一种基于微流控的全自动DNA提取扩增模块的制作方法

本实用新型涉及基因分析检测技术领域，尤其涉及一种基于微流控的全自动DNA提取扩增模块。

背景技术：

随着人类基因组测序项目的成功完成和下一代DNA测序技术的不断发展，基因分析检测正越来越得到人们的重视，并逐步推广应用于医疗保健、环境保护和司法鉴定等众多领域。为进一步推动基因分析的发展应用，实现整个检测流程的低成本、快速和自动化是十分必要的。常规的核酸分析过程一般包括核酸的提取、待测区域的酶促扩增反应和产物的分离检测等三个步骤。整个过程耗时长、步骤多，需要在专业化的实验室中有专门的技术人员进行，而且还需要用到大量的大型专用设备。

传统的核酸提取方法包括两种：一是酚氯仿抽提法。二是基于固相萃取的各种形式的核酸提取方法。对于基于酚氯仿抽提法来说，其需要用到的有机试剂较多，其中不乏一些有毒有害物质，而且对于成本低廉的塑料芯片来说，有机试剂的在芯片上的存储往往会将芯片溶解，因此该方法并不适合移植到微流控芯片上进行，全集成自动化也无从谈起。基于固相萃取的核酸提取主要是将核酸分子吸附在二氧化硅、玻璃、硅藻土等固体物质的表面来实现提取纯化的。目前很多市售的试剂盒都采取了这种方法，其形式也包括萃取膜、萃取柱、微球、粉末和磁珠等。固相萃取法在微流控平台上是现有较为主流的技术，但是使用该方法进行核酸提取后，其所使用高离液盐溶液会对后端的扩增反应产生抑制作用，因此需要使用复杂繁复的洗脱操作来保证提取产物的纯度。这就直接提升了微流控系统的复杂度以及加工成本，现有的固相萃取提取核酸的微流控系统大多是使用成本高昂的玻璃等硅基材料来制作，工艺繁琐复杂，需要大量的人力进行，制作过程还需要使用一些毒性和危害性较大的化学制品，产业化推广十分困难。

技术实现要素：

(一)要解决的技术问题

本实用新型的目的是针对以上不足，提供一种高速、高效、消耗样品少和成本低廉的基于微流控的全自动DNA提取扩增模块。

(二)技术方案

为了解决上述技术问题，本实用新型提供了一种基于微流控的全自动DNA提取扩增模块，包括至少一个DNA提取扩增单元，所述DNA提取扩增单元包括：裂解液存储池、扩增体系存储池、扩增腔室、过滤装置，所述裂解液存储池、扩增体系存储池分别通过管道与所述扩增腔室的入口连通，所述过滤装置设置在所述扩增腔室的入口处；所述扩增腔室的出口通过管道连接至管道出口，所述扩增腔室与管道出口之间的管道上连通有可封闭的取液出口；所述裂解液存储池、扩增体系存储池、管道出口三者与所述扩增腔室的通断状态可分别切换。

其中，所述裂解液存储池的出口连接有第一微流控管道，所述第一微流控管道上设有第一芯片集成阀；所述扩增体系存储池的出口连接有第二微流控管道，所述第二微流控管道上设有第二芯片集成阀；所述第一微流控管道与第二微流控管道汇聚后与总管道的第一端连通，所述总管道的第二端与所述扩增腔室的入口连通；所述扩增腔室的出口与所述管道出口之间通过第三微流控管道连通，位于所述扩增腔室的出口与所述取液出口之间的所述第三微流控管道上设有第三芯片集成阀。

其中，所述裂解液存储池与所述第一微流控管道的连通处设有滤网。

其中，所述滤网表面接触角大于90度。

其中，还包括芯片管道主体和与之连接的芯片储液部，所述裂解液存储池与扩增体系存储池均设置在所述芯片储液部内，所述扩增腔室、第一微流控管道、第二微流控管道、第三微流控管道均位于所述芯片管道主体内，所述第一芯片集成阀、第二芯片集成阀、第三芯片集成阀、取液出口、管道出口均设置在所述芯片管道主体上。

其中，所述芯片管道主体由上层芯片与下层芯片组合而成。

其中，所述总管道为设置在所述下层芯片顶面上的凹槽结构，所述扩增腔室为设置在所述上层芯片底面上的凹槽结构；所述上层芯片与下层芯片连接后，所述总管道的截止处延伸至所述扩增腔室的下方以实现与所述扩增腔室的连通；所述过滤装置包括滤纸和绕所述滤纸的边缘设置的围栏，所述滤纸水平铺设在所述截止处与所述扩增腔室的连通处。

其中，所述扩增腔室处设有加热制冷元器件。

其中，所述上层芯片位于所述扩增腔室内设有向下延伸的多根微型圆柱，所述过滤装置位于所述扩增腔室内的边缘由所述微型圆柱固定，所述过滤装置的其余边缘压在所述上层芯片与下层芯片之间。

其中，所述截止处所在区域和所述滤纸均为圆形，所述滤纸的圆心位于所述截止处的下游，所述滤纸的圆心位于所述截止处所在区域之外。

(三)有益效果

本实用新型的上述技术方案与现有技术相比具有如下优点：本实用新型将全部试剂以液态形式存储于芯片上，通过切换管路实现检测，简化操作，检测速度快，消耗样品少；基于过滤装置过滤截留的方式进行DNA提取操作，芯片大大简化，制造成本降低。

附图说明

图1是本实用新型实施例所述基于微流控的全自动DNA提取扩增模块的轴测图；

图2是本实用新型实施例所述芯片储液部的侧向剖面图；

图3是本实用新型实施例所述扩增腔室的侧向剖面图；

图4是本实用新型实施例所述扩增腔室的俯视图。

图中：1、芯片储液部；2、裂解液存储池；3、扩增体系存储池；4、滤网；5、底部开口；6、第二芯片集成阀；7、第一芯片集成阀；8、过滤装置；9、扩增腔室；10、第三芯片集成阀；11、取液出口；12、管道出口；13、总管道；14、第一微流控管道；15、第二微流控管道；16、芯片管道主体；17、连接界面；18、加热制冷元器件；19、下层芯片；20、上层芯片；21、微型圆柱；22、截止处。

具体实施方式

为使本实用新型实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本实用新型实施例中的附图，对本实用新型实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本实用新型的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本实用新型中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本实用新型保护的范围。

如图1所示，本实用新型实施例提供的一种基于微流控的全自动DNA提取扩增模块，包括至少一个DNA提取扩增单元，所述DNA提取扩增单元包括：裂解液存储池2、扩增体系存储池3、扩增腔室9、过滤装置8，所述裂解液存储池2、扩增体系存储池3分别通过管道与所述扩增腔室9的入口连通，所述过滤装置8设置在所述扩增腔室9的入口处；所述扩增腔室9的出口通过管道连接至管道出口12，所述扩增腔室9与管道出口12之间的管道上连通有可封闭的取液出口11；所述裂解液存储池2、扩增体系存储池3、管道出口12三者与所述扩增腔室9的通断状态可分别切换。具体操作时，先将血液、干血片、口腔拭子、唾液、烟蒂等样本添加到裂解液存储池2中，静置2-5分钟以保证样本充分裂解；裂解充分后，在管道出口12处设置蠕动泵或注射泵等液体驱动装置，然后导通裂解液存储池2与扩增腔室9、扩增腔室9与管道出口12的连通状态，启动液体驱动装置使裂解液与样本混合液从裂解液存储池2流出进入扩增腔室9，进而再从管道出口12流出；在混合液体流经扩增腔室9时，溶解于其中的长链DNA模板将会被过滤装置8截留。然后关闭裂解液存储池2与扩增腔室9的连通，打开扩增体系存储池3与扩增腔室9的连通，在蠕动泵的驱动下，扩增体系存储池3内的液体流入扩增腔室9；由于扩增体系中所含有引物为短链DNA，因此不会被过滤装置8缠绕截留，会均匀散布于扩增腔室9的整个空间之中，此时再关闭扩增腔室9与裂解液存储池2、扩增腔室9与扩增体系存储池3。管道出口12三者的连通，在扩增腔室9内进行PCR扩增，PCR(聚合酶链式反应，又称：多聚酶链式反应，英文名称：Polymerase Chain Reaction)；过滤装置8位于扩增腔室9内，实现了原位扩增。扩增结束后，导通扩增腔室9与裂解液存储池2、扩增腔室9与扩增体系存储池3，通过液体驱动泵的负压抽吸将扩增产物从扩增腔室9转移到取液出口11中。取液出口11为一个前后端分别与扩增腔室9、管道出口12相连接的孔，取液出口11顶部敞开；在取液出口11上方使用密封胶带封死即可使整个流路封闭，不影响液体流动；待扩增产物被转移到取液出口11处时，将密封胶带掀开即可取出扩增产物。为保证裂解液与扩增体系液体的有效性，一般会在出厂前将裂解液与扩增体系液体预先封装在裂解液存储池2与扩增体系存储池3内，使用时打开裂解液存储池2顶部的开口，加入样本即可。本实用新型将全部试剂以液态形式存储于芯片上，简化操作，检测速度快，消耗样品少；基于过滤装置8过滤截留的方式进行DNA提取操作，芯片大大简化，制造成本降低。

具体的，如图1所示，所述裂解液存储池2的出口连接有第一微流控管道14，所述第一微流控管道14上设有第一芯片集成阀7；所述扩增体系存储池3的出口连接有第二微流控管道15，所述第二微流控管道15上设有第二芯片集成阀6；所述第一微流控管道14与第二微流控管道15汇聚后与总管道13的第一端连通，所述总管道13的第二端与所述扩增腔室9的入口连通；所述扩增腔室9的出口与所述管道出口12之间通过第三微流控管道连通，位于所述扩增腔室9的出口与所述取液出口11之间的所述第三微流控管道上设有第三芯片集成阀10。第一芯片集成阀7与第二芯片集成阀6用于控制两条管路中的液体进入扩增腔室9的时序。芯片集成阀可以使用现有的PDMS芯片顶杆阀结构等。PDMS(聚二甲基硅氧烷，英文缩写：polydimethylsiloxane)，因其成本低，使用简单，同硅片之间具有良好的粘附性，而且具有良好的化学惰性等特点，成为一种广泛应用于微流控等领域的聚合物材料。通过控制三个芯片集成阀的状态，可以方便地实现对三条管路的控制，操作方便；总管道13的设置使得扩增腔室9只需设置一个入口就可以同时与第一微流控管道14、第二微流控管道15连通，使得扩增体系入口结构简化，方便过滤装置8的设置。

进一步的，如图1和图2所示，所述裂解液存储池2与所述第一微流控管道14的连通处设有滤网4。对于干血片、烟蒂、全血等复杂样本来说，样本内的杂质往往较多，通过滤网4的疏松多孔结构能够将大颗粒的杂质初步滤除，以使进入扩增腔室9内的DNA模板具有更高的纯度；另外，当滤网4的孔径尺寸范围为20μm～100μm时，可以提供足够的表面张力使裂解液能够维持其表面以防止其向第一微流控管道14内渗透。滤网4的外围圆周被固定在裂解液存储池2底面下方，以避免由于流体运动造成滤网4随流体运动。

进一步的，所述滤网4表面接触角大于90度。为进一步提升滤网4的疏水性，可在滤网4、或是制作滤网4的纤维材料表面做一定的疏水性修饰，保证最终的滤网4表面接触角大于90度，避免检测开始前裂解液发生渗透现象。

对于扩增体系储液池来说，可以将与第二微流控管道15连通的底部开口5的直径缩小至小于2mm的状态，由于芯片内气压以及液体自身表面张力的作用，加上塑料芯片管道表面并非亲水表面，试剂会在底部开口5处维持界面，不会主动向管道内渗透。

这样就可以防止存储的试剂在未使用的状态下进入微流控管道。

进一步的，如图1和图2所示，本申请还包括芯片管道主体16和与之连接的芯片储液部1，所述裂解液存储池2与扩增体系存储池3均设置在所述芯片储液部1内，所述扩增腔室9、第一微流控管道14、第二微流控管道15、第三微流控管道均位于所述芯片管道主体16内，所述第一芯片集成阀7、第二芯片集成阀6、第三芯片集成阀10、取液出口11、管道出口12均设置在所述芯片管道主体16上。芯片储液部1与芯片管道主体16相互固定，优选采用同类、同牌号的材料制成，方便在两者的连接界面17处进行完全密封连接；所述有管路均设置在芯片管道主体16内，无需单独设置管道，整体结构简化，管道不易损坏；芯片储液部1与芯片管道主体16单独加工，密封连接后再注入液体，加工方便。

进一步的，如图3所示，所述芯片管道主体16由上层芯片20与下层芯片19组合而成。这样通过在上层芯片20与下层芯片19向对面上开槽就可形成管道，无需在芯片管道主体16内再铺设管道，降低了制造难度，方便管道与腔室的设计和排布。上层芯片20与下层芯片19的键合方式优选为热压或者激光焊接，以保证两者连接处的密封性。

优选的，如图3所示，所述总管道13为设置在所述下层芯片19顶面上的凹槽结构，所述扩增腔室9为设置在所述上层芯片20底面上的凹槽结构；所述上层芯片20与下层芯片19连接后，所述总管道13的截止处22延伸至所述扩增腔室9的下方以实现与所述扩增腔室9的连通；所述过滤装置8包括滤纸和绕所述滤纸的边缘设置的围栏，所述滤纸水平铺设在所述截止处22与所述扩增腔室9的连通处。这样当带有样本的裂解液到达扩增腔室9处时，裂解液会由下层芯片19上的总管道13到达截止处22，然后经过滤纸进入上层芯片20的扩增腔室9内；裂解液中的长链核酸模板会被滤纸缠绕截留，其余物质会穿过滤纸继续流动直至从管道出口12流出成为废液。在裂解液完全从管道出口12流出后，第一芯片集成阀7关闭，第二芯片集成阀6开启，下游负压将扩增体系储液池中的液体抽吸至扩增腔室9中；由于扩增体系中所含有引物为短链DNA，因此不会被过滤装置8缠绕截留，会均匀散布于扩增腔室9的整个空间之中。此时，再将第一芯片集成阀7、第二芯片集成阀6、第三芯片集成阀10关闭，即可进行PCR扩增。

优选的，所述扩增腔室9处设有加热制冷元器件18。也可以理解为在所述芯片管道主体16的上表面且位于所述扩增腔室9处，设有加热制冷元器件18。PCR扩增时需要调节扩增腔室9内的温度，设置加热制冷元器件18后即可实现扩增腔室9处局部温度的精确控制，不影响其他部位。当然如果环境温度可以满足PCR扩增要求，则无需启动加热制冷元器件18。

进一步的，如图3和图4所示，所述上层芯片20位于所述扩增腔室9内设有向下延伸的多根微型圆柱21，所述过滤装置8位于所述扩增腔室9内的边缘由所述微型圆柱21固定，所述过滤装置8的其余边缘压在所述上层芯片20与下层芯片19之间。这样当上层芯片20与下层芯片19拼接时，不需要任何额外的固定装置，就可以将过滤装置8的各处边缘固定，即将围栏与滤纸边缘部分固定在上层芯片20与下层芯片19的交接面上，避免滤纸不平整，防止液体流动过程中长链DNA泄漏。

优选的，如图4所示，所述截止处22所在区域和所述滤纸均为圆形，所述滤纸的圆心位于所述截止处22的下游，所述滤纸的圆心位于所述截止处22所在区域之外。此处滤纸为圆形，其安装时需要保证截止处22整体不能超过滤纸的对称中心。扩增腔室9占据滤纸的上方与下游的空间，扩增腔室9整体以及其下游的第三微流控管道均位于上层芯片20的底面上。

总体来说，本申请主要具有以下有益效果：

1、将全部试剂以液态形式存储于芯片上，简化操作；

2、基于过滤装置8过滤截留的方式进行DNA提取操作，芯片大大简化，制造成本降低；

3、通过独特的储液结构设计使得芯片能够兼顾存储的有效性和进液的便利性。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本实用新型的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本实用新型进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本实用新型各实施例技术方案的精神和范围。