr序列的双荧光素酶表达重组质粒pmirglo-pcsk93′utr。在此基础上，采用基因定点突变技术构建了包含突变的人pcsk93′utr序列(hsa-mir-99a-5p作用靶位点已定点突变)的双荧光素酶表达重组质粒pmirglo-pcsk93′utr-pm(突变位点见图2b)。转化到大肠杆菌jm109感受态细胞，菌落pcr筛选阳性克隆，送南京金斯瑞生物科技有限公司进行基因测序鉴定，使用dnastar软件进行基因序列比对。

(2)双荧光素酶报告基因分析

将1×10⁵个处于对数生长期的hepg2细胞接种于12孔板中，于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。待细胞汇合度达到60-80％时，用lipofectamine3000将1μgpmirglo-pcsk93′utr质粒或pmirglo-pcsk93′utr-pm质粒和50nmconmir或50nmmir-99a或50nmconinh或50nmanti-mir-99a共转染hepg2细胞，每组设3个复孔。转染24h后，按照双荧光素酶报告基因检测系统说明书进行操作，具体操作步骤如下：(1)去除细胞培养液中的mem培养基；(2)用1×pbs小心润洗细胞两次；(3)每孔加入250μl1×plb(被动裂解缓冲液)；(4)被动裂解：轻缓晃动培养板，室温充分裂解15min，把细胞裂解物转移到离心管中；(5)取20μl细胞裂解物到96孔酶标板中，加入100μl平衡至室温的larⅱ试剂，轻轻混匀避免产生气泡，于化学发光微孔板读数仪中检测萤火虫荧光素酶报告基因的活性；(6)向96孔酶标板中加入100μl平衡至室温的1×stop&reagent，轻轻混匀避免产生气泡，于化学发光微孔板读数仪中检测海肾荧光素酶报告基因的活性；(7)计算转录活性值：萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。

结果表明：当人pcsk93′utr序列中存在天然的hsa-mir-99a-5p作用靶位点时，hsa-mir-99a-5p能显著降低双荧光素酶报告基因表达活性；当人pcsk93′utr序列中hsa-mir-99a-5p作用靶位点突变后，hsa-mir-99a-5p失去降低双荧光素酶报告基因表达活性的功能。由此实验证明，hsa-mir-99a-5p直接作用于人pcsk93′utr靶位点(如图2所示)。

实施例4hsa-mir-99a-5p抑制pcsk9对人肝细胞ldlr的降解活性

lipofectamine3000转染试剂瞬时转染50nm的mir-99a或conmir或anti-mir-99a或coninh至人肝癌细胞hepg2或人正常肝细胞lo2，转染72h后，westernblot检测人肝细胞ldlr蛋白表达水平，与此同时分别采用免疫荧光技术和流式细胞术检测人肝细胞表面ldlr蛋白水平。具体操作如下：

(1)hsa-mir-99a-5p抑制pcsk9对人肝细胞ldlr降解的检测

将2×10⁵个处于对数生长期的hepg2细胞或lo2细胞接种于6孔板或玻底培养皿(20mm)中，于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。待细胞汇合度达到60-80％时，用lipofectamine3000将50nmconmir或50nmmir-99a或50nmconinh或50nmanti-mir-99a转染hepg2细胞或lo2细胞。细胞转染48h后，去除细胞培养液中的培养基，用pbs小心润洗细胞一次，换成opti-mem培养基，于37℃、5％co2培养箱中培养24h进行检测。

(2)westernblot检测人肝细胞ldlr蛋白表达水平

操作同实施例2。

(3)免疫荧光染色法检测人肝细胞表面ldlr蛋白水平

操作同实施例2。

(4)流式细胞术检测人肝细胞表面ldlr蛋白水平

去除细胞培养液中的培养基，用pbs小心润洗细胞一次，用胰酶消化细胞，收集细胞悬液于1.5ml离心管中，3000rpm离心5min收集细胞。用pbs重悬洗涤细胞，室温静置5min，离心收集细胞。用80％甲醇固定细胞5min，离心收集细胞。用pbst重悬细胞，室温静置20min，离心收集细胞。用封闭液(含1％bsa、10％山羊血清、0.3m甘氨酸的pbs)重悬细胞，室温封闭1h，离心收集细胞。用anti-ldlr单克隆抗体(用含1％bsa的pbs按1:100稀释)重悬细胞，室温孵育2h，离心收集细胞，不加抗体孵育的细胞作为空白对照。用pbst重悬洗涤细胞，室温静置5min，离心收集细胞。用alexa488标记山羊抗兔igg(h+l)(用含1％bsa的pbs按1:300稀释)重悬细胞，室温避光孵育1h，离心收集细胞。用pbst重悬洗涤细胞，室温静置5min，离心收集细胞。用pbs重悬洗涤细胞，室温静置5min，离心收集细胞。最后用300μlpbs重悬细胞。easycyte6-2lbenchtopflowcytometer流式细胞仪检测hepg2细胞或lo2细胞表面ldlr蛋白水平。使用流式分析软件flowjo7.6.1分析检测结果。

结果表明：hsa-mir-99a-5p能显著抑制pcsk9对人肝细胞ldlr降解作用(如图3所示)。

实施例5hsa-mir-99a-5p增强人肝细胞摄取dii-ldl的活性

将1×10⁴个处于对数生长期的hepg2细胞或lo2细胞接种于黑色96孔板中，于37℃、5％co2培养箱中培养过夜。待细胞汇合度达到60-80％时，用lipofectamine3000将50nmconmir或50nmmir-99a或50nmconinh或50nmanti-mir-99a转染hepg2细胞或lo2细胞。转染48h后，去除细胞培养液中的培养基，用pbs小心润洗细胞一次，换成opti-mem培养基，于37℃、5％co2培养箱中培养24h。每孔加入20μg/mldii-ldl，于37℃、5％co2培养箱中避光孵育4h。去除含有dii-ldl的opti-mem培养基，用pbs小心润洗细胞三次，最后每孔加入100μlpbs。采用varioskanflash全波长荧光酶标仪，以520nm为激发光波长、580nm为发射光波长，检测细胞荧光值。结果表明：hsa-mir-99a-5p显著增强人肝细胞摄取dii-ldl的功能，而anti-mir-99a显著抑制人肝细胞摄取dii-ldl的功能(如图4所示)。

序列表

<110>中国药科大学

<120>一种高活性抑制pcsk9表达的微小rna的用途

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

aacccguagauccgaucuugug22

<210>2

<211>21

<212>dna/rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

uucuccgaacgugucacgutt21

<210>3

<211>22

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cacaagaucggaucuacggguu22

<210>4

<211>21

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

caguacuuuuguguaguacaa21

<210>5

<211>81

<212>rna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

cccauuggcauaaacccguagauccgaucuuguggugaaguggaccgcacaagcucgcuu60

cuaugggucugugucagugug81