用于检测T790M和C797S顺反式突变类型的探针组、试剂盒、反应体系及系统的制作方法

本发明涉及数字pcr领域，具体而言，涉及用于检测t790m和c797s顺反式突变类型的探针组、试剂盒、反应体系及系统。
背景技术：
：egfr基因t790m和c797s突变是在肿瘤患者中发现的基因突变类型，egfr基因t790m具体是指表皮生长因子受体(epidermalgrowthfactorreceptor，egfr)第20号外显子第790氨基酸位点由苏氨酸(t)突变为甲硫氨酸(g)，基因水平表现为c.2369c>t；egfr基因c797s具体是指egfr第20号外显子第797氨基酸位点由半胱氨酸(c)突变为丝氨酸(s)，基因水平表现为c.2389t>a或c.2390g>c。当t790m和c797s同时突变时，t790m和c797s位于相同等位基因上，这种构型称为顺式；t790m和c797s位于不同等位基因上，这种构型称为反式。目前研究结果表明，t790m、c797s突变及不同构型与肿瘤患者的耐药性、疗效预测、预后相关，例如：当egfr基因c797s和t790m为反式突变时，临床上运用一代和三代egfr-tki联合治疗有效。而当c797s和t790m为顺式突变时，肿瘤对所有egfr-tki均耐药。在诸如血液的体液样本中检测t790m、c797s突变及构型具有显著的优势，适用于肿瘤标本不可评估(较难通过手术或穿刺获得肿瘤组织)的患者，并在一定程度上有效克服肿瘤异质性，可实现无创实时动态检测。因此，检测t790m、c797s突变及构型，尤其是检测体液样本诸如血液中的t790m、c797s突变及构型，无论是在临床还是在科研上均具有重要意义。目前egfrt790m、c797s突变顺式、反式检测方法包括二代测序(ngs)和数字pcr法(dpcr)。其中ngs方法检测灵敏度为0.2％-1％且其检测周期长、费用高；市场上基于数字pcr法检测egfrt790m、c797s突变顺式、反式灵敏度为0.1％，但该方法无法计算突变率且无法在同一反应中进行样本的质控。由此可见，目前需要一种检测灵敏度高、检测周期短、可以准确获得t790m和c797s顺反式突变类型和突变率(包括顺式、反式突变率)且可以直接对样本进行质控的方法。有鉴于此，特提出本发明。技术实现要素：本发明的第一目的在于提供用于检测t790m和c797s顺反式突变类型的探针组。本发明的第二目的在于提供用于检测t790m和c797s顺反式突变类型的数字pcr试剂盒。本发明的第三目的在于提供用于检测t790m和c797s顺反式突变类型的数字pcr反应体系。本发明的第四目的在于提供用于检测t790m和c797s顺反式突变类型的系统。本发明所述探针组、试剂盒、数字pcr反应体系和检测系统，基于所述探针1～3对t790、c797的突变型、野生型的不同结合强度以及数字pcr技术的特征，能够实现对样本t790m和c797s顺反式突变类型的准确、定量检测以及对待测样本进行质量控制；另外，本发明所述试剂盒集成前述探针组和数字pcr的其他试剂集，便于产品的运输、保存和使用以及产品的推广、应用。为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：用于检测t790m和c797s顺反式突变类型的探针组，所述探针组由探针1、探针2和探针3组成，其中，所述探针1、探针2和探针3的核苷酸序列如seqidno：3、6和7所示，所述探针1、探针2和探针3的两端分别标记淬灭染料和荧光染料，所述探针1标记荧光染料1，所述探针2和探针3均标记荧光染料2。本发明上述探针组由探针1～3组成，所述探针1～3具有以下特点：(1)探针1～3均为兼容性探针，其中，探针1既可以结合t790野生型模板又可以结合t790m(c.2369c>t)突变型模板，探针2既可以结合c797野生型模板又可以结合c797s(c.2389t>a)突变型模板，探针3既可以结合c797野生型模板又可以结合c797s(c.2390g>c)突变型模板；(2)探针1～3对野生型模板的结合能力明显低于突变型模板，其在数字pcr反应中对野生型模板与突变型模板的区分度好，能够准确反应野生型模板拷贝数和突变型模板拷贝数；(3)探针2～3在同一pcr反应中不会相互干扰，能准确检出c797s(c.2389t>a)、c797s(c.2390g>c)突变拷贝数。基于上述探针1～3所示特点，本发明所述探针组能够应用于数字pcr技术，实现t790m和c797s顺反式突变类型的准确、定量检测以及质量监控待测样本，具体而言：首先，基于探针1～3的兼容性、区分性以及非干扰性，前述探针组应用于数字pcr时，能够在同一反应单元中同时检测单拷贝模板的t790和c797是否发生t790m、c797s突变，继而根据该反应单元的检测结果确定所述单拷贝模板t790m和c797s顺反式突变类型。如果所述反应单元的检测结果同时为t790m突变阳性和c797s突变阳性且连锁，散点分布于散点图的右上区，则判断所述样本为顺式突变；如果其检测结果同时为t790m突变阳性和c797s突变阳性且2种突变型的散点分布于散点图的左上区和右下区，则判断所述样本为反式突变，如果其检测结果均为t790m突变阴性和c797s突变阴性，则可确定该样本为野生型。其次，基于数字pcr，可以实现不同突变类型的反应单元的计数，获得待测样本的总拷贝数以及顺、反式突变类型的拷贝数，从而计算获得顺、反式突变的突变率。再者，基于样本的总拷贝数，在不增加反应数和其他实验的情况下，可以对待测样本直接进行质量控制，例如，如果检测出各模板总拷贝数大于等于1500，说明提取的cfdna合格；反之，说明提取的cfdna不合格。最后，实施例记载的检测结果显示：对于20ng样品可以检出0.05％突变率的样本；对于拷贝数为1300～1500的cfdna样本，本发明所述探针组的顺式检测限为0.4％，反式各突变检测限为0.5％；对于拷贝数为5500-7000的cfdna样本，顺式检测限为0.1％；反式c797s突变检测限为0.1％，t790m突变检测限为0.1％-0.2％。同时，本发明所述探针组对c797s、t790m分析的灵敏度均为100％，构型一致率、顺式突变一致率、反式突变一致率和顺式+反式突变一致率均为100％，c797s分析特异性为97.6％，t790m分析特异性为100％。在一些具体的实施方式中，所述探针1～3为taqman探针。在一些具体的实施方式中，所述荧光染料1为vic，所述荧光染料2为fam。在一些具体的实施方式中，所述探针组为单试剂、双试剂或三试剂；可选地，所述探针组为双试剂，包括试剂1和试剂2，其中，试剂1包括探针1，试剂2包括探针2和探针3。另一方面，本发明还涉及用于检测t790m和c797s顺反式突变类型的数字pcr试剂盒所述试剂盒包括前述的探针组和其他试剂。在一些具体的实施方式中，所述其他试剂包括用于扩增t790和c797的引物对，优选地，所述引物对的核苷酸序列如seqid8～9所示。在一些具体的实施方式中，所述其他试剂包括水、dntps、dna聚合酶、数字pcr反应缓冲液、微滴生成油、阳性参考品、阴性参考品和标准品中的一种或多种；优选地，所述dntps、dna聚合酶和数字pcr反应缓冲液为mix。另一方面，本发明还涉及用于检测t790m和c797s顺反式突变类型的数字pcr反应体系，其特征在于，所述pcr反应体系包括：待测样本、dntps、dna聚合酶、数字pcr反应缓冲液和前述的探针组。另一方面，本发明还涉及用于检测t790m和c797s顺反式突变类型的系统，其特征在于，所述系统包括数据获取模块、数据分析模块以及统计模块；其中，所述数据获取模块用于获前述pcr反应体系的检测结果；所述数据分析模块用于根据散点的荧光信号值和分布情况判断待测样本的顺反式突变类型。在一些具体的实施方式中，所述系统还包括计算模块，所述计算模块用于计算样本中顺反式突变类型的发生频率。在一些具体的实施方式中，所述数据分析模块判断待测样本的顺反式突变类型的步骤包括：(1)根据散点的所述荧光染料1和荧光染料2的荧光强度判断样本是否发生t790m和c797s突变；(2)如果所述样本发生t790m突变型和c797s突变型，且突变型的散点分布于散点图的左上区和右下区，则判断所述样本为反式突变；如果所述样本发生t790m突变型和c797s突变型，且2种突变连锁，分布于散点图的右上区，则判断所述样本为顺式突变。在一些具体的实施方式中，根据所述散点的荧光信号判断样本的突变类型包括：比较散点的荧光信号值，如果所述散点的荧光染料1的荧光强度低于阈值1，则判断所述散点为无模板，荧光强度在阈值1与阈值2之间，则所述散点为t790m野生型，而荧光强度高于阈值2，则所述散点为t790m突变型。在一些具体的实施方式中，如果所述散点的荧光染料2的荧光强度低于阈值1’，则判断所述散点为无模板，荧光强度在阈值1’与阈值2’之间，则所述散点为c797s野生型，而荧光强度高于阈值2’，则所述散点为c797s突变型。在一些具体的实施方式中，所述阈值1根据t790m野生型对照中探针1的荧光强度确定，阈值2根据t790m突变型对照中探针1的荧光强度确定；所述阈值1’根据c797s野生型对照中探针2和探针3的荧光强度确定，阈值2’根据c797s突变型对照中探针2和探针3的荧光强度。在一些具体的实施方式中，所述系统还包括检测模块，所述检测模块用于执行前述体系的数字pcr反应。与现有技术相比，本发明的有益效果为：本发明所述探针组、试剂盒、反应体系和检测系统能够实现t790m和c797s顺反式突变的准确检测，由于采用对野生型和突变型的兼容性探针，简化体系，同时能计算各突变以及各构型的突变率，具有可定量性。本发明的探针组、试剂盒、反应体系和检测系统还具有灵敏度高、特异性好、检测限低的优点。本发明所述探针组、试剂盒、反应体系和检测系统还能够在不增加反应数和其他实验的情况下，对待测样本直接进行质量控制。附图说明为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为实施例2的散点图，其中，样本为c797s-ta&t790m-mu，pcrmix为reactiona，散点图中区域1表示t790m野生型+c797s突变型的微滴，位于散点图的左上区；区域2表示t790m突变型+c797s野生型的微滴，位于散点图的右下区，区域3表示无模板微滴，位于散点图的左下区。图2为实施例2的散点图，区域1、2、3代表的微滴类型同图1，其与图1的区别仅在于，使用的pcrmix为reactionb；图3为实施例2的散点图，其中，样本为c797sta-t790m-mu，pcrmix为reactiona，散点图的区域1表示t790m突变型+c797s突变型的微滴，位于散点图的右上区；区域2表示无模板的微滴，位于散点图的左下区；图4为实施例2的散点图，区域1、2代表的微滴类型同图3，其与图3的区别仅在于，使用的pcrmix为reactionb；图5为实施例2的散点图，其中，样本为c797s-gc&t790m-mu，pcrmix为reactionc，散点图区域1表示t790m野生型+c797s突变型的微滴，位于散点图的左上方；区域2表示t790m突变型+c797s野生型的微滴，位于散点图的右下方；区域3表示无模板微滴，位于散点图的左下方；图6为实施例2的散点图，区域1、2、3代表的微滴类型同图5，其与图5的区别仅在于，使用的pcrmix为reactiond；图7为实施例2的散点图，其中，样本为c797sgc-t790m-mu，pcrmix为reactionc，散点图的区域1表示表示t790m突变型+c797s突变型的微滴，位于散点图的右上区；区域2表示无模板微滴，位于散点图的左下区；图8为实施例2的散点图，区域1、2代表的微滴类型同图7，其与图7的区别仅在于，使用的pcrmix为reactiond；图9为实施例2的散点图，其中，样本为c797s-gc&t790m-mu，pcrmix为reactione，区域1表示t790m野生型和c797s突变型微滴，位于散点图的左上区；区域2表示t790m突变型+c797s野生型的微滴，位于散点图的右下区；区域3为无模板微滴，位于散点图的左下区；图10为实施例2的散点图，区域1、2、3代表的微滴类型同图9，其与图9的区别仅在于，使用的pcrmix为reactionf；图11为实施例2的散点图，其中，样本为c797sgc-t790m-mu，pcrmix为reactione，散点图的区域1表示t790m突变型+c797s突变型的微滴，位于散点图的右上区；区域2表示无模板微滴，位于散点图的左下区；图12为实施例2的散点图，区域1、2代表的微滴类型同图11，其与图11的区别仅在于，使用的pcrmix为reactionf；图13为实施例6所述37例临床样本的检测结果；图14为实施例6所述28例标准品和参考品的检测结果；图15为实施例6所述65例临床样本和标准品、参考品样本的检测结果。具体实施方式下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购买获得的常规产品。一、材料1、参考品制备为探索本发明的可行性，共使用6种质粒，详细信息见表1，3种阴性dna(h2228、hcc827细胞系gdna和正常人gdna)，共配制45种参考品。根据hcc827细胞系gdna的拷贝数和质粒的拷贝数，配制不同突变率的参考品，4种参考品1各稀释2.5倍获得4种参考品2，参考品2稀释2倍获得参考品3，参考品3稀释5倍获得参考品4，参考品1、3、4均用primepcrtmddpcrtmmutationdetectionassaykit:egfrwtforp.t790m,andegfrp.t790m,human(biorad)或egfr基因t790m突变检测液(先声诊断)和ddpcrmutationassay:egfrp.c797sc.2389t>a,human(biorad)、ddpcrmutationassay:egfrp.c797sc.2390g>c,human(biorad)检测突变率。参考品4稀释5倍获得参考品5，参考品5稀释2倍获得参考品6，参考品6稀释2倍获得参考品7，2种顺式参考品4稀释2.5倍获得顺式参考品8，2种反式参考品4稀释1.8倍获得反式参考品8。稀释使用的溶剂均为阴性参考品(hcc827gdna)。共配制44种阳性参考品，详细信息见表2、表3。表1.质粒详细信息表2.参考品信息表3混合参考品详细情况2、标准品信息使用的标准品详细突变率见下表。表4标准品突变信息3、临床样本使用公司商业临床样本—非小细胞肺癌患者cfdna，已明确t790、c797突变情况及构象。4、试剂与耗材表5试剂与耗材5、设备表6仪器设备二、操作程序1、血浆游离dna提取(1)提取操作参照qiaampcirculatingnucleicacidkit说明书；(2)再采用ultrapuretmdnase/rnase-freedistilledwater洗脱。2、配制egfrt790m和c797s检测液(egfrt790m、c797sassay)2.1、检测液的配制表7检测液的配制2.2、配制pcr反应体系：按表8配制pcr反应体系，pcrmix配制完成后，涡旋振荡混匀10s后瞬时离心，分装至1.5mlep管或8连管中，每管分装11μl。向对应的1.5mlep管或8连管中加入已处理好的cfdna样本或参考品或阴性/阳性/空白对照品，用ultrapuretmdnase/rnase-freedistilledwater补足至20μl，涡旋混匀10s后瞬时离心。表8pcr反应体系配制注：1.nfw为ultrapuretmdnase/rnase-freedistilledwater的简写。2.以上配制量仅为一个反应的量。2.3、微滴生成将dg8cartridge放置于底座上，将配制好的20μlpcr体系加入到dg8cartridge中间一排孔内，不足8个样本时凑足8个或用稀释一倍的20μl1×buffercontrol补足，不允许有空孔。建议使用rainin的8通道20μl排枪和20μl枪头，加样时枪头接近孔一侧底部，与侧壁呈大约15°角，缓慢打出液体，打出一部分后慢慢提升枪头位置再打出余下液体，不要将枪按至超过第一档位置以免引入气泡。在dg8cartridge最底一排8个孔中各加入70μl微滴生成油，不允许有空孔。加样本及微滴生成油时都要避免产生气泡。盖上胶垫(gasket)，两边的小孔都要钩牢。将dg8cartridge及底座轻轻地平稳放置于微滴生成仪中，开始生成微滴。运行指示灯常绿时，微滴生成结束，一般2分钟之内完成。仪器所处环境温度必须处于20-30℃之间。微滴生成于cartridge最上面一排孔内，建议使用rainin的8通道p-50排枪和200μl枪头小心缓慢吸取，调整吸取体积为40μl，将holder放平，枪头以与孔壁呈30～45°角放入，轻触孔底，约5秒吸取40μl，再同样缓慢地打入96孔板相应位置孔内(约5秒)，枪头贴近孔壁接近孔底，注意封上盖以防油挥发，每次弃去已使用过的cartridge和胶垫。注：①吸取微滴及释放微滴时需缓慢轻防止微滴破裂3、封膜3.1、封膜操作打开pcr热封仪，设置温度为180℃，预热。转移微滴进入96孔板内完成后，将膜有红线标记的一面(反光亮面)朝上置于96孔板上并固定好(注意将红线标记保持于96孔板偏上位置)，用预热好的px1热封仪对其进行封膜，需确认各样品孔是否密封好，若未密封好则需颠倒方向二次封膜。3.2、封膜后扩增前注意事项封好膜后在30分钟内进行pcr反应，或者放于4℃冰箱4小时之内进行pcr反应。4、pcr反应程序按照表9设置pcr反应程序并进行pcr反应。表9pcr反应程序注：可在bio-rad/abi的t100/proflex96孔pcr仪上完成，注意升降温速度≤2.5℃/s。5、数据获取及结果分析5.1、微滴读取先打开电脑，再打开微滴分析仪(qx200dropletreader)电源，使用前需预热至少30分钟。仪器所处环境温度必须处于20-30℃之间。将完成pcr反应的96孔板放入plateholder，然后将plateholder平稳放入微滴分析仪中。打开quantasoft软件，双击界面上对应96孔板样本位置的空白方块，对96孔板中样品信息进行setup，编辑样本名称、实验类型(选red)、supermix(选ddpcrtmsupermixforprobes(nodutp))、目标名称及类型等，点击“apply”应用。完成所有编辑后点击“ok”。点击“template”框中的“saveas”进行保存，选择保存地址并命名，点击保存。保存成功后命名将显示在界面最上方的横框中。保存完成后点击“run”，选择对话框中的vic/fam，确认后开始运行。结束后结果自动分析。注：开始运行前查看微滴读取仪上状态指示灯指示是否正常。若不正常则根据指示灯含义更换新的装满读取油的油瓶或更换废液瓶，更换新的读取油瓶后做一次prime(按键位于主界面右上角)。建议每周做一次flushsystem(按键位于主界面右上角)，若一周以上未使用建议运行前先做一次prime再做一次flushsystem。5.2、结果分析点击“analyze”进入分析页面，点击“events”-“total”查看每个样本成功上样的总微滴数，微滴数需保持在10000以上。查看“2damplitude”，进行散点图的划分。对照品channel1和channel2阈值可根据散点间的离散程度划定；样本channel1和channel2阈值可参考对照进行划定，若与对照阈值偏差较大则根据散点间的离散程度划定。若有明显偏离的点，可通过套索工具将其划为灰点。具体散点图划定方法为：将.qlp复制成2份，一份命名为“时间790-797-mu”,一份命名为“时间只wt”。打开“时间790-797-mu”，将channel1通道出现的突变散点化成蓝色，代表c797s突变；将channel2通道出现的突变散点化成绿色，代表t790m突变；将channel1和channel2通道出现的包含2种突变的散点化成橙色，代表既有c797s突变又有t790m突变；2个位点均为野生型的散点和无模板的散点均划为灰色。散点图划分好后选中所有样本，点击“exportcsv”导出原始数据。打开“时间只wt”，将2个位点均为野生型的散点划为绿色，其他所有散点划为灰色。散点图划分好后选中所有样本，点击“exportcsv”导出原始数据，进行计算分析。注：为使各类型散点在黑白图中可区分，特分别圈出不同类型(即，不同颜色)的散点加以标记。实施例1探针与引物序列设计设计用于检测t790和c797的探针和引物，其中，针对c797设计6条探针，针对t790设计1条探针，针对t790和c797设计用于扩增的pcr引物对，探针和引物的具体序列信息参见表10，其中，针对c797的探针的5’端标记fam，3’端标记淬灭基团，针对t790的探针的5’端标记vic，3’端标记淬灭基团。表10探针、引物序列探针名称编号序列c797s-0518-probeseqidno：1cttcggctgcctcc797s-0518-gc-probeseqidno：2cttcggctccctcc797s-0518-ta-probeseqidno：3cttcggcagcctcddpcr-c797s-wt-probeseqidno：4ttcggctgcctcctgddpcr-c797s-ta-probeseqidno：5ttcggcagcctccddpcr-c797s-gc-probeseqidno：6cttcggctccctcctg02-t790m-mu-vic-probeseqidno：7ctcatcatgcagctca02-c797s-fseqidno：8atctgcctcacctccaccg02-c797s-rseqidno：9ttgcgatctgcacacacca实施例2检测c797s的探针的选择的结果使用不同的探针组合以及浓度梯度，配制成不同的检测液(assay)，分析散点图的分布，选择最优探针及浓度：c797s-0518-ta-probe探针使用终浓度0.25μm和0.5μm，散点图分散程度一致，只是使用0.5μm的终浓度探针使得荧光值上升(参见散点图1～4)。因此检测c797s(t>a)时选择c797s-0518-ta-probe探针(seqidno:3)，终浓度选择0.25μm。c797s-0518-gc-probe探针使用终浓度0.25和0.5μm，散点图分散程度一致(参见散点图5～8)，c797s突变散点和t790m突变散点靠的太近，不利于后续结果分析。ddpcr-c797s-gc-probe探针使用终浓度0.25和0.5μm，散点图分散程度一致，比使用c797s-0518-gc-probe探针分散效果好且不同突变散点易区分(参见散点图9～12)。从散点图可以看出探针使用终浓度0.25和0.5μm只是影响了荧光值，对散点分散程度无影响。因此检测c797s(g>c)选择seqidno6探针，终浓度选择0.25μm。实施例3本实施例证明兼容性探针既能准确反应野生型模板拷贝数又能准确反应突变型模板拷贝数的结果：使用egfrt790massay(reactiong)检测正常人gdna、h2228gdna、hcc827gdna、h1975gdna作为对照，使用c797s-0518-ta0.25assay(reactiona)检测正常人gdna、h2228gdna、hcc827gdna、h1975gdna作为实验组1，使用ddpcr-c797s-gc0.25assay(reactione)检测正常人gdna、h2228gdna、hcc827gdna、h1975gdna作为实验组2。实验组1、2野生型拷贝数与对照的野生型拷贝数相比，无明显差异；实验组1、2突变型拷贝数与对照的野生型拷贝数相比，无明显差异；说明兼容性的探针(c797smu(t>a)探针与c797smu(g>c)探针(2种探针未混合到同一反应中)既能准确检测野生型拷贝数又能准确检测突变型拷贝数，因此可用于构型和突变率的计算，进而能够直接对反应进行定量。表11对照组与实验组拷贝数注：concentration：每微升样本的拷贝数，单位为copies/μl。表12不同样本对照组与实验组平均拷贝数实施例4本实施例证明检测c797s(c.2389t>a)和c797s(c.2390g>c)的2种探针放入一个反应中不相互干扰且能准确检出c797s(c.2389t>a)、c797s(c.2390g>c)突变拷贝数的结果：使用c797s-0518-ta0.25assay(reactiona)和ddpcr-c797s-gc0.25assay(reactione)检测参考品分别作为对照组1和对照组2。使用t790mu&c797sgc&c797staassay(reactionh)检测参考品作为实验组。比较实验组和对照组1、2的拷贝数，发现2组之间c797s突变的拷贝数、t790m突变的拷贝数和野生型的拷贝数均无明显差异。说明兼容性探针既能准确反应野生型模板拷贝数又能准确反应突变型模板拷贝数且检测c797s(c.2389t>a)和c797s(c.2390g>c)的2种探针放入一个反应中不会相互干扰，能准确检出c797s(c.2389t>a)、c797s(c.2390g>c)突变拷贝数。表13对照组与实验组拷贝数表14对照组与实验组平均拷贝数实施例5本实施例考察t790mu&c797sgc&c797staassay(reactionh)的检测限，具体结果参见表15。从表15可以看出，拷贝数为1500左右时，顺式检测限为0.4％，但可检出0.2％参考品；反式各突变检测限为0.5％，但可检出0.2％参考品。拷贝数为6000左右时，顺式检测限为0.1％，但可检出0.05％参考品；反式c797s突变检测限为0.1％，但可检出0.05％参考品，t790m突变检测限为0.1％-0.2％，但可检出0.05％参考品。表15低频参考品检测情况实施例6本实施例考察t790mu&c797sgc&c797staassay(reactionh)的准确性，具体结果参见图13～15。图13为37例临床样本检测结果，其中，共检测37例临床样本，c797s一致率为97.3％(36/37)；t790m一致率为100％(37/37)。图14为28例标准品和参考品检测结果比较，其中，共检测28例标准品和参考品，其中3例阴性，2例单t790m突变，4例顺式样本，10例反式样本和9例顺式+反式样本。c797s一致率为100％(28/28)；t790m一致率为100％(28/28)。构型一致率为100％(23/23)。图15为共65例临床样本和标准品、参考品样本检测结果比较，其中，临床样本和标准品、参考品检测结果共同分析，c797s一致率为98.5％(64/65)；t790m一致率为100％(65/65)。构型一致率为100％(23/23)。(1)分析灵敏度使用准确性的结果进行计算，计算公式为分析灵敏度＝真阳性/(真阳性+假阴性)×100％。c797s分析灵敏度＝24/24×100％＝100％；t790m分析灵敏度＝31/31×100％＝100％；构型一致率＝23/23×100％＝100％；顺式一致率＝4/4×100％＝100％；反式一致率＝10/10×100％＝100％；顺式+反式一致率＝9/9×100％＝100％。(2)分析特异性使用准确性的结果进行计算，计算公式为分析特异性＝真阴性/(真阴性+假阳性)×100％。c797s分析特异性＝40/41×100％＝97.6％；t790m分析特异性＝34/34×100％＝100％。最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，但本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。sequencelisting<110>江苏先声医学诊断有限公司,南京先声医学检验有限公司<120>用于检测t790m和c797s顺反式突变类型的探针组<160>9<170>patentinversion3.3<210>1<211>13<212>dna<213>人工序列<400>1cttcggctgcctc13<210>2<211>13<212>dna<213>人工序列<400>2cttcggctccctc13<210>3<211>13<212>dna<213>人工序列<400>3cttcggcagcctc13<210>4<211>15<212>dna<213>人工序列<400>4ttcggctgcctcctg15<210>5<211>13<212>dna<213>人工序列<400>5ttcggcagcctcc13<210>6<211>16<212>dna<213>人工序列<400>6cttcggctccctcctg16<210>7<211>16<212>dna<213>人工序列<400>7ctcatcatgcagctca16<210>8<211>19<212>dna<213>人工序列<400>8atctgcctcacctccaccg19<210>9<211>19<212>dna<213>人工序列<400>9ttgcgatctgcacacacca19当前第1页12