用于治疗由衰老细胞介导的病症和用于治疗癌症的基于肽的蛋白酶体抑制剂的制作方法

优先权

本申请要求于2017年12月30日提交的美国临时专利申请62/612,411、62/612,414、62/612,416、62/612,417和62/612,418以及2018年5月25日提交的62/676,692的优先权。本申请还要求2018年12月28日提交的国际申请pct/us2018/068003的优先权。上述申请通过引用整体并入本文以用于所有目的。

以下公开和要求保护的技术一般地涉及蛋白酶体的活性以及如何在靶细胞中抑制它们。特别地，本公开提供了适用于治疗由衰老细胞介导的病症和用于治疗癌症的新的蛋白酶体抑制剂家族。

背景技术：

衰老细胞的特征在于细胞不再具有复制能力但保留在起源组织中，从而引起衰老相关联的分泌表型(sasp)。本公开的前提是许多年龄相关病症由衰老细胞介导，并且在临床上可以利用从该病症或其周围的组织中选择性去除该细胞来治疗这类病症。

us2016/0339019a1(laberge等人)描述了使用mdm2抑制剂、bcl抑制剂和akt抑制剂治疗某些年龄相关病症。us20170266211a1(david等人)描述了特定bcl抑制剂用于治疗年龄相关病症的用途。美国专利8,691,184、9,096,625和9,403,856(wang等人)描述了小分子文库中的bcl抑制剂。

与衰老细胞在人类疾病中的作用相关的其他公开包括授权前公开文本us2017/0056421a1(zhou等人)、wo2016/185481(yedainst.)、us2017/0216286a1(kirkland等人)和us2017/0281649a1(david)；以及furhmann-stroissnigg等人(natcommun.2017sep4；8(1):422)、blagosklonny(cancerbiolther.2013dec；14(12):1092-7)和zhu等人(agingcell.2015aug；14(4):644-58)的文章。

在先前不相关的领域中，蛋白酶体复合物靶向治疗癌症和其他病症在park等人,translres.2018aug；198:1-16，以及在dou等人,currcancerdrugtargets.2014；14(6):517-36中被提及。自2010年以来的蛋白酶体抑制剂专利由metcalf等人,expertopintherpat.2014apr；24(4):369-8做过评论。

技术实现要素：

本发明的新蛋白酶体抑制剂是具有短线性氨基酸序列的基于肽的化合物。环状氧代或硫代基团与n末端氨基酸连接。蛋白质反应性亲电子基团，如环氧酮、氮丙啶基酮或β-内酯与c末端氨基酸连接。在与靶细胞中的蛋白酶体复合物接触后，亲电子基团与蛋白酶体的结合口袋或活性位点中或附近的官能团反应，形成共价键，从而使蛋白酶体失活。

某些生物化学途径在衰老细胞中比在其他细胞类型中更具活性。用于治疗衰老病症的现有药物基于bcl蛋白家族或mdm2的抑制剂。本公开部分基于蛋白酶体途径也在衰老细胞中选择性表达这一发现。这为靶向衰老细胞而不会过度损害靶组织中相邻非衰老细胞的活性提供了机遇之窗。在体外或体内使衰老细胞接触小分子抗衰(senolytic)剂选择性地调节或消除这类细胞。抑制剂可用于向受试者的靶组织施用，从而选择性地消除该组织中或周围的衰老细胞，并缓解由衰老细胞引起或介导的一种或多种疾病或衰老的症状或体征。

可以筛选下文描述的新蛋白酶体抑制剂和具有其他结构的蛋白酶体抑制剂的蛋白酶抑制活性和选择性消除衰老细胞或癌细胞的能力。可以开发具有必需活性的化合物用于治疗诸如骨关节炎、眼科疾病、肺病和动脉粥样硬化之类的病症。

在下面的描述、附图和所附权利要求书中提出了本发明。

附图说明

图1a和1b显示了根据本发明的示例性蛋白酶体抑制剂的结构。图1c显示了可新应用于治疗衰老疾病的现有已知的蛋白酶体抑制剂。

图2a和2b显示了用以确认选择性杀死衰老细胞而使非衰老细胞保持完整的化合物的筛选试验的结果。图2a提供了选自图1a和1c的结构的抗衰活性和蛋白酶体结合的数据。图2b提供了选自图1b的结构的抗衰活性和蛋白酶体结合的数据。

图3a、3b和3c分别显示了骨关节炎模型中衰老细胞标志物p16、il-6和mmp13的表达。图4a显示了有效的抗衰剂在骨关节炎模型中恢复对治疗小鼠的对称负重。图4b、4c和4d是显示这些小鼠中关节的组织病理学的图像。测试抗衰剂有助于防止或逆转蛋白多糖层的破坏。

图5a和5b显示当玻璃体内施用抗衰剂时，小鼠氧诱导的视网膜病(oir)模型中新血管形成和血管闭塞的逆转。图5c和5d取自用于糖尿病性视网膜病的链脲佐菌素(stz)模型。stz诱导的血管渗漏通过玻璃体内施用抗衰剂而减弱。

图6显示了用抗衰剂去除衰老细胞有助于在用于香烟烟雾(cs)诱导的copd(慢性阻塞性肺病)的小鼠模型中恢复氧饱和度(spo2)。

图7显示了取自动脉粥样硬化的小鼠模型的数据，其中缺乏ldl受体的近交小鼠喂食高脂肪饮食。右小图显示了主动脉中斑块的染色。中间小图定量地显示了，通过用抗衰剂治疗，减少了被斑块覆盖的主动脉的表面积。

图8是蛋白酶体途径及其在通过泛素化标记的蛋白质的破坏中的作用的示意图。

具体实施方式

衰老细胞医学涵盖与衰老或组织损伤相关联的许多病症由衰老细胞引起或介导的范例。这些细胞不再复制，但具有包括触发病理生理学的因子的分泌的分泌表型。本公开显示蛋白酶体途径在衰老细胞中是有活性的，并且可以用作从靶组织去除衰老细胞的有效手段，作为其他途径(如bcl或mdm2)的替代方案。提供了新的蛋白酶体抑制剂家族作为本发明的一部分。

蛋白酶体功能

蛋白酶体是由28个亚基组成的蛋白质复合物，所述亚基排列成四个堆叠的环，每个环具有7个亚基(两个外部α1-7-环和两个内部β1-7-环)。催化蛋白酶活性来自3个β亚基：胰凝乳蛋白酶样(ct-l)活性(β5)、胰蛋白酶样(t-l)活性(β2)和半胱天冬酶样或后酸(pa)活性(β1)。

图8提供了蛋白酶体在细胞中的作用的示意图。蛋白酶体是泛素-蛋白酶体-系统(ups)的效应器组分，在该系统中，其通过蛋白水解降解泛素化蛋白质。泛素化是泛素蛋白质作为标签与赖氨酸残基共价连接的翻译后修饰。一系列酶进行一连串的反应，包括e1活化酶、e2共轭酶和e3连接酶。泛素本身含有可以通过添加更多的泛素单元来增殖泛素化的循环的赖氨酸残基。k48和k11的泛素化标记蛋白质以由蛋白酶体降解。这些被标记为降解的泛素化蛋白质由信号传导途径的组分和错误折叠或损坏的蛋白质组成。

ups途径对于用存活所需的氨基酸补充细胞是重要的。已经在衰老细胞中观察到蛋白酶体水平降低，而相应的受损(氧化)和泛素化的蛋白质水平增加。通过ups系统调节参与存活和凋亡途径的几种蛋白质。衰老细胞具有失调的存活/凋亡平衡，蛋白酶体抑制被认为是抗老的。

新的蛋白酶体抑制剂

图1a和1b描绘了在制备本发明时首次合成的小分子化合物家族。这些化合物及其类似物被设计用于抑制蛋白酶体活性，并且适用于进行测试和开发以便消除衰老细胞或治疗衰老相关联病症。它们还可用于消除癌症治疗中的癌性或过度增殖性细胞的目的。

本发明的蛋白酶体抑制剂是具有多个(通常3至7个)氨基酸残基的肽化合物，其中n末端残基的氨基被氧代或硫代基团取代，并且c末端残基被修饰为包括一种亲电子基团。一些感兴趣的蛋白酶体抑制剂可以表征为环氧酮或α-羟基乙酰胺。

示例性的是具有式(i)所示结构的化合物：

其中：

x是o或s；

r⁰选自h、烷基、取代的烷基、烷酰基、取代的烷酰基、烷基氨基羰基、取代的烷基氨基羰基、烷氧基羰基、取代的烷氧基羰基、烷基氨基硫代羰基、取代的烷基氨基硫代羰基、烷氧基硫代羰基、取代的烷氧基硫代羰基和前部分(promoiety)；

r¹选自烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳基烷基和取代的杂芳基烷基；

(aa)n是2至7个独立选择的氨基酸残基(通常3或4个氨基酸)的线性序列，其中(aa)n的c末端残基包括包含z的修饰的c末端；以及

z是蛋白酶体-反应性亲电子基团。

当在本上下文中使用时，术语“氨基酸”是指天然存在的或非天然存在的l构型或d构型的氨基酸。对于本发明的等同物，序列(aa)n中的一个或多个氨基酸可以被通过不是肽键的共价键与结构的其余部分连接的氨基酸类似物取代，其中该类似物具有侧链(rx)、反应性质和与相应氨基酸基本相同的构型。

作为蛋白酶体抑制剂一部分的“蛋白酶体-反应性亲电子基团”是亲电子部分，该亲电子部分在与靶蛋白酶体接触后，与蛋白酶体的结合口袋或活性位点附近的官能团(氨基酸残基上的亲核侧链)反应，从而形成共价键或共价可逆键并抑制蛋白酶体发挥其生物学功能。蛋白质反应性的亲电子基团包括j.krysiak和r.breinbauer,topcurrchem(2012)324:43–84中所教导的环氧化物、迈克尔受体、二硫化物、内酯、b-内酰胺和醌。另见theorganicchemistryofdrugdesignanddrugactionbysilvermanandholladay,3rded.academicpress,2014中的第5章，第207-265页。在此处所示的示例中，亲电子基团位于抑制剂结构内，以便与蛋白酶体末端催化苏氨酸的β-羟基反应。

本发明包括根据式(i)的化合物，其中z选自环氧酮基团、氮丙啶基酮基团、硼酸盐、硼酸酯和β-内酯。本发明包括式(i)的化合物，其中(aa)n是三个独立选择的氨基酸残基的序列，其中(aa)n的c末端残基被修饰为包括z。c末端羧酸可以被修饰为酮，如环氧酮或氮丙啶基酮，或c末端羧酸可以用硼酸盐或硼酸酯代替。

本发明的蛋白酶体抑制剂也可以符合式(ii)中所示的结构：

其中：

r²至r⁴独立地选自烷基、取代的烷基、芳烷基、取代的芳烷基、杂芳基烷基和取代的杂芳基烷基；以及

z¹是环氧基或氮丙啶基。

式(ii)的蛋白酶体抑制剂化合物包括式(iii)的化合物：

其中y选自o和nr¹⁵；以及r⁵和r¹⁵独立地选自h、c(1-6)烷基和取代的c(1-6)烷基。

本发明包括式(i)的化合物，其中r¹至r⁴独立地选自c(1-6)烷基、取代的c(1-6)烷基、c(1-6)羟烷基、取代的c(1-6)羟烷基、c(1-6)烷氧基-c(1-6)烷基、取代的c(1-6)烷氧基-c(1-6)烷基、芳基-c(1-6)烷基、取代的芳基-c(1-6)烷基、杂芳基-c(1-6)烷基、取代的杂芳基-c(1-6)烷基、环烷基-c(1-6)烷基、取代的环烷基-c(1-6)烷基、杂环-c(1-6)烷基和取代的杂环-c(1-6)烷基。

本发明的蛋白酶体抑制剂化合物可以通过式(iiia)或式(iv)进一步描述：

在任何上述结构中，

x可以是o或s；

r⁰可以是r¹⁰-或r¹⁰-q-；

q可选自乙二醇、聚乙二醇、-c(＝o)-、-nr¹¹c(＝o)-、-oc(＝o)-、-c(＝s)-、-nr¹¹c(＝s)-、-oc(＝s)-和-oc(＝s)-；以及

r¹⁰和r¹¹可以独立地选自h、烷基和取代的烷基。

在任何上述结构中，r⁰可选自以下结构：

其中：

m是1至6的整数；

p是1至30的整数；

x’选自o、s和nr¹⁴；以及

r¹²和r¹³独立地选自h、烷基和取代的烷基，或r¹²和r¹³循环连接，并与它们所连接的氮原子一起提供任选进一步被取代的杂环；以及

每个r¹⁴独立地选自h、c(1-6)烷基和取代的c(1-6)烷基。

在任何上述结构中，r⁰可选自以下结构：

其中：

q是1到3的整数；

y²选自o和nr¹⁵；以及

r¹⁵选自h、c(1-6)烷基和取代的c(1-6)烷基。

在任何上述结构中，r¹可选自c(1-6)烷基、芳基-c(1-6)烷基、取代的芳基-c(1-6)烷基、环烷基-c(1-6)烷基和取代的环烷基-c(1-6)烷基。r²和r⁴可选自c(1-6)烷基、取代的c(1-6)烷基、c(1-6)烷氧基-c(1-6)烷基、取代的c(1-6)烷氧基-c(1-6)烷基、c(1-6)羟烷基和取代的c(1-6)羟烷基。此外，r³可以选自芳基-c(1-6)烷基、取代的芳基-c(1-6)烷基、c(1-6)烷氧基-c(1-6)烷基和取代的c(1-6)烷氧基-c(1-6)烷基。

在任何上述结构中，r¹可选自苯基-c(1-6)烷基、环烷基-c(1-6)烷基和c(1-6)烷基。r²可选自c(1-6)烷氧基-c(1-6)烷基、c(1-6)烷基和c(1-6)羟烷基。有时，r³选自苯基-c(1-6)烷基、环烷基-c(1-6)烷基、c(1-6)烷氧基-c(1-6)烷基和c(1-6)羟烷基。另外，r⁴可以是c(1-6)烷基。

在任何上述结构中，r¹可选自苯乙基、环丙基-甲基和丙基。r²可选自甲氧基甲基、异丁基和1-羟基-乙基。有时，r³选自苯甲基、环丙基-甲基、甲氧基甲基和1-羟基-乙基。另外，r⁴可以是异丁基。

本发明包括式(va)至(vd)的蛋白酶体抑制剂化合物：

本发明的蛋白酶体抑制剂化合物包括根据式(vi)和式(vii)的化合物。任选地，y可以是o以及r⁵可以是甲基；x可以是o或s。

图1a和1b显示了根据本发明的蛋白酶体抑制剂的示例。

图1a中所示的一些结构不符合上述通用结构：特别是，x不是o或s，而是nh。尽管如此，这些结构中的许多都是新颖的并且作为本发明的一部分被包括。图1b示出了当前商业应用的26个非限制性示范。在这些示范中，r1通常是苯基乙基，但也可以是c(1-4)烷基。r2通常是异丁基(亮氨酸)，但可以是c(1-4)烷氧基或c(1-4)羟烷基。r3通常是苯基甲基(苯丙氨酸)。r2总是异丁基(亮氨酸)。y总是o而r5总是甲基。x-r0可以是–oh、–o(＝o)nhch3、-s-(ch2)3n(ch3)2、–o–(ch2)2n(ch3)2、–o(ch2)3n(ch3)2、–s–(ch2)2–o–(ch2)2–o–ch3、–oc(＝o)ch2–n(–ch2)2o(ch2)2–)，以及–oc(＝o)ch3中的任何一种。每个取代基可以被相应的替代物之一取代以进行进一步测试。

用于开发和使用上文和附图中所示的所选蛋白酶体抑制剂的技术在下面的描述中阐述。

其他蛋白酶体抑制剂

除了上面提到的基于肽的蛋白酶体抑制剂之外，本领域目前已知的或将在以后开发的任何蛋白酶体抑制剂可以开发为抗衰剂。图1c提供了先前描述为蛋白酶体抑制剂的小分子化合物的示例性列表。其他小分子蛋白酶体抑制剂在metcalf等人,expertopintherpat.2014apr；24(4):369-8中被评论。任何这些化合物都适用于测试和开发，以便根据本发明消除衰老细胞或治疗衰老相关联病症。

筛选化合物的抗衰活性

上面提到的和附图中描述的各种蛋白酶体抑制剂可以按分子水平来筛选它们的表现能力，即表明它们是根据本发明使用的候选试剂的能力。可以在分子测定中测试化合物抑制蛋白酶体活性的能力。实施例1提供了用于该目的测定。

替代地或附加地，可以筛选化合物特异性杀死衰老细胞的能力。使培养的细胞与化合物接触，并且测定细胞的细胞毒性或抑制程度。可以将化合物杀死或抑制衰老细胞的能力与化合物对在低密度下自由分裂的正常细胞和在高密度下处于静止状态的正常细胞的作用进行比较。实施例2和3提供了使用人靶组织成纤维细胞imr90细胞系和huvec细胞杀死衰老细胞的说明。类似的方案是已知的并且可以开发或优化用于测试细胞杀死或抑制其他衰老细胞和其他细胞类型(例如癌细胞)的能力。

图2a和2b显示了用以确认选择性杀死衰老细胞而使非衰老细胞保持完整的化合物的筛选试验的结果。图2a提供了选自图1a和1c的结构的抗衰活性和蛋白酶体结合的数据。图2b提供了选自图1b的结构的抗衰活性和蛋白酶体结合的数据。

术语“ec50μm”表示杀死50％细胞所需的分子浓度。标题“经照射的imr90ec50μm”表示针对通过照射得以衰老的imr90细胞的效力。标题“imr90hdec50μm”表示针对以高密度(hd)铺板的非衰老细胞的效力。这些细胞由于接触抑制而没有增殖作用，但尚未达到衰老。

对于本公开中提出的任何和所有的抗衰剂，本发明包括对于经照射的imr90细胞或huvec细胞具有小于10、小于1、小于0.1和小于0.02μm的ec50μm或ec50μm介于0.02和1之间或介于0.02和0.1μm之间的化合物。本发明包括与非衰老细胞或增殖细胞相比，对经照射的imr90细胞具有至少2、5、10、20或50倍的特异性指数(较低的ec50)的化合物。

可以在特定疾病的动物模型中进一步筛选根据本发明的有效选择性杀死体外衰老细胞的候选抗衰剂。下面的实施例4、5、6和7分别提供了骨关节炎、眼病、肺病和动脉粥样硬化的说明。

药剂配制和包装

根据本发明使用的药剂的制备和配制可以包含标准技术，例如，在当前版本的remington:thescienceandpracticeofpharmacy中所述的标准技术。制剂通常将优化用于以增强活性剂进入靶抗衰细胞并提供最佳效果持续时间，同时最小化副作用或暴露于不参与治疗病症的组织的方式，施用于靶组织，例如通过局部给药施用。

本发明提供商业产品，其是装有单位剂量的一种或多种本公开中描述的试剂或组合物的试剂盒。这类试剂盒通常包含含于一个或多个容器中的药物制剂。制剂可以作为一个或多个单位剂量(组合或单独)提供。试剂盒可以包含用于在有此需要的受试者的靶组织中或周围施用试剂或组合物的装置，如注射器。产品还可以包含或附有描述药物在治疗衰老细胞相关联病症中的用途和伴随益处的信息包装说明书，以及任选地用于递送组合物的器具或装置。

治疗设计和给药方案

衰老细胞随着年龄而累积，这就是衰老细胞介导的病症在老年人中更频繁发生的原因。此外，对肺组织的不同类型的应激可以促进衰老细胞的出现和它们表达的表型。细胞应激物包括氧化应激、代谢应激、dna损伤(例如，由环境紫外线暴露或遗传病引起)、癌基因激活和端粒缩短(例如，由过度增殖引起)。受这类应激物影响的组织可能具有较高的衰老细胞患病率，这反过来可能导致在较早的年龄或以更严重的形式显现某些病症。对某些病症的遗传易感性表明，介导疾病的衰老细胞的累积可能直接或间接地受到遗传成分的影响，这可能导致较早的显现。

衰老细胞范例的益处之一是衰老细胞的成功去除可以为受试者提供长期治疗效果。衰老细胞基本上是非增殖性的，这意味着具有更多衰老细胞的组织的随后再增殖可以仅通过将该组织中的非衰老细胞转化为衰老细胞—与简单增殖相比需要相当长的时间的过程—来发生。作为一般原则，利用本发明的抗衰剂的足以从靶组织中除去衰老细胞的一段时间的疗法(例如，每天、半周或每周，在几天、一周或几周的时间内给予单剂量或多个剂量)可以为受试者提供一段药效期(例如，两周、一个月、两个月或更长时间)，在此期间不施加抗衰剂，并且受试者经历治疗病症的一种或多种不良体征或症状的缓解、减轻或逆转。

适合治疗的衰老相关病症

本发明的抗衰剂可用于预防或治疗各种衰老相关病症。这些病症通常(尽管不一定)的特征在于，在病症部位中或周围有过多的衰老细胞(例如表达p16和其他衰老标志物的细胞)，或p16和其他衰老标志物与在未受影响的组织中这类细胞的频率或这类表达的水平相比表达过度。目前感兴趣的非限制性示例包括骨关节炎、眼病、肺病和动脉粥样硬化的治疗，如以下部分所示。

为了用根据本发明的抗衰剂治疗特定的衰老相关病症，治疗方案将取决于衰老细胞的位置，以及疾病的病理生理学。局部疾病，例如骨关节炎、眼病和肺病，可以通过抗衰剂的局部给药来治疗。动脉粥样硬化是播散性疾病的示范，其较通常地通过全身给药来治疗。

骨关节炎的治疗

本公开中列出的抗衰剂可以开发用于治疗骨关节炎，或用于选择性地消除有此需要的受试者的关节中或周围的衰老细胞，包括但不限于受骨关节炎影响的关节。

骨关节炎退行性关节病的特征在于软骨在高机械应力、骨硬化以及滑膜和关节囊增厚的部位的纤维化。纤维化是涉及软骨表层分裂的局部表面解体。早期分裂遵循主要胶原束的轴，与软骨表面相切。软骨内的胶原蛋白变得杂乱无章，并且蛋白多糖从软骨表面消失。在关节中没有蛋白多糖的保护和润滑作用的情况下，胶原纤维变得易于降解，并且随后发生机械破坏。患上骨关节炎的诱发风险因素包括年龄增长、肥胖、既往关节损伤、关节的过度使用、大腿肌肉无力和遗传。骨关节炎的症状包括在不活动或过度使用后关节疼痛或僵硬，尤其是臀部、膝盖和腰部；休息后僵硬，运动后消失；活动后或一天结束时疼痛加重。

根据本发明的化合物可用于减少或抑制关节中蛋白多糖层的损失或侵蚀、减轻受影响关节中的炎症，并促进、刺激、增强或诱导胶原蛋白(如2型胶原)的产生。化合物可以引起关节中产生的炎性细胞因子(例如il-6)的量或水平的降低，从而减轻炎症。化合物可用于治疗骨关节炎和/或诱导受试者的关节中胶原蛋白(如2型胶原蛋白)的产生。化合物还可用于降低、抑制或减少降解关节中的胶原蛋白的金属蛋白酶13(mmp-13)的产生，并且用于恢复蛋白多糖层或抑制蛋白多糖层的损失和/或降解。

用根据本发明的抗衰剂治疗的潜在益处包括抑制或逆转软骨或骨侵蚀。抗衰化合物可以恢复或抑制关节强度的恶化，或减少关节疼痛。

眼科病症的治疗

本公开中列出的抗衰剂可用于通过去除有此需要的受试者眼内或眼周围的衰老细胞来预防或治疗该受试者的不良眼科病症，由此该疾病的至少一种的体征或症状的严重程度降低。这类病症包括眼后疾病和眼前疾病。本公开中列出的抗衰剂可以开发用于选择性地消除有此需要的受试者的眼组织中或周围的衰老细胞。

可根据本发明治疗的眼病包括老花眼、黄斑变性(包括湿性或干性amd)、糖尿病性视网膜病和青光眼。

黄斑变性是以眼后疾病为特征的神经退行性病症。它导致视网膜中央部分(称为黄斑)中感光细胞的损失。黄斑变性可以是干性或湿性。干性形式比湿性形式更常见，其中约90％的年龄相关性黄斑变性(amd)患者被诊断为干性形式。湿性形式的所述疾病可导致更严重的视力丧失。年龄和某些遗传因素和环境因素可能是患上amd的危险因素。环境因素包括例如ω-3脂肪酸摄入、雌激素暴露和维生素d的血清水平升高。遗传风险因素可包括例如降低的眼dicer1水平，以及减少的微rna和dicer1消融。

干性amd与导致感光细胞损失的视网膜色素上皮(rpe)层的萎缩相关联。干性形式的amd可以由黄斑组织的老化和变薄以及黄斑中的色素沉积引起。对于湿性amd，新血管可在视网膜下生长并渗漏血液和流体。异常渗漏的脉络膜新生血管形成可导致视网膜细胞死亡，从而在中央视力中产生盲点。年轻患者也可能出现不同形式的黄斑变性。非年龄相关的病因可以与例如遗传特征、糖尿病、营养缺乏、头部损伤或感染相关。

黄斑的布鲁赫氏膜下面的渗出物(玻璃疣)的形成可以是黄斑变性可进展的物理征兆。黄斑变性的症状包括，例如，直线的感知失真，并且在一些情况下，视觉中心看起来比场景的其余部分更加失真；一个黑暗、模糊的区域或“白化”出现在视觉中心；或颜色感知改变或减弱。

另一种眼后疾病是糖尿病性视网膜病(dr)。根据维基百科，dr的第一阶段是非增殖性的，并且通常没有实质性症状或体征。npdr可通过眼底照相检测到，其中可以看到微动脉瘤(动脉壁中的微观充血凸起)。如果视力下降，可以进行荧光血管造影以观察眼睛后部。可以清楚地看到视网膜血管狭窄或阻塞，这称为视网膜缺血(缺乏血流)。在npdr的任何阶段都可能发生血管将其内容物渗漏到黄斑区域的黄斑水肿。黄斑水肿的症状是视力模糊以及双眼中暗化或失真图像不一致。百分之十(10％)的糖尿病患者会出现与黄斑水肿相关的视力丧失。光学相干断层扫描可以显示黄斑水肿的视网膜增厚(由液体积聚导致)的区域。

在dr的第二阶段，作为增殖性糖尿病性视网膜病变(pdr)的一部分，在眼后形成异常的新血管(新血管形成)；因为这些新血管是脆弱的，它们可能爆裂并流血(玻璃体出血)并模糊视力。这种流血第一次发生时，可能不是很严重。在大多数情况下，它只会留下一些血迹，或者在人的视野中留下漂浮的斑点，但是斑点经常在几个小时后消失。这些斑点经常在几天或几周内被更大的血液渗漏所覆盖，这会使视力模糊。在极端情况下，一个人的那只眼睛中可能只能辨认光线与黑暗。要从眼睛内部的任何部位清除血液可能需要几天到几个月甚至几年，并且在某些情况下血液不会清除。这些类型的大出血往往不止一次，通常在睡眠期间发生。在眼底检查中，医生会看到棉毛斑点、火焰出血(类似的病变也是由clostridiumnovyi的α-毒素引起)和点状-印迹出血。

老花眼是一种与年龄相关的病症，其中由于正常眼睛的调节速度和幅度随着年龄的增长而降低，眼睛聚焦在近处物体上的能力逐渐减弱。晶状体的弹性丧失和睫状肌的收缩性丧失可导致老花眼。前晶状体囊和后晶状体囊的力学性质的年龄相关变化表明后晶状体囊的机械强度随年龄显著降低。眼囊的层压结构也改变并且可以至少部分地由组织的组成变化导致。

本公开提供的化合物可以减缓iv型胶原网络的解体，减少或抑制上皮细胞迁移，并且还可以延迟老花眼的发作或减少或减缓病症的进行性严重性。它们也可用于白内障手术后，以减少pco发生的可能性。

可用抗衰剂治疗的另一种病症是青光眼。通常，清澈的流体流入并流出眼睛的前部，称为前房。在患有开放性/广角性青光眼的个体中，清澈的流体排出太慢，导致眼内压力增加。如果放任不治疗，眼睛中的高压随后会损伤视神经并会导致完全失明。周边视力的丧失由视网膜中神经节细胞的死亡引起。疗法对抑制青光眼进展的影响可通过自动视野检查、前房角镜检查、成像技术、扫描激光断层扫描、hrt3、激光偏振测量、gdx、眼睛相干断层扫描、眼底镜检查和测定中央角膜厚度的测厚仪测量来监测。

可用抗衰剂治疗的眼科病症包括缺血性或血管病症，例如糖尿病性视网膜病、青光眼性视网膜病、缺血性动脉性视神经病，以及以动脉和静脉闭塞为特征的血管疾病、早产儿视网膜病和镰状细胞视网膜病。

可用抗衰剂治疗的眼科病症包括退行性病症，例如皮肤松弛症、上睑下垂、干燥性角膜炎、fuch氏角膜营养不良、老花眼、白内障、湿性年龄相关性黄斑变性(湿性amd)、干性年龄相关性黄斑变性(干性amd)；退行性玻璃体疾病，包括玻璃体黄斑牵引(vmt)综合征、黄斑裂孔、视网膜前膜(erm)、视网膜撕裂、视网膜脱离和增殖性玻璃体视网膜病变(pvr)。

可用抗衰剂治疗的眼科病症包括遗传病症，例如色素性视网膜炎、stargardt病、best病和leber氏遗传性视神经病(lhon)。可用根据本发明的抗衰剂治疗的眼科病症包括由细菌、真菌或病毒感染引起的病症。这些病症包括由诸如带状疱疹水痘(hzv)、单纯疱疹病毒、巨细胞病毒(cmv)和人类免疫缺陷病毒(hiv)之类的病原体引起或引发的病症。

可用抗衰剂治疗的眼科病症包括炎性病症，例如点状脉络膜炎(pic)、多灶性脉络膜炎(mic)和匍行性脉络膜病。可用根据本发明的抗衰剂治疗的眼科病症还包括医源性病症，例如玻璃体切除术后白内障和放射性视网膜病。

用根据本发明的抗衰剂治疗的潜在益处包括逆转或抑制眼部疾病的导致视网膜功能受损和视力丧失的任何上述体征和症状(例如新血管形成、血管闭塞和眼内压升高)的进展。

肺部病症的治疗

本公开中列出的抗衰剂可以开发用于治疗肺病，或用于选择性地消除有此需要的受试者的肺内或周围的衰老细胞。可以根据本发明治疗的肺病包括特发性肺纤维化(ipf)、慢性阻塞性肺病(copd)、哮喘、囊性纤维化、支气管扩张和肺气肿。

copd是由肺组织破裂、肺气肿和小气道功能障碍、阻塞性细支气管炎引起的持续不良气流所限定的肺病。copd的主要症状包括呼吸短促、喘息、胸闷、慢性咳嗽和痰液过量产生。来自香烟烟雾激活的中性粒细胞和巨噬细胞的弹性蛋白酶可以使肺泡结构的细胞外基质解体，从而导致空气空间增大和呼吸能力丧失。copd可能例如由几十年来发生的烟草烟雾、香烟烟雾、雪茄烟雾、二手烟雾、烟斗烟雾、职业暴露、暴露于灰尘、烟雾、烟气和污染引起，从而将老龄化视为患上copd的风险因素。烟草烟雾中高浓度的自由基可导致细胞因子释放，作为对气道中刺激物的炎症反应的一部分，从而导致蛋白酶对肺的损害。

copd的症状可以包括呼吸短促，喘息，胸闷，早上因为肺部粘液过多而需要先清清喉咙，会产生可能是清的、白的、黄的或绿的痰液的慢性咳嗽，紫绀，频繁的呼吸道感染，精力不足和意外的体重减轻。

肺纤维化是一种慢性和进行性肺病，其特征在于肺的硬化和瘢痕形成，这可导致呼吸衰竭、肺癌和心力衰竭。纤维化与上皮细胞的修复相关联。成纤维细胞被激活，细胞外基质蛋白的产生增加，并且向收缩的肌成纤维细胞的转分化有助于伤口收缩。临时基质堵塞受损的上皮细胞并为上皮细胞迁移提供支架，涉及上皮-间质转化(emt)。与上皮损伤相关联的失血诱导血小板活化，生长因子的产生和急性炎症反应。通常，上皮屏障愈合并且炎症反应消退。然而，在纤维化疾病中，成纤维细胞反应继续，导致伤口愈合未解决。成纤维细胞灶的形成是该疾病的特征，反映了正在进行的纤维发生的位置。

具有患上肺纤维化风险的受试者包括，例如暴露于环境或职业污染物的那些人，例如石棉沉滞症和矽肺病患者；那些抽烟的人；那些患有结缔组织疾病(如ra、sle、硬皮病、结节病或wegener氏肉芽肿病)的人；那些感染者；那些服用某些药物(包括例如胺碘酮、博来霉素、白消安、甲氨蝶呤和呋喃妥因)的人；那些接受胸部放射疗法的人；以及家庭成员患有肺纤维化的那些人。

可以通过使用根据本发明的化合物治疗的其他肺病包括肺气肿、哮喘、支气管扩张和囊性纤维化。烟草烟雾、职业暴露于灰尘、烟雾或烟气、感染或导致炎症的污染物也会加剧肺部疾病。

支气管扩张可以由气道损伤引起，该损伤导致气道扩张并变得松弛并结疤。支气管扩张可以由损害气道壁或抑制气道清除粘液的医学病症引起。这些病症的示例包括囊性纤维化和原发性纤毛运动障碍(pcd)。当只有一部分肺受到影响时，这种紊乱可能是由于阻塞而不是医学病症引起的。

用于治疗或降低肺病的可能性的本发明方法也可用于治疗衰老并具有肺功能丧失或肺组织退化的受试者。治疗的效果可以使用评估肺的机械功能的技术来确定，例如，可以执行测量肺活量、弹性和气道超敏的技术。例如，可以测量呼气储备容积(erv)、用力肺活量(fvc)、用力呼气量(fev)(例如，一秒内fev，fev1)、fev1/fev比率、用力呼气流量25％至75％，以及最大自主通气量(mvv)、呼气峰值流量(pef)、慢肺活量(svc)。还可以测量外周血管氧饱和度(spo2)；正常的氧水平通常介于95％和100％之间。spo2水平低于90％表明受试者患有低氧血症。

如上所述，用根据本发明的抗衰剂治疗的潜在益处包括减轻或制止治疗病症的一种或多种体征或症状的进展。目的可包括增加肺容量或肺活量，及其表现，例如改善氧饱和度。

动脉粥样硬化的治疗

本发明的抗衰化合物可用于治疗动脉粥样硬化：例如，通过抑制受试者中动脉粥样硬化斑块的形成、扩大或进展进行治疗。本发明的抗衰化合物还可用于增强存在于受试者的一个或多个血管中的动脉粥样硬化斑块的稳定性，从而抑制它们破裂和闭塞血管。

动脉粥样硬化的特征在于侵入中型和大型动脉的管腔的零散的内膜斑块、粥样化物；斑块含有脂质、炎症细胞、平滑肌细胞和结缔组织。动脉粥样硬化可影响大中型动脉，包括冠状动脉、颈动脉和脑动脉、主动脉及其分支，以及四肢的主要动脉。

动脉粥样硬化可导致动脉壁增厚。当斑块的生长或破裂减少或阻碍血液流动时，会显现症状；并且症状可能因受影响的动脉而异。动脉粥样硬化斑块可以是稳定的或不稳定的。稳定的斑块消退，保持静止或缓慢生长，有时持续数十年，直到它们可引起狭窄或闭塞。不稳定的斑块容易发生自发性糜烂、裂隙或破裂，从而在它们引起血流动力学显著性狭窄之前很久就会引起急性血栓形成、闭塞和梗塞。临床事件可能由在血管造影中看起来不严重的不稳定的斑块引起；因此，斑块稳定化可以是一种降低发病率和死亡率的途径。斑块破裂或糜烂可导致严重的心血管事件，如急性冠状动脉综合征和中风。破坏的斑块可以具有更高含量的脂质、巨噬细胞，并且具有比完整斑块更薄的纤维帽。

认为动脉粥样硬化在很大程度上归因于动脉壁中白细胞的慢性炎症反应。这是由低密度脂蛋白(ldl)—在没有通过功能性高密度脂蛋白(hdl)从巨噬细胞中充分去除脂肪和胆固醇的情况下携带胆固醇和甘油三酯的血浆蛋白质—促进的。动脉粥样硬化最早的可见病变是脂肪条纹，其是在动脉内膜层中载有脂质的泡沫细胞的累积。动脉粥样硬化的标志是动脉粥样硬化。

动脉粥样硬化和其他心血管疾病的诊断可以基于诸如心绞痛、胸部压力、手臂或腿部麻木或虚弱、说话困难或言语不清、面部肌肉下垂、腿部疼痛、高血压、肾衰竭和/或勃起功能障碍之类的症状、病史和/或患者的体检。可以通过血管造影、超声波检查或其他成像测试来确认诊断。处于患有心血管疾病的风险的受试者包括具有任何一种或多种诱发因素的人，例如具有心血管疾病的家族史和其他风险因素的那些人，例如，诱发因素包括高血压、血脂异常、高胆固醇、糖尿病、肥胖和吸烟、久坐的生活方式和高血压。例如，可以通过血管造影术、心电图或压力测试来评估该病症。

用根据本发明的抗衰剂治疗的潜在益处包括减轻或制止该病症的一种或多种体征或症状(例如斑块的频率、斑块所覆盖的血管的表面积、心绞痛和降低的运动耐力)的进展。

定义

通常认为“衰老细胞”源自通常进行复制，但是由于衰老或导致细胞状态改变的其他事件而不能再复制的细胞类型。为了实施本发明各方面的目的，衰老细胞可以被确认为表达p16，或选自p16、衰老相关联的β-半乳糖苷酶和脂褐素的至少一种标志物；有时，这些标志物中的两种或更多种，以及衰老相关联的分泌谱(sasp)的其他标志物，例如但不限于白细胞介素6，以及炎性、血管生成和细胞外基质修饰蛋白质。除非另有说明，否则权利要求书中提到的衰老细胞不包括癌细胞。

“衰老相关联的”、“衰老相关的”或“年龄相关的”疾病、紊乱或病症是显现出对受试者不利的一种或多种症状或体征的生理病症。如果病症“至少部分地由衰老细胞引起或介导”，则该病症是“衰老相关联的”。这意味着受影响的组织中或周围的sasp的至少一个组分在该病症的病理生理学中起作用，使得受影响的组织中的至少一些衰老细胞的消除导致对患者不利的不良症状或体征的显著缓解或减轻。可以使用本发明的方法和产品潜在地治疗或控制的衰老相关联病症包括在本公开中和在本讨论中提及的现有公开中提及的病症。除非另有明确说明，否则该术语不包括癌症。

蛋白质功能或蛋白酶体功能的抑制剂是一种化合物，其在很大程度上防止已经在靶细胞中表达的蛋白酶体发挥蛋白质或蛋白酶体通常在靶细胞中发挥的酶促、结合或调节功能。这导致靶细胞的消除或使该细胞更容易受到另一种化合物或治疗事件的毒性的影响。

如果一种化合物、成分或试剂消除与相同组织类型的复制细胞或缺乏sasp标志物的静止细胞相比的衰老细胞，则通常称其“抗衰”。替代地或附加地，如果一种化合物或组合物减少了在病症的初始显现或持续病理学中起作用、作为衰老相关联的分泌表型的一部分的病理可溶性因子或介质的释放，或抑制其分解，则该化合物或组合物可有效地根据本发明使用。在这方面，术语“抗衰”是指功能性抑制，使得主要通过抑制而不是消除衰老细胞起作用的化合物(衰老细胞抑制剂)可以以类似的方式使用，其具有随之而来的益处。

从混合细胞群或组织中选择性去除或“消除”衰老细胞不需要去除所有承载衰老表型的细胞：仅在治疗后保留的组织中的最初衰老细胞的比例基本上高于治疗后保留的组织中的最初非衰老细胞的比例时有此需要。

根据本发明的病症的成功“治疗”可以具有对所治疗的受试者有益的任何效果。这包括减小病症的严重程度、持续时间或进展，或由此产生的任何不良体征或症状。在某些情况下，抗衰剂也可用于预防或抑制受试者易感(例如，由于病史导致的遗传易感性而易感)的病症的显现。

“治疗有效量”是本公开化合物的量，其(i)治疗特定疾病、病症或紊乱，(ii)减弱、改善或消除特定疾病、病症或紊乱的一种或多种症状，(iii)预防或延迟本文所述的特定疾病、病症或紊乱的一种或多种症状的发作，(iv)预防或延迟特定疾病、病症或紊乱的进展，(v)至少部分地逆转治疗前病症引起的损害；或者以任何组合具有多种这类效果。

“磷酸化”形式的化合物是带有通过氧原子与核心结构共价结合的一个或多个磷酸基团的化合物，该氧原子在磷酸化之前通常但不一定存在于分子上。例如，一个或多个-oh或-cooh基团中的氢位可以用磷酸基团取代，所述磷酸基团是–opo3h2或-cnpo3h2(其中n是1至4)。在一些磷酸化形式中，磷酸基团可以在体内除去(例如，通过酶解除去)，在这种情况下，磷酸化形式可以是非磷酸化形式的前药。非磷酸化形式没有这类磷酸基团。去磷酸化形式是去除至少一个磷酸基团之后的磷酸化分子。

根据本发明的“小分子”抗衰剂具有小于20,000道尔顿，通常小于10,000、5,000或2,000道尔顿的分子量。小分子抑制剂不是抗体分子或寡核苷酸，并且通常具有不超过五个氢键供体(氮-氢和氧-氢键的总数)，以及不超过10个作为氮或氧原子的氢键受体。

除非另有说明或要求，否则本发明中提及的每种化合物结构包括具有相同结构的共轭酸和碱、这些化合物的结晶和无定形形式、药学上可接受的盐，以及前药。这包括，例如互变异构体、多晶型物、溶剂化物、水合物、未溶剂化的多晶型物(包括无水物)。除非明确提及特定的立体异构体或特定的手性结构，否则该化合物可以是所示结构的任何立体异构体，或其混合物。

如果化合物具有可以在体内转化(酶促或通过其他方式)成为构成活性剂的相关结构的结构，则该化合物在本公开中称为“前药”。“前部分”是当用于掩蔽官能团时将活性剂转化为前药的一种保护基团。例如，在prodrugdesign:perspectives,approachesandapplicationsinmedicinalchemistry,1sted.,v.redasaniands.bari,academicpress,2015；以及prodrugsandtargeteddelivery,methodsandprinciplesinmedicinalchemistryvol.47,1sted.,wiley-vch,2011中描述了将活性药物调节为前药。对于本公开中提出的化合物，例如，酰基或取代的酰基前体在与活性剂的羟基或硫醇基团连接时将形成可除去的酯或硫酯。

除非另有说明或暗示，否则当用于修饰特定基团或自由基时，术语“取代的”是指特定基团或自由基的一个或多个氢原子各自独立地被相同或不同的非氢取代基取代。除非另有说明，否则取代基的命名通过先写官能团的末端部分，后接朝向连接点的相邻官能团而得到。例如，取代基“芳基烷氧基羰基”是指基团(芳基)-(烷基)-o-c(o)。

“接头”是共价连接两个或更多个化学结构并且在两个结构之间具有主链的部分。接头可以是可切割的或不可切割的。接头通常具有长度介于1和5、1和20或1和100个原子的呈直链或支链形式的主链。主链原子之间的键可以是饱和的或不饱和的。接头主链可包括环状基团，例如，任选取代的芳基、杂芳基、杂环或环烷基。

除非另有说明或要求，否则本说明书中使用的其他术语具有其普通含义。

通过引用并入

出于美国和其他有效的管辖区的所有目的，本公开中引用的每一个出版物和专利文献在此通过引用整体并入本文以用于所有目的，如同具体地和单独地指出每个这类出版物或文献均通过引用并入本文。

us2016/0339019a1(laberge等人)和us20170266211a1(david等人)在此通过引用整体并入本文以用于所有目的，包括但不限于用于消除或降低衰老细胞活性和治疗特定衰老相关病症的化合物的确认、配制和用途，包括但不限于本公开中提及的那些。美国专利申请us2018/0000816a1和pct/us2018/046553在此通过引用并入本文以用于所有目的，包括但不限于用于消除或降低衰老细胞活性和治疗各种眼科疾病的化合物的确认、配制和用途。美国专利申请us2018/0000816a1和pct/us2018/046567在此通过引用并入本文以用于所有目的，包括但不限于用于消除或降低衰老细胞活性和治疗各种肺部病症的化合物的确认、配制和用途。美国专利申请16/181,163在此引入用于所有目的，包括但不限于用于消除或降低衰老细胞活性和治疗动脉粥样硬化的化合物的确认、配制和用途。

实施例

实施例1：测量蛋白酶体活性

该实施例提供了测定，通过该测定，读者可以确定测试化合物是否具有对靶途径足够的抑制能力，以开发为抗衰剂。来自这些测定的信息可以与来自细胞裂解测定(实施例2和3)的信息组合以选择用于进一步开发的化合物。

通过监测在底物肽的切割后荧光产物的释放，测定测试化合物对蛋白酶体β5亚基的胰凝乳蛋白酶样活性的抑制。活性蛋白酶切割底物肽的c-末端氨基酸和氨基甲基香豆素之间的酰胺键，从而允许酶活性通过荧光测定法定量。

以384孔格式测试化合物。将化合物的dmso1：3稀释系列稀释到反应缓冲液(20mmhepesph7.5，0.01％bsa，0.02％sds，0.5mmedta，100mmnacl)中，使得当加入到反应混合物中时，dmso的最终浓度不超过1％。为对反应进行初始化设置(initialize)，加入测试化合物和底物，使每孔的最终反应体积为50μl，其含有以下物质：20mmhepesph7.5、0.01％bsa、0.02％sds、0.5mmedta、100mmnacl、0.5nm组成型20s蛋白酶体，以及50μm底物(琥珀酰基-leu-leu-val-tyr-amc)。

将反应物混合并在5分钟后使用360nm的激发波长和450nm的发射记录初始读数。第二次终点测量在1h时进行。相对于dmso对照，由荧光变化(最终减去初始)计算相对酶活性。

实施例2：测量成纤维细胞中的抗衰活性

在开始体内实验之前，通常有益的是，筛选潜在的抗衰剂的去除衰老细胞的效力，以及与相同组织中的非衰老细胞相比，它们对衰老细胞的选择性。

人成纤维细胞imr90细胞可以从美国典型培养物保藏中心(atcc)获得，指名为ccl-186。在含有fbs和pen/strep的dmem中，在3％o2、10％co2和～95％湿度的气氛中将细胞维持在<75％融汇率(confluency)。将细胞分成三组：经照射的细胞(在照射后使用前培养14天)、增殖的正常细胞(在使用前低密度培养一天)和静止细胞(在使用前高密度培养4天)。

在第0天，如下制备经照射的细胞。洗涤imr90细胞，以50,000个细胞/ml的密度置于t175烧瓶中，并以10-15gy照射。照射后，将该细胞以100μl铺板在96孔板中。在第1、3、6、10和13天，吸出每个孔中的培养基并替换为新鲜培养基。

在第10天，如下制备静止健康细胞。洗涤imr90细胞，与3ml含tryple胰蛋白酶的试剂(thermofisherscientific，waltham，massachusetts)组合并培养5min直至该细胞向上聚拢并开始从板上脱离。将细胞分散，计数并在培养基中以50,000个细胞/ml的浓度制备。将100μl细胞铺板在96孔板的每个孔中。在第13天更换培养基。

在第13天，如下制备增殖的健康细胞群。洗涤健康的imr90细胞，与3ml的tryple组合并培养5分钟直至该细胞向上聚拢并开始从板上脱离。将细胞分散，计数并在培养基中以25,000个细胞/ml的浓度制备。将100μl细胞铺板在96孔板的每个孔中。

在第14天，如下将测试抑制剂与细胞组合。在96孔pcr板中以最终所需浓度的200倍制备每种测试化合物的dmso稀释系列。在即将使用之前，将dmso原液以1：200稀释到预热的完全培养基中。从每个孔中的细胞中吸出培养基，并加入100μl/孔的含有化合物的培养基。

将用于测试的候选抗衰剂与细胞一起培养6天，在第17天用新鲜培养基和相同化合物浓度替换培养基。将测试抑制剂与细胞一起培养3天。测定系统使用热稳定荧光素酶的特性来实现产生稳定的发光信号，同时抑制细胞裂解过程中释放的内源性atp酶的反应条件。在培养期结束时，向每个孔中加入100μl的试剂(promegacorp.，madison，wisconsin)。将细胞板在轨道振荡器上放置30秒，并测量发光量(luminescence)。

图2a提供了选自图1a和1c的结构的抗衰活性和蛋白酶体结合的数据。图2b提供了选自图1b的结构的抗衰活性和蛋白酶体结合的数据。

实施例3：测量huvec细胞中的抗衰活性

将来自单批次的人脐静脉(huvec)细胞在补充有来自atcc的endothelialcellgrowthkit^tm-vegf的血管细胞基础培养基中扩增至大约8次群体倍增，然后冷冻保存。在测定开始前9天，将衰老群体的细胞解冻并以大约27,000/cm²接种。在含有5％co2和3％o2的潮湿培养箱中培养所有细胞，并且每48h更换培养基。接种后两天，通过从x射线源发射12gy辐射照射该细胞。在测定开始前三天，将非衰老群体的细胞解冻并接种为衰老群体。在测定前一天，将所有细胞用胰蛋白酶消化并接种到384孔板，在单独的板中5,000个衰老细胞/孔和10,000个非衰老细胞/孔，最终体积为55μl/孔。在每个板中，中心308个孔含有细胞而孔的外周填满70μl/孔去离子水。

在测定的当天，将化合物从10mm原液稀释到培养基中以提供最高浓度的工作原液，然后将其等分试样在培养基中进一步稀释以提供其余两种工作原液。为了开始测定，将5μl工作原液添加到细胞板中。最终测试浓度为20、2和0.2μm。在每个板中，以单一浓度一式三份测定100种测试化合物，以及三孔阳性对照和5个无处理(dmso)对照。加入化合物后，将板放回培养箱中三天。

通过使用celltiter-glo^tm试剂(promega)测量总atp浓度来间接地评估细胞存活。用enspire^tm读板仪(perkinelmer)定量所得的发光量。将每种浓度的化合物的相对细胞活力计算为相对于相同板的未处理对照的百分比。

对于潜在先导化合物的后续剂量反应，如上所述制备衰老和非衰老细胞的384孔板。将化合物制备为在dmso中的10点1：3稀释系列，然后在培养基中稀释至12x。然后将5微升该工作原液加入到细胞板中。孵育三天后，如上所述计算相对于dmso对照的细胞存活率。所有测量均一式四份进行。

实施例4：在骨关节炎模型中的抗衰剂的功效

该实施例对在用于治疗骨关节炎的小鼠模型中测试mdm2抑制剂做了说明。它可以经适当修改后适于测试和开发用于临床疗法的抗衰剂。

该模型如下实施。对c57bl/6j小鼠进行手术以切断一个后肢的前十字韧带(acl)，以在该肢体的关节中诱发骨关节炎。在手术后第3周和第4周，通过对每个手术膝盖用5.8μg的nutlin-3a(n＝7)隔日一次(q.o.d)关节内注射达2周来治疗小鼠。在手术后4周结束时，监测小鼠的关节是否存在衰老细胞，评估功能，监测炎症标志物，并进行组织学评估。

在所进行的研究中包括两个对照组的小鼠：一组包括经历假手术(n＝3)(即随后经历除了切割acl之外的外科手术)和并行于gcv(更昔洛韦)治疗组的溶媒的关节内注射的c57bl/6j或3mr小鼠；而一组包括经过acl手术并接受并行于gcv治疗组的溶媒的关节内注射(n＝5)的c57bl/6j或3mr小鼠。对来自nutlin-3a处理的小鼠的小鼠的手术关节的rna进行sasp因子(mmp3，il6)和衰老标志物(p16)的表达的分析。进行qrt-pcr以检测mrna水平。

图3a、3b和3c分别显示组织中p16、il6和mmp13的表达。oa诱导手术与这些标志物的表达增加有关联。用nutlin-3a治疗使该表达降低回至对照水平以下。用nutlin-3a治疗清除了关节中的衰老细胞。

在手术后4周通过负重测试评估肢体的功能，以确定小鼠偏爱哪条腿。在进行测量之前，允许小鼠在至少三种情况下适应室。在室内操纵小鼠在每个标尺上用一只后爪站立。在三秒钟内测量放置在每个后肢上的重量。在每个时间点对每只动物进行至少三次单独的测量。结果表示为手术肢体与对侧未手术肢体所承受的重量的百分比。

图4a显示功能研究的结果。经历过骨关节炎诱导手术的未经治疗的小鼠相比手术后肢偏爱未做手术的后肢(δ)。然而，用nutlin-3a清除衰老细胞会在经历过手术的小鼠中消除这种效应(▽)。

图4b、4c和4d显示来自这些实验的关节组织的组织病理学。acl手术诱发的骨关节炎导致蛋白多糖层被破坏。使用nutlin-3a清除衰老细胞则完全消除了这种效应。

实施例5：抗衰剂在糖尿病性视网膜病变模型中的功效

该实施例对在用于治疗眼后病，特别是糖尿病性视网膜病的小鼠模型中测试bcl抑制剂做了说明。它可以经适当修改后适于测试用于临床疗法的抗衰剂。

在小鼠氧诱导的视网膜病变(oir)模型中研究了模型化合物ubx1967(bcl-xl抑制剂)的功效(scott和fruttiger,eye(2010)24,416–421,oubaha等人,2016)。从出生后第7天(p7)到p12，将c57bl/6小鼠幼崽及其cd1养育母亲暴露于高氧环境(75％o2)。在p12，将动物玻璃体内注射配制在1％dmso、10％吐温-80、20％peg-400中的1μl测试化合物(200、20或2ump)，并使其返回室内空气直至p17。在p17摘出眼睛并解剖视网膜用于血管染色或qrt-pcr。为了确定无血管或新生血管区域，将视网膜平放，并用在1mmcacl2中1：100稀释的异凝集素b4(ib4)染色。为了定量测量衰老标志物(例如，cdkn2a、cdkn1a、il6、vegfa)，进行qpcr。分离rna并通过逆转录产生cdna，其用于所选转录物的qrt-pcr。

图5a和5b显示玻璃体内itt)施用ubx1967在所有剂量水平下均导致新血管形成和血管闭塞程度的统计学显著改善。

还在链脲佐菌素(stz)模型中研究了ubx1967的功效。将6至7周的c57bl/6j小鼠称重并测量它们的基线血糖(accu-chek^tm,roche)。小鼠以55mg/kg腹膜内注射stz(sigma-alderich,st.louis,mo)连续5天。年龄匹配的对照仅注射缓冲液。在最后一次stz注射后一周再次测量血糖，如果小鼠的非禁食血糖高于17mm(300mg/l)，则认为它们有糖尿病。stz治疗的糖尿病c57bl/6j小鼠在stz施用后8周和9周玻璃体内注射1μl的ubx1967(2μm或20μm，配制成含于0.015％聚山梨醇酯-80^tm、0.2％磷酸钠、0.75％氯化钠的悬浮液，ph值为7.2)。在stz治疗后10周进行视网膜伊文思蓝渗透测定。

图5c和5d显示了该方案的初步结果。玻璃体内(ivt)施用ubx1967之后视网膜和脉络膜血管渗漏在两种剂量水平下在血管通透性方面均得到改善。

实施例6：抗衰剂在肺病模型中的功效

该实施例对用于治疗肺病的小鼠模型中抑制剂的测试做了说明，具体地，所述小鼠模型是特发性肺纤维化(ipf)的模型。它可以经适当修改后适于测试和开发用于临床疗法的抗衰剂。

作为慢性阻塞性肺病(copd)的模型，将小鼠暴露于香烟烟雾中。通过衰老细胞清除、肺功能和组织病理学评估抗衰剂对暴露于烟雾的小鼠的作用。

本研究中使用的小鼠包括3mr菌株，描述于us2017/0027139a1和demaria等人,devcell.2014december22；31(6):722–733中。3mr小鼠具有编码胸苷激酶的转基因，胸苷激酶将前药更昔洛韦(gcv)转化为对细胞致死的化合物。将该转基因中的酶置于p16启动子的控制下，这使其在衰老细胞中进行特异性表达。用gcv治疗小鼠消除了衰老细胞。

在该研究中使用的其他小鼠包括ink-attac菌株，描述于us2015/0296755a1和baker等人,nature2011nov2；479(7372):232-236中。ink-attac小鼠具有在p16启动子控制下编码可转换半胱天冬酶8的转基因。通过用转换化合物ap20187治疗小鼠可以激活半胱天冬酶8，于是半胱天冬酶8直接诱导衰老细胞中的细胞凋亡，从而从小鼠中消除衰老细胞。

为了进行实验，将6周龄的3mr(n＝35)或ink-attac(n＝35)小鼠长期暴露于由teaguete-10系统产生的香烟烟雾中，该系统是自动控制的吸烟机，其在室中产生侧流和主流香烟烟雾的组合物，该组合物被输送到收集和混合室，在这里，不同量的空气与烟雾混合物混合。copd方案由约翰霍普金斯大学(johnshopkinsuniversity)的copd核心设施(rangasamy等人,2004,j.clin.invest.114:1248-1259；yao等人,2012,j.clin.invest.122:2032-2045)调整得到。

小鼠每天接受总共6小时的香烟烟雾暴露，每周5天达6个月。每支点燃的香烟(3r4f研究香烟含有10.9mg总颗粒物质(tpm)、9.4mg焦油和0.726mg尼古丁，以及每支香烟11.9mg一氧化碳[universityofkentucky,lexington,ky])抽吸2秒钟，每分钟一次，总共抽吸8次，其中流速为1.05l/min，以提供35cm³的标准抽吸量。调整吸烟机以通过一次闷烧2支香烟产生侧流烟雾(89％)和主流烟雾(11％)的混合物。监测烟室气氛中的总悬浮颗粒(80-120mg/m³)和一氧化碳(350ppm)。

从第7天开始，(10)ink-attac和(10)3mr小鼠分别用ap20187(每周tx)或更昔洛韦治疗(连续治疗5天，然后停药16天，重复直至实验结束)。相同数量的小鼠接受相应的溶媒。将剩余的30只小鼠(15只ink-attac和15只3mr)均匀地分成三个不同的治疗组，其中每种基因修饰的菌株有5只。一组(n＝10)接受nutlin-3a(溶于pbs中的10％dmso/3％吐温-20^tm的25mg/kg，连续治疗14天，然后停药14天，重复直至实验结束)。一组(n＝10)接受abt-263(navitoclax)(溶于15％dmso/5％吐温-20的100mg/kg，连续治疗7天，然后停药14天，重复直至实验结束)，而最后一组(n＝10)根据与abt-263相同的治疗方案仅接受用于abt-263(15％dmso/5％吐温-20)的溶媒。没有接受香烟烟雾暴露的另外70只动物被用作实验的对照。

在两个月的香烟烟雾(cs)暴露后，通过使用mousestatphysiosuite^tm脉搏血氧仪(kentscientific)监测氧饱和度来评估肺功能。用异氟烷(1.5％)麻醉动物并施加脚趾夹。监测小鼠30秒并计算该持续时间内的平均外周毛细血管氧饱和度(spo2)测量值。

图6显示了结果。与未治疗的对照相比，通过ap20187、更昔洛韦、abt-263(navitoclax)(201)或nutlin-3a(101)清除衰老细胞导致在香烟烟雾暴露两个月后的小鼠中spo2水平的统计学显著增加。

实施例7：全身给药时抗衰剂在动脉粥样硬化中的功效

该实施例对在用于治疗动脉粥样硬化的小鼠模型中测试mdm2抑制剂做了说明。测试化合物全身给药而不是局部给药。该模型在缺乏低密度脂蛋白的受体的小鼠的ldlr-/-菌株中完成。这里描述的实验可以经适当修改后适于测试和开发用于临床疗法的其他类型的抑制剂。

从第0周开始并在整个研究期间，给两组ldlr-/-小鼠(10周)喂食具有42％卡路里的脂肪的高脂肪饮食(hfd)(harlantekladtd.88137)。两组ldlr-/-小鼠(10周)喂食正常食物(-hfd)。从第0-2周开始，用nutlin-3a(25mg/kg，腹膜内)治疗一组hfd小鼠和-hfd小鼠。一个治疗周期是14天治疗，14天停药。将溶媒给药到一组hfd小鼠和一组-hfd小鼠。在第4周(时间点1)，处死一组小鼠并评估斑块中衰老细胞的存在。对于一些其余的小鼠，从第4-6周开始重复nutlin-3a和溶媒给药。在第8周(时间点2)，处死小鼠并评估斑块中衰老细胞的存在。从第8-10周用nutlin-3a或溶媒治疗其余的小鼠。在第12周(时间点3)，处死小鼠并评估斑块的水平和斑块中衰老细胞的数量。

在喂食hfd并在时间点1用nutlin-3a或溶媒治疗的ldlr-/-小鼠中测量与喂食-hfd的小鼠(每组n＝3)相比的血浆脂质水平。中午收集血浆并分析循环脂质和脂蛋白。

在时间点1结束时，处死喂食hfd并用nutlin-3a或溶媒治疗的ldlr-/-小鼠(n＝3，所有组)，并且解剖主动脉弓用于sasp因子和衰老细胞标志物的rt-pcr分析。将值归一化为gapdh，并表示为相对于正常饮食的年龄匹配的溶媒治疗的ldlr-/-小鼠的倍数变化。数据显示，用nutlin-3a对喂食hfd的ldlr-/-小鼠中的衰老细胞的清除在一个治疗周期后降低了几种sasp因子和衰老细胞标志物mmp3、mmp13、pai1、p21、igfbp2、il-1a和il-1b的表达。

在时间点2结束时，处死喂食hfd并用nutlin-3a或溶媒治疗的ldlr-/-小鼠(对于所有组n＝3)，并且解剖主动脉弓以进行sasp因子和衰老细胞标志物的rt-pcr分析。将值归一化为gapdh，并表示为相对于正常饮食的年龄匹配的溶媒治疗的ldlr-/-小鼠的倍数变化。数据显示在hfd小鼠的主动脉弓中有一些sasp因子和衰老细胞标志物的表达。在多个治疗周期中用nutlin-3a对喂食hfd的ldlr-/-小鼠中的衰老细胞的清除减少了大多数标志物的表达。

在时间点3结束时，处死喂食hfd并用nutlin-3a或溶媒治疗的ldlr-/-小鼠(对于所有组n＝3)，并且解剖主动脉并用苏丹iv染色以检测脂质的存在。通过mri分析小鼠的身体成分，并且通过hemavet^tm对循环血细胞计数。

图7显示了结果。用nutlin-3a治疗使降主动脉中由斑块覆盖的表面积减少了约45％。血小板和淋巴细胞计数在nutlin-3a和溶媒治疗的小鼠之间是等同的。用nutlin-3a治疗也减少了用高脂肪饮食喂养的小鼠的体重和体脂成分。

实施例8：在体外和体内测量癌细胞的细胞毒性

根据本发明的新蛋白酶体抑制剂可以开发以不仅用于治疗由衰老细胞介导的病症，还用于治疗由癌细胞介导的病症。

可以使用其他建立的细胞系在测定中测试化合物特异性杀死癌细胞的能力。这些细胞系包括hela细胞、ovcar-3、lncap和可从milliporesigma,burlingtonma,u.s.a获得的任何认证的癌细胞系。如果化合物对细胞致死的浓度比相同组织类型的非癌细胞低至少5倍，优选低25倍或低100倍，则该化合物特异性地杀死癌细胞。对照细胞具有与测试癌细胞系类似的形态特征和细胞表面标志物，但没有癌症迹象。

在体内，在从敏感的sclc(h889)和血液学(rs4；11)细胞系或使用其他形成肿瘤的癌细胞系(根据用户特别感兴趣的癌症的类型)建立的侧翼异种移植模型中评估化合物。当口服或静脉内给药时，化合物诱导快速和完全的肿瘤反应(cr)，其在所有携带h889sclc)或rs4；11(all)肿瘤的动物中在治疗结束后持续数周。对携带h146sclc肿瘤的小鼠的类似治疗可以在动物中诱导快速消退。

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本公开中提出的若干假设提供了读者可以借其理解本发明的前提。这个前提是为丰富读者的智力而提供的。本发明的实践不需要详细理解或援引该假设。除非另有说明，否则本公开中提出的假设的特征不限制要求保护的发明的应用或实践。

例如，除明确要求消除衰老细胞的情况外，本发明化合物无论其对衰老细胞的影响如何，都可用于治疗所述病症。尽管本公开中提到的许多与衰老相关的病症主要发生在老年患者中，但是它们介导的衰老细胞的发生和病理生理学也可以由其他事件(例如辐射)、其他类型的组织损伤、其他类型的疾病、遗传异常和概念(invention)引起。除非另有明确说明或要求，否则本发明可以对具有所示病症的任何年龄的患者实施。

还提供了关于本发明的基于肽的化合物的作用机制的讨论，以便丰富读者的智力。除非另有说明，否则本发明化合物可用于除去衰老细胞或癌细胞或用于治疗如下所述的疾病病症，无论它们是否实际上显示出抑制治疗对象的靶组织中的蛋白酶体。

尽管在消除衰老细胞和治疗衰老相关联病症的上下文中说明了本公开中提及的化合物和组合物，但是可以出于任何目的根据本发明制备新的化合物及其衍生物，包括但不仅限于实验室使用、衰老相关病症的治疗、有关的中毒(poisoningofin-laws)，以及癌症等其他疾病的治疗。

尽管已经参考具体实施例和说明描述了本发明，但是作为常规开发和优化的问题，在本领域普通技术人员的范围内，可以进行改变并且可以替换等同物以适应特定上下文或预期用途，由此在不脱离所要求保护的范围及其等同物的情况下实现本发明的益处。