一种数字PCR荧光检测装置的制作方法

本实用新型涉及光学装置技术领域，具体涉及一种数字PCR荧光检测装置。

背景技术：

数字PCR技术作为第三代PCR技术，是一种核酸分子绝对定量技术。数字 PCR通过将一种PCR反应分成许多更小的PCR反应(每个小的反应平均包括不超过一个靶核酸分子)来改进传统的PCR。每个小的反应都大约包括1或0个靶核酸分子，并且在PCR扩增结束时给出阳性或阴性二进制读数，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶核酸分子的起始拷贝数或浓度。相比于传统荧光定量PCR，数字PCR具有更加出色的灵敏度、特异性和精确性，目前已经广泛应用于肿瘤检测、产前诊断和单细胞研究等领域。

目前行业内基于微液滴技术的数字PCR检测仪器主要采用液滴生成、扩增反应和荧光检测的三步法实现样本的检测，在实际操作过程中需要通过多种仪器设备和涉及液滴转移过程，操作复杂且存在交叉污染和液滴破坏的风险，从而导致影响到检测结果的准确性。

因此，有必要开发一种可以更加简便、高效的数字PCR荧光检测装置。

技术实现要素：

有鉴于此，本实用新型提供了一种数字PCR荧光检测装置，该装置能够将微液滴PCR扩增反应与荧光检测两个功能的高度集成，实现PCR的原位扩增检测；整个装置可以省去检测过程中存在的液滴转移等操作复杂，缩短了样本反应和检测时间，避免存在交叉污染和液滴破坏的风险，提高检测结果的准确性。

本实用新型提供了一种数字PCR荧光检测装置，包括:

支撑底座；

支架，固定在所述支撑底座上；

载物台，设于所述支撑底座表面，所述载物台包括电动滑台、固定在所述电动滑台上的样品固定反应腔和用于调控所述样品固定反应腔温度的温度控制组件，所述样品固定反应腔用于容置待测PCR样品；所述电动滑台可沿X、Y轴的二维方向移动；

光学组件，设置在所述支架上，所述光学组件包括光源部、滤光片轮、物镜和CCD图像传感器；其中，所述光源部发出的光束依次经过所述滤光片轮和所述物镜之后照射到所述待测PCR样品内，所述待测PCR样品经照射发出的发射光依次经所述物镜和所述滤光片轮后，进入所述CCD图像传感器以实现对所述待测 PCR样品的荧光定量检测。

可选地，所述滤光片轮包括多个滤光单元组，每个所述滤光单元组包括激发光滤光片、发射光滤光片和二向色镜，所述光源部发出的光束依次经过所述激发光滤光片、所述二向色镜和所述物镜之后照射到所述待测PCR样品内；所述待测 PCR样品经照射发出的发射光依次经所述物镜和所述二向色镜和发射光滤光片后，进入所述CCD图像传感器。

可选地，所述光源部包括至少两种光源，所述数字PCR荧光检测装置还包括合光器组件，由所述至少两种光源发出的光束经所述合光器组件后进入所述滤光片轮。

可选地，所述数字PCR荧光检测装置还包括步进电机，所述步进电机固定所述支架上，所述步进电机与所述滤光片轮之间设有同步带，通过所述步进电机的转动以带动所述滤光片轮转动，从而实现所述滤光片轮内的多个滤光单元组之间的切换。

可选地，所述样品固定反应腔包括腔体、设于所述腔体内的均温板和与所述腔体盖合的盖板；所述样品固定反应腔置于所述电动滑台上，所述温度控制组件与所述均温板电连接以对所述均温板进行热传导；所述盖板包括一透光区域。

可选地，所述盖板上还设有一连通所述腔体的通气接头，所述通气接头用于连接外设的气压组件以调控所述腔体内的气压。

可选地，所述温度控制组件包括制冷片、散热风道、散热风扇、散热器和温度传感器；所述制冷片与所述均温板贴合以实现热传导；所述散热风道用于提供空气流动的风道，所述散热风扇置于散热风道中以加速空气流动；所述散热器通过所述散热风道和所述散热风扇对所述制冷片进行散热，所述温度传感器用于监测所述制冷片的温度。

可选地，所述电动滑台包括依次层叠设置在所述支撑底座上的底板、第一滑板和第二滑板，所述底板与第一滑板之间设有第一滑轨和第一驱动电机，以实现所述第一滑板沿第一方向移动；所述第一滑板和所述第二滑板之间设有第二滑轨和第二驱动电机，以实现所述第二滑板沿第二方向移动，所述第一方向和所述第二方向相互垂直。

可选地，所述CCD图像传感器与所述滤光片轮平行设置在所述支架上，所述 CCD图像传感器与所述滤光片轮平行之间设置一直角转角器，所述直角转角器用于使经过所述滤光片轮后的所述发射光发生直角转折以射入所述CCD图像传感器。

可选地，所述数字PCR荧光检测装置还配备有数字PCR芯片，所述数字PCR 芯片平铺且固定在所述样品固定反应腔内，所述待测PCR样品置于所述数字PCR 芯片内以进行数字PCR反应。

可选地，所述数字PCR芯片包括芯片基板，所述芯片基板上设有储液口、与所述储液口连通的第一流道、储油口、与所述储油口连通的第二流道、液滴平铺腔和与所述液滴平铺腔连通的溢流口；所述储液口用于注入PCR反应液，所述储油口用于注入油相试剂，所述液滴平铺腔连通有一混合流道，所述混合流道远离所述液滴平铺腔的一端设有混合入口；所述第一流道和所述第二流道交汇于所述混合入口，所述PCR反应液和所述油相试剂在所述混合入口交汇生成液滴；在所述液滴平铺腔内进行所述液滴的PCR扩增反应和检测。

可选地，所述数字PCR芯片的所述液滴平铺腔内还设有若干个间隔排布的支撑柱。所述支撑柱可以有效防止液滴平铺腔在外界压力下出现塌陷，提高整个所述数字PCR芯片的牢固性和抗冲击能力。

可选地，所述数字PCR芯片的所述芯片基板上还设有一定位缺口。所述定位缺口一方面可以进一步防止数字PCR芯片的移动，另一方面可以有效提示数字PCR芯片的摆放方位。

可选地，所述光源包括LED、卤钨灯或激光。

本实用新型的有益效果：

(1)本实用新型所述数字PCR荧光检测装置，能够提供PCR样品进行PCR扩增的温度控制组件，通过光学组件实现PCR的原位扩增检测，可以省去检测过程中存在的液滴转移等操作复杂，缩短了样本反应和检测时间，避免存在交叉污染和液滴破坏的风险，提高检测结果的准确性。

(2)本实用新型所述数字PCR荧光检测装置设有多种光源，具有多重荧光通道，通过不同荧光通道的自动切换，实现多重PCR检测，减少样品需求量；结合 CCD图像传感器和电动滑台，可以对大检测区域的不同荧光通道进行多工位成像和图像处理，提高产品的检测速度、精度和自动化水平。

(3)本实用新型所述数字PCR荧光检测装置还配备有数字PCR芯片，可以进一步实现对微液滴的生成、PCR扩增反应至光学检测的一体化分析检测。

本实用新型的优点将会在下面的说明书中部分阐明，一部分根据说明书是显而易见的，或者可以通过本实用新型实施例的实施而获知。

附图说明

图1为本实用新型一实施例提供的数字PCR荧光检测装置100的结构示意图；

图2为本实用新型一实施例提供的电动滑台的结构示意图；

图3为本实用新型一实施例提供的样品固定反应腔和温度控制组件的结构示意图；

图4为本实用新型另一实施例提供的样品固定反应腔和温度控制组件的结构示意图；

图5为本实用新型一实施例提供的光学组件的结构示意图；

图6为本实用新型一实施例提供的数字PCR荧光检测装置的光路示意图；

图7为本实用新型一实施例提供的数字PCR芯片的结构示意图；

图8为本实用新型一实施例提供的数字PCR芯片的截面结构示意图；

图9为本实用新型另一实施例提供的数字PCR芯片的结构示意图。

具体实施方式

以下所述是本实用新型实施例的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型实施例原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本实用新型实施例的保护范围。

下面分多个实施例对本实用新型实施例进行进一步的说明。其中，本实用新型实施例不限定于以下的具体实施例。在不变主权利的范围内，可以适当的进行变更实施。

如图1所示，本实施例提供了一数字PCR荧光检测装置100，包括

支撑底座10，支架20，载物台30，光学组件40。

其中，所述支撑底座10可以提供一个水平基准面，所述支架20，载物台30均可拆卸地固定在该水平基准面上；从而使整个所述通道荧光检测的数字PCR装置 100处于水平放置状态。可选地，所述支撑底座10配有若干个底座脚。所述底座脚在用于提供支撑之外，还可以调节高度以实现支撑底座10水平放置。本实用新型中，所述支撑底座截面形状可以但不限于为矩形形状。所述支撑底座的截面形状还可以为圆形、梯形或多边形。

其中，所述载物台设于所述支撑底座10表面，所述载物台30包括电动滑台31、固定在所述电动滑台31上的样品固定反应腔32和用于调控所述样品固定反应腔 32温度的温度控制组件33，所述样品固定反应腔32用于容置待测PCR样品；所述电动滑台31可沿X、Y轴二维方向移动；

其中，光学组件40，设置在所述支架20上，所述光学组件40包括光源部41、滤光片轮42、物镜43和CCD图像传感器44；其中，所述光源部41发出的光束依次经过所述滤光片轮42和所述物镜43之后照射到所述待测PCR样品内，所述待测 PCR样品经照射发出的发射光依次经所述物镜43和所述滤光片轮42后，进入所述 CCD图像传感器44以实现对所述待测PCR样品的荧光定量检测。

可选地，如图2所示，本实用新型所述实施例提供所述电动滑台31包括依次层叠设置在所述支撑底座10上的底板311、第一滑板312和第二滑板313，所述底板311与第一滑板312之间设有第一滑轨314和第一驱动电机315，以实现所述第一滑板312沿第一方向移动；所述第一滑板312和所述第二滑板313之间设有第二滑轨316和第二驱动电机317，以实现所述第二滑板313沿第二方向移动，所述第一方向和所述第二方向相互垂直。所述第一方向和所述第二方向为X轴和Y轴方向的任意一种。当第一方向为X轴方向时，第二方向为Y轴方向；当第一方向为Y轴方向时，第二方向为X轴方向。

其中，底板311与第一滑板312之间，靠近两端侧面区域，沿第一方向平行设有一对第一滑轨314，第一滑板312通过第一滑轨可以相对所述底板沿第一方向移动。通过增设第一驱动电机315可以实现电动调控所述第一滑板312沿第一方向移动。同样地，通过电动调控可以实现所述第二滑板313相对于第一滑板312沿第二方向移动。可选地，所述第一驱动电机或第二驱动电机可以为现有伺服电机、丝杆步进电机等。通过上位机或处理器等设备提供的指示电动调控整个电动滑台沿 X轴和Y轴方向移动，从而带动所述样品固定反应腔32同步移动。

本是实用新型中，参见图3，所述样品固定反应腔32包括腔体321、设于所述腔体321内的均温板322和与所述腔体321盖合的盖板323；所述样品固定反应腔32 置于所述电动滑台31上，所述温度控制组件33与所述均温板322电连接以对所述均温板322进行热传导；所述盖板323包括一透光区域324。

本实施例中，所述均温板322上可以平铺待测PCR样品325。可选地，所述均温板322具有良好的传热性能，整个所述均温板322上的温度分布均匀。通过与温度控制组件33电连接，可以用于提供PCR扩增反应所需要的温度梯度。可选地，所述均温板322的表面设有金镀层或银镀层。所述金镀层或银镀层可以提高均温板322的导热导电性能。可选地，所述金镀层或银镀层的厚度为1-5mm。

可选地，所述盖板323上还设有一连通所述腔体的通气接头326，如图3所示，所述通气接头用于连接外设的气压组件以调控所述腔体内的气压。

本实施例中，所述盖板的盖合可以使所述腔体形成一密封的空间。可选地，所述盖板323与所述腔体321之间还设有密封圈327。所述密封圈可以固定在盖板边缘上或固定在腔体边缘上。所述密封圈有利于提升盖板与腔体盖合后的密封效果。

本实施例中，所述样品固定反应腔32的所述腔体321可以但不限于为一开设有凹槽的支撑板。所述腔体321的底部为所述均温板322。

如图4所示，所述盖板323可以通过旋转轴328与所述腔体321连接，以实现所述盖板在腔体上通过轴翻转实现开合。当所述盖板盖合所述腔体时，所述盖板和所述腔体之间还设有锁扣。可选地，所述盖板还可以通过其他方式与所述腔体321 连接。

本实施例中，所述温度控制组件33可以但不限于设置在所述样品固定反应腔32和电动滑台31之间。可选地，所述样品固定反应腔32与所述电动滑台31之间通过设置立柱进行固定。可以选，如图4所示，所述样品固定反应腔32下设有一固定板329，所述固定板329固定在电动滑台的第二滑板上；所述样品固定反应腔32 和固定板329之间设有立柱330，以形成一容纳空间320，温度控制组件33设于所述容纳空间320内。

如图4，所述温度控制组33包括制冷片331、散热风道332、散热风扇333、散热器334和温度传感器；所述制冷片331与所述均温板322贴合以实现热传导；所述散热风道332用于提供空气流动的风道，所述散热风扇333置于散热风道332中以加速空气流动；所述散热器334通过所述散热风道332和所述散热风扇333对所述制冷片331进行散热，所述温度传感器用于监测所述制冷片的温度。

可选地，所述制冷片331可以但不限于包括半导体制冷片，所述制冷片331 既可以制冷也可以制热。所述温度传感器可设于所述制冷片331内以实时监测所述制冷片的温度。可选地，所述温度控制组33还可以通过配合上位机实现对温度的PID控制。所述散热器334可以有效对制冷片实施散热；所述散热器334可以为多根散热管组成。

本实施例中，所述制冷片331在与所述均温板322电连接的一面制冷时，所述制冷片331的热端面产生的热量可以通过散热器334进行热量传递，并通过散热风道332和散热风扇333热量向外传递，减少热端面热量积累，提高制冷速率。所述散热风扇的风扇速率档位可以实时调节，以使整个温度控制组33正常运行，并提供PCR扩增反应所需要的温度梯度。

本实施例中，见图1，所述光学组件固定在所述支架上；其中，所述物镜44 正对所述样品固定反应腔32盖板的透光区域，所述物镜43固定在样品固定反应腔 32的正上方；在所述物镜43远离所述样品固定反应腔32的一侧设有滤光片轮42。可选地，如图5所示，所述滤光片轮42包括多个滤光单元组421，所述滤光片轮42 为圆形盘状结构，多个所述滤光单元组421间隔分布在所述圆形盘状结构内，且以所述圆形盘状结构中心为圆心规则排布。每个所述滤光单元组421为一荧光通道。例如，滤光单元组421可以包括红光滤光通道、绿光滤光通道、蓝光滤光通道或近红外滤光通道。

可选地，所述物镜43包括平面消色差物镜，所述物镜具有自动聚焦功能。所述物镜具有电动聚焦结构，可以实现光学的自动聚焦；可以实现光学的自动聚焦和图像清晰化处理，省去手动聚焦操作，提高成像质量。可选地，所述物镜的放大倍数包括为4-20倍。优选地，所述物镜的放大倍数包括为4-8倍。

可选地，所述CCD图像传感器44与所述滤光片轮42平行设置在所述支架20 上，所述CCD图像传感器44与所述滤光片轮42之间设置有一直角转角器45，所述直角转角器45用于使经滤光片轮42发出的发射光直角转折以射入所述CCD图像传感器。通过所述直角转角器45可以光路进行90°转角，避免CCD图像传感器竖直固定在所述滤光片轮上，导致因CCD图像传感器竖直摆放造成整个装置过高而占用空间，因此，所述直角转角器45有利于整个装置的集成，降低数字PCR荧光检测装置的整体高度，减少空间占用。

可选地，所述CCD图像传感器44包括CCD相机；所述CCD相机用于对荧光通道进行高清晰的拍照成像，并将成像结果上传至电脑等上位机进行图像处理和分析计算。

本实用新型所述数字PCR荧光检测装置，能够提供PCR样品进行PCR扩增的温度控制组件，通过光学组件实现PCR的原位扩增检测，可以省去检测过程中存在的液滴转移等操作复杂，缩短了样本反应和检测时间，避免存在交叉污染和液滴破坏的风险，提高检测结果的准确性。

可选地，所述数字PCR荧光检测装置100还包括步进电机46，所述步进电机46 固定所述支架20上，所述步进电机46与所述滤光片轮42之间设有同步带47，通过所述步进电机46的转动以带动所述滤光片轮42转动，从而实现所述滤光片轮42内的多个滤光单元组421之间的切换。

可选地，所述光源部包括至少两种光源。如图5所示，光源部41包括第一光源411和第二光源412。

一并参见图5和图6所示，光源部41包括第一光源411和第二光源412；所述数字PCR荧光检测装置还包括合光器组件48，由所述至少两种光源发出的光束经所述合光器组件48后进入所述滤光片轮。所述滤光片轮42包括多个滤光单元组421，每个所述滤光单元组421包括激发光滤光片422、发射光滤光片423和二向色镜 424；当光源部41由单个光源发出光束时，光源部41发出的光束依次经过激发光滤光片422、二向色镜424和物镜43之后照射到待测PCR样品内325；所述待测PCR 样品525经照射发出的发射光依次经物镜42和二向色镜424和发射光滤光片423 后，进入所述CCD图像传感器44。

当光源部41由两个以上光源发出光束时，两个以上光源(例如第一光源411 和第二光源412)先经合光器组件48后形成的单一的光束后，依次经过激发光滤光片422、二向色镜424和物镜43之后照射到待测PCR样品内325；所述待测PCR 样品525经照射发出的发射光依次经物镜42和二向色镜424和发射光滤光片423 后，进入所述CCD图像传感器44。

本实施例中，合光器组件48可以但不限于为二向色镜组件，多个光源通过排放好位置，可以通过合光器组件48形成单一的光束。

例如，当本实用新型所述的数字PCR荧光检测装置具有FAM和HEX两个通道，所述滤光片轮可以但不限于包括两个滤光单元组；其中，一个滤光单元组为 FAM通道，FAM通道的激发光中心波长为470nm，发射光中心波长为525nm，二向色镜截止波长为505nm；另一个滤光单元组为HEX通道，所述HEX通道的激发光中心波长为530nm，发射光中心波长为565nm，二向色镜截止波长为550nm。所述滤光单元组中的激发光滤光片、发射光滤光片和二向色镜按照对应参数设置。

本实用新型所述数字PCR荧光检测装置能够实现多通道的荧光检测，可以采用电动方式实现不同荧光通道的自动切换，并结合CCD图像传感器和电动滑台对大检测区域的不同荧光通道进行多工位成像和图像处理，最终计算出样本浓度。所述装置可大大提高产品的检测速度、分析精度和自动化水平。

可选地，所述数字PCR荧光检测装置在光学检测的同时，电动滑台的运动流程与光学检测流程同步执行，在每一个工位对液滴进行成像处理，然后将多工位的图像进行拼接分析，删除图像重叠区域，实现大检测区域，高清晰的多工位成像和图像处理。

本实用新型所述数字PCR荧光检测装置还配备有数字PCR芯片，所述数字 PCR芯片平铺且固定在所述样品固定反应腔内，所述待测PCR样品置于所述数字PCR芯片内以进行数字PCR反应。

一并参见图7和图8，本实用新型另一实施例提供了一种数字PCR芯片，所述数字PCR芯片包括芯片基板50，所述芯片基板上设有储液口501、与所述储液口连通的第一流道502、储油口503、与所述储油口连通的第二流道504、液滴平铺腔 505和与所述液滴平铺腔连通的溢流口506；所述储液口501用于注入PCR反应液，所述储油口503用于注入油相试剂，所述液滴平铺腔505连通有一混合流道507，所述混合流道507远离所述液滴平铺腔505的一端设有混合入口508；所述第一流道502和所述第二流道504交汇于所述混合入口508，所述PCR反应液和所述油相试剂在所述混合入口508交汇生成液滴；在所述液滴平铺腔505内进行所述液滴的 PCR扩增反应和检测。

本实施例中，所述数字PCR荧光检测装置主要是对数字PCR芯片的液滴平铺腔505所在的平铺区域进行检测。相应地，所述样品固定反应腔的盖板的透光区域也主要其中在液滴平铺腔505的平铺区域。在所述液滴平铺腔505内，液滴是单层分布地，这样可以更加准确的对液滴进行PCR检测。可选地，所述溢流口506 与所述液滴平铺腔505之间可设置相互连通的第三流道509。

可选地，所述储液口501、所述储油口503或所述溢流口的截面横截面形状可以为圆形或矩形。所述储液口、所述储油口或所述溢流口可以为桶状或倒锥状的槽。所述储液口、所述储油口或所述溢流口可以但不限于在底部开设有连通流道的通孔。

可选地，所述储液口501的口径D为3-4mm，深度H为5-6mm；储油口503 的口径为5-6mm，深度为5-6mm；所述溢流口506的口径为5-6mm，深度为5-6mm。所述液滴平铺腔505的横截面长度为25-35mm，横截面宽度为10-20mm，高度为 0.08-0.12mm。所述液滴平铺腔至少可以容纳近2万个液滴。可选地，数字PCR 芯片中，通过提供正压力加入PCR反应液和油相试剂，使所述第一流道502流入的PCR反应液和所述第二流道504流入的油相试剂在所述混合入口508交汇， PCR反应液样本在流道中利用油相试剂的流动剪切力的作用高通量和大规模的生成分散的油包液滴。可选地，所述正压力值为30-50kPa。

可选地，所述数字PCR芯片生成的液滴的直径为0.05-0.1mm。可选地，所述混合入口508的孔径大小为0.05-0.1mm。

可选地，所述数字PCR芯片的所述液滴平铺腔内还设有若干个间隔排布的支撑柱。所述支撑柱可以有效防止液滴平铺腔在外界压力下出现塌陷，提高整个所述数字PCR芯片的牢固性和抗冲击能力。

可选地，所述数字PCR芯片的所述芯片基板上还设有一定位缺口510，参见图9。所述定位缺口一方面可以进一步防止数字PCR芯片的移动，起到定位作用，另一方面可以有效提示数字PCR芯片的摆放方位和，确保芯片的平铺区域正对着所述盖板的透光区域。

进一步地，可选地，所述数字PCR芯片的所述芯片基板50的一端表面还设有标示区域511。所述标示区域可以用于记录样本的条码和版本信息，以便对检测样品进行跟踪和追溯。

本实施例中，所述芯片基板的材质为透光材质。所述数字PCR芯片的液滴平铺腔的顶面和底面均为平面。所述数字PCR芯片平铺在所述样品固定反应腔内的均温板上。所述数字PCR芯片在所述样品固定反应腔内，通过设置样品固定反应腔内的PCR程序扩增温度参数，可以实现PCR扩增，并光学组件的检测下，实现 PCR原位扩增检测。

进一步地，通过所述样品固定反应腔的盖板上的通气接头，使样品固定反应腔内设有大于100kPa的清洁气压，可以有效防止所述数字PCR芯片的储液口、储油口或溢流口内的液体在加热过程中的挥发。

本实施例中，所述数字PCR荧光检测装置配备有数字PCR芯片后，可以实现对待测PCR样品的微液滴的生成、PCR扩增反应至光学检测的一体化分析检测；相比于传统的PCR检测装置，本实用新型所述的数字PCR荧光检测装置将更高效、更便携和更自动化；并且由于从微液滴的生成、PCR扩增反应至光学检测的三个过程中均没有其他转移等过程，避免交叉污染和液滴破坏的风险，因此，本实用新型数字PCR荧光检测装置的检测数据更加精准可靠。

以上所述实施例仅表达了本实用新型的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本实用新型专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本实用新型的保护范围。因此，本实用新型的保护范围应以所附权利要求为准。