长效肾上腺髓质素衍生物的制作方法

本发明涉及一种长效肾上腺髓质素衍生物。
背景技术：
：肾上腺髓质素(adrenomedullin，下文中也记载为“am”)是在1993年从嗜铬细胞瘤组织分离和鉴定的生物活性肽(非专利文献1)。发现之初，已证实am能够发挥很强的扩张血管的降压作用。例如，专利文献1记载了具有降血压作用的包含人am氨基酸序列的肽。通过随后的研究表明，am能够发挥心血管保护作用、抗炎症作用、血管生成作用及促进组织修复作用等多种药理作用。此外，为了将am的药理作用应用在疾病治疗中，对于各种疾病患者进行了am的给药研究。其中，am作为炎症性肠病、肺动脉高压症、周围血管疾病或急性心肌梗塞的治疗药的有用性受到期待。例如，专利文献2记载了一种含有以下物质作为有效成分的非细菌性的炎症性肠病的预防或治疗剂：具有抑制非细菌性炎症的活性的肾上腺髓质素或其衍生物，或者是具有抑制非细菌性炎症的活性的它们的盐。专利文献3记载了一种预防或治疗方法，其是对需要预防或治疗的难以使用类固醇制剂、免疫抑制剂或生物制剂或使用效果不明显的炎症性肠病的患者进行所述炎症性肠病的预防或治疗的方法，所述方法包括对所述患者给予有效量的肾上腺髓质素、具有抑制炎症活性的其修饰物或者具有抑制炎症活性的所述肾上腺髓质素或所述修饰物的盐。另外，从对am的构效关系研究，推进了对有助于am生物活性的必需序列的确定(非专利文献2～9)。已知通常肽由于在体内(例如血液中)的代谢反应而导致体内的半衰期较短。因此，当把肽用作药物的有效成分时，通过将其他基团与该肽连接而成的肽衍生物的形式，有时能够延长体内的半衰期，改善药物动力学。例如，专利文献4记载了一种在生物学上具有活性的垂体中间叶激素(intermedin)肽或肾上腺髓质素肽，其特征在于，具有超过1.5小时的血清半衰期。该文献记载了通过酰胺键连接烷基和肽部分。专利文献5记载了一种通过am的tyr1的酚羟基与聚乙二醇(以下也记作“peg”)基连接而成的am衍生物。专利文献6记载了一种使peg-醛与肽的游离氨基反应，肽的游离氨基与peg基连接而成的肽衍生物的制造方法。该文献记载了am作为所述肽。非专利文献10记载了一种通过酰胺键连接amn末端的α氨基与peg基而成的am衍生物。该文献记载了连接peg基而成的am衍生物的血液中的半衰期得到延长。专利文献7记载了一种融合蛋白，其包含位于融合蛋白的氨基末端且含有第一生物活性肽或蛋白的序列的第一片段，以及位于融合蛋白的羧基末端且含有第二生理活性蛋白或肽的序列的第二片段，上述第一片段和第二片段共价结合以发挥功能，从而形成该融合蛋白。该文献记载了还可以包含与上述第一片段和第二片段结合的免疫球蛋白或其功能等价物的fc片段那样的接头片段。该文献未提及肾上腺髓质素。专利文献8记载了一种工程多肽，其包含白蛋白结合结构域多肽(abd)和选自瘦蛋白、瘦蛋白类似物或其活性片段的第一肽激素结构域(hd1)。该文献记载了fc蛋白作为hd1所含有的水溶性聚合物部分。该文献记载了工程多肽具有良好的作用持续时间。该文献例举了肾上腺髓质素那样的胰淀素或其类似物，作为能够与工程多肽一同给药的药物。专利文献9记载了一种可以改善折叠和减少凝集的fc-干扰素-β融合蛋白，其包含(i)免疫球蛋白fc区域和(ii)通过肽键或肽接头序列而与免疫球蛋白fc区域的羧基末端连接的干扰素-β融合蛋白。该文献记载了通过上述融合蛋白可以改善干扰素-β的血液中半衰期。该文献未提及肾上腺髓质素。现有技术文献专利文献专利文献1：日本专利第2774769号公报专利文献2：日本专利第4830093号公报专利文献3：wo2012/096411号专利文献4：wo2012/138867号专利文献5：wo2013/064508号专利文献6：美国专利申请公开第2009/0252703号说明书专利文献7：日本特表2009-510999号公报专利文献8：日本特表2014-528917号公报专利文献9：日本专利第4808709号公报非专利文献非专利文献1：kitamurak，kangawak，kawamotom，ichikiy，nakamuras，matsuoh，etot.adrenomedullin:anovelhypotensivepeptideisolatedfromhumanpheochromocytoma.biochembiophysrescommun，1993年4月30日，第192(2)卷，pp.553-560非专利文献2：belloni，a.s.等人，structure-activityrelationshipsofadrenomedullinintheadrenalgland.endocrres，1998年，第24(3-4)卷，p.729-30.非专利文献3：champion，h.c.等人，catecholaminereleasemediatespressoreffectsofadrenomedullin-(15-22)intherat.hypertension，1996年，第28(6)卷，p.1041-6.非专利文献4：champion，h.c.，g.g.nussdorfer，和p.j.kadowitz，structure-activityrelationshipsofadrenomedullininthecirculationandadrenalgland.regulpept，1999年，第85(1)卷，p.1-8.非专利文献5：eguchi，s.等人，structure-activityrelationshipofadrenomedullin，anovelvasodilatorypeptide，inculturedratvascularsmoothmusclecells.endocrinology，1994年，第135(6)卷，p.2454-8.非专利文献6：garcia，m.a.等人，synthesis，biologicalevaluation，andthree-dimensionalquantitativestructure-activityrelationshipstudyofsmall-moleculepositivemodulatorsofadrenomedullin.jmedchem，2005年，第48(12)卷，p.4068-75.非专利文献7：mitsuda，y.等人，large-scaleproductionoffunctionalhumanadrenomedullin:expression，cleavage，amidation，andpurification.proteinexprpurif，2002年，第25(3)卷，p.448-55.非专利文献8：roldos，v.等人，small-moleculenegativemodulatorsofadrenomedullin:design，synthesis，and3d-qsarstudy.chemmedchem，2008年，第3(9)卷，p.1345-55.非专利文献9：watanabe，t.x.等人，vasopressoractivitiesofn-terminalfragmentsofadrenomedullininanesthetizedrat.biochembiophysrescommun，1996年，第219(1)卷，p.59-63.非专利文献10：kubo,k等人，biologicalpropertiesofadrenomedullinconjugatedwithpolyethyleneglycol.peptides，2014年，第57卷，p.118-21非专利文献11：kato,j.,kitamura,k..bench-to-bedsidepharmacologyofadrenomedullin.europeanjournalofpharmacology，2015年，第764卷，p.140-148.技术实现要素：发明所要解决的问题如上所述，为了从提高体内持续性的观点出发来改善am的药物动力学，已知有将am与peg基这样的其他基团连接而成的am衍生物。但是，已知的am衍生物存在有改进的余地。例如，当连接如am这种较小的肽和peg基这种较大的基团时，所得的am衍生物的各种性质取决于peg基的分子量可能会变化很大。此外，当如专利文献5所述的am衍生物那样，am的氨基酸残基的侧链与其他基团连接时，am部分的构象会发生变化，与识别am的am受体的亲和性可能会下降。这种情况下，所得的am衍生物作为am的药理作用可能会降低。除了心血管保护作用、抗炎症作用、血管生成作用和促进组织修复作用等药理作用外，am还具有很强的扩张血管作用。因此，当向对象给药am或am衍生物时，由于很强的扩张血管作用，可能引起如血压下降过度这样的不良副作用。尤其是在希望表现出除了扩张血管作用之外的药理作用而使用am或am衍生物的情况下，这种副作用的产生会成为问题。为了避免产生上述问题，现有技术的含有肾上腺髓质素或其衍生物作为有效成分的药物需要以实质上不产生不良副作用的给药量，通过持续静脉输注向给药对象进行给药。这种给药方法有可能向给药对象强加负担。这就要求维持肾上腺髓质素的药理作用且提高体内的持续性的肾上腺髓质素衍生物即使在向给药对象进行单次给药的情况下，也能够发挥肾上腺髓质素的药理效果，而不会实质产生不良副作用。因此，本发明的目的在于提供一种能够维持肾上腺髓质素的药理作用并实质性抑制不良副作用的长时间持续作用的新型肾上腺髓质素衍生物。解决问题的技术方案本发明人研究了各种用于解决上述问题的技术方案。本发明人发现，通过具有特定氨基酸序列的肽的连接基团连接肾上腺髓质素的n末端的α氨基与免疫球蛋白的fc区域，由此可以保持与母体化合物肾上腺髓质素同等程度的生物活性。本发明人基于上述见解完成了本发明。即，本发明的要旨如下。(1)一种由下述式(i)表示的化合物或其盐，或者它们的水合物，a-l-b(i)式(i)中，a为免疫球蛋白的fc区域，b为由肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物衍生的肽部分，l为由具有任意氨基酸序列的肽组成的连接基团。(2)根据上述实施方式(1)所述的化合物，其中，l为由具有ggggsggggsggggs(seqidno:22)或ggggsggggsggggk(seqidno:24)的氨基酸序列的肽组成的连接基团，fc区域a通过其c末端的羧基与连接基团l的n末端的α氨基形成肽键，来与其余部分连接，并且，肽部分b通过其n末端的α氨基与连接基团l的c末端的羧基形成肽键，来与其余部分连接。(3)根据上述实施方式(1)或(2)所述的化合物，其中，a为免疫球蛋白g1(igg1)的fc区域，或免疫球蛋白g4(igg4)的fc区域。(4)根据上述实施方式(1)～(3)中任一项所述的化合物，其中，所述肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物为选自于下述组中的肽：(i)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成的肽；(ii)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成且该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(iii)在(ii)的肽中所述二硫键被亚乙基取代且具有肾上腺髓质素活性的肽；(iv)在(i)～(iii)任一个肽中缺失、取代或添加1～15个氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；(v)在(i)～(iv)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及(vi)在(i)～(iv)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。(5)根据上述实施方式(4)所述的化合物，其中，所述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：(i)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成的肽；(ii)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成且该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(v)在(i)或(ii)的肽中c末端被酰胺化的肽；以及(vi)在(i)或(ii)的肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。(6)根据上述实施方式(1)～(4)中任一项所述的化合物，其中，所述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：(a)由seqidno:1的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:1的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(b)由seqidno:4的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:4的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(c)由seqidno:6的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:6的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(d)由seqidno:8的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:8的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e)由seqidno:10的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:10的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(f)由seqidno:12的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:12的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(g)在(a)～(f)任一个肽中所述二硫键被亚乙基取代且具有肾上腺髓质素活性的肽；(h)在(a)～(g)任一个肽中缺失、取代或添加1～15个氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；(i)在(a)～(h)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及(j)在(a)～(h)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。(7)根据上述实施方式(6)所述的化合物，其中，所述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：(a)由seqidno:1的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:1的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(b)由seqidno:4的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:4的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(c)由seqidno:6的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:6的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(d)由seqidno:8的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:8的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e)由seqidno:10的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:10的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(f)由seqidno:12的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:12的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(i)在(a)～(f)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及(j)在(a)～(f)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。(8)根据上述实施方式(1)～(4)中任一项所述的化合物，其中，用式(i)表示的化合物为选自于下述组中的肽：(e-a-1)由seqidno:15的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:15的氨基酸序列组成且第259位的半胱氨酸残基与第264位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-2)由seqidno:17的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:17的氨基酸序列组成且第259位的半胱氨酸残基与第264位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-3)由seqidno:19的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:19的氨基酸序列组成且第256位的半胱氨酸残基与第261位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-4)由seqidno:21的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:21的氨基酸序列组成且第256位的半胱氨酸残基与第261位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-5)由seqidno:31的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:31的氨基酸序列组成且第254位的半胱氨酸残基与第259位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-6)由seqidno:33的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:33的氨基酸序列组成且第254位的半胱氨酸残基与第259位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-7)由seqidno:35的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:35的氨基酸序列组成且第249位的半胱氨酸残基与第254位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-8)由seqidno:37的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:37的氨基酸序列组成且第249位的半胱氨酸残基与第254位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-9)由seqidno:41的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:41的氨基酸序列组成且第251位的半胱氨酸残基与第256位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-10)由seqidno:43的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:43的氨基酸序列组成且第251位的半胱氨酸残基与第256位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-11)由seqidno:45的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:45的氨基酸序列组成且第246位的半胱氨酸残基与第251位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-12)由seqidno:47的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:47的氨基酸序列组成且第246位的半胱氨酸残基与第251位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-g)在(e-a-1)～(e-a-12)任一个肽中所述二硫键被亚乙基取代且具有肾上腺髓质素活性的肽；(e-h)在(e-a-1)～(e-g)任一个肽中缺失、取代或添加1～15个氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；(e-i)在(e-a-1)～(e-h)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及(e-j)在(e-a-1)～(e-h)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。(9)根据上述实施方式(8)所述的化合物，其中，用式(i)表示的化合物为选自于下述组中的肽：(e-a-1)由seqidno:15的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:15的氨基酸序列组成且第259位的半胱氨酸残基与第264位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-2)由seqidno:17的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:17的氨基酸序列组成且第259位的半胱氨酸残基与第264位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-3)由seqidno:19的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:19的氨基酸序列组成且第256位的半胱氨酸残基与第261位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-4)由seqidno:21的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:21的氨基酸序列组成且第256位的半胱氨酸残基与第261位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；以及(e-a-5)由seqidno:31的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:31的氨基酸序列组成且第254位的半胱氨酸残基与第259位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-6)由seqidno:33的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:33的氨基酸序列组成且第254位的半胱氨酸残基与第259位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-7)由seqidno:35的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:35的氨基酸序列组成且第249位的半胱氨酸残基与第254位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-8)由seqidno:37的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:37的氨基酸序列组成且第249位的半胱氨酸残基与第254位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-9)由seqidno:41的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:41的氨基酸序列组成且第251位的半胱氨酸残基与第256位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-10)由seqidno:43的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:43的氨基酸序列组成且第251位的半胱氨酸残基与第256位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-11)由seqidno:45的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:45的氨基酸序列组成且第246位的半胱氨酸残基与第251位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-12)由seqidno:47的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:47的氨基酸序列组成且第246位的半胱氨酸残基与第251位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-i)在(e-a-1)～(e-a-12)任一个肽中c末端被酰胺化的肽。(10)一种分离的核酸，其含有编码上述实施方式(1)～(9)中任一项所述的化合物的碱基序列。(11)根据上述实施方式(1)～(9)中任一项所述的化合物或其盐，或者它们的水合物的制造方法，包括表达步骤，该步骤在能够产生上述实施方式(1)～(9)中任一项所述的化合物的宿主细胞中，大量表达该化合物。(12)一种药物，其含有上述实施方式(1)～(9)中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物作为有效成分。(13)根据上述实施方式(12)所述的药物，所述药物用于预防或治疗循环系统疾病、炎症性疾病、血管疾病或肾疾病。(14)一种循环系统疾病、炎症性疾病、血管疾病或肾疾病的预防或治疗剂，含有上述实施方式(1)～(9)中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物作为有效成分。(15)一种药物组合物，其含有上述实施方式(1)～(9)中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物、1种以上的药学上可接受的载体。(16)根据上述实施方式(15)所述的药物组合物，所述药物组合物用于预防或治疗循环系统疾病、炎症性疾病、血管疾病或肾疾病。(17)一种预防或治疗症状、疾病和/或紊乱的方法，包括：对需要预防或治疗所述症状、疾病和/或紊乱的对象，给予有效量的上述实施方式(1)～(9)中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物。(18)根据上述实施方式(17)所述的方法，其中，所述症状、疾病和/或紊乱为循环系统疾病、炎症性疾病、血管疾病或肾疾病。(19)根据上述实施方式(1)～(9)中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物，用于预防或治疗症状、疾病和/或紊乱。(20)根据上述实施方式(19)所述的化合物，其中，所述症状、疾病和/或紊乱为循环系统疾病、炎症性疾病、血管疾病或肾疾病。(21)根据上述实施方式(1)～(9)中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物用于制造预防或治疗症状、疾病和/或紊乱的药物的用途。(22)根据上述实施方式(21)所述的用途，其中，所述症状、疾病和/或紊乱为循环系统疾病、炎症性疾病、血管疾病或肾疾病。发明效果根据本发明，可以提供一种能够维持肾上腺髓质素的药理作用并实质性抑制不良副作用的长时间持续作用的新型肾上腺髓质素衍生物。本说明书包括作为本申请的优先权基础的日本国专利申请第2017-064369号说明书和/或附图所记载的内容。附图说明图1是表示将实施例1、2、3、4的肾上腺髓质素衍生物用sds-page分离的结果的图。图中，泳道1、6分别表示分子量标准物质，泳道2、3、4、5分别表示从实施例1、2、3、4的肾上腺髓质素衍生物的重组体得到的沉淀组分。图2是表示皮下给予实施例1或5的肾上腺髓质素衍生物时的肾上腺髓质素衍生物的血液中浓度随时间的变化的图。图3是表示尾静脉给予实施例1或5的肾上腺髓质素衍生物时的肾上腺髓质素衍生物在给药2天后的血液中浓度的图。图4是表示对自发性高血压大鼠(shr)皮下给予实施例5的肾上腺髓质素衍生物所带来的血压升高抑制效果的图。图中，纵轴表示给药9天后的收缩期血压减去给药前的收缩期血压而得到的血压差(mmhg)。*表示通过t检验(n＝5)计算出的相对于给予生理盐水的对照组的p值低于0.05。图5是表示对葡聚糖硫酸钠(dss)诱发大肠炎模型小鼠皮下给予实施例5的肾上腺髓质素衍生物所带来的炎症改善效果的图。图中，纵轴表示对照组或实施例5的肾上腺髓质素衍生物给药组在第5天的总得分。*表示通过t检验(n＝10)计算出的相对于给予生理盐水的对照组的p值低于0.05。具体实施方式<1.肾上腺髓质素衍生物>本发明的一个实施方式涉及由下述式(i)表示的化合物或其盐，或者它们的水合物。a-l-b(i)在本说明书中，由式(i)表示的化合物可以被记作“肾上腺髓质素衍生物”。本发明中肾上腺髓质素(am)不仅可以是由人嗜铬细胞瘤组织分离和鉴定的人来源的肽(seqidno:1，非专利文献1)，也可以是例如猪(seqidno:4)、犬(seqidno:6)、牛(seqidno:8)、大鼠(seqidno:10)或小鼠(seqidno:12)等其他非人哺乳动物(例如温血动物)来源的肽(直系同源物)。在体内，这些肽的氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键且c末端被酰胺化。本说明书中，有时将具有二硫键和c末端酰胺基的上述肽记载为“天然肾上腺髓质素”或仅记载为“肾上腺髓质素”。本发明可适用于上述的任一个肽。本说明书中，“c末端的酰胺化”是指在体内，肽的翻译后修饰的一个方式，具体而言是指肽的c末端氨基酸残基的主链羧基向酰胺基形式转化的反应。此外，本说明书中，“半胱氨酸残基的二硫键的形成”或“半胱氨酸残基的二硫键化”是指在体内，肽的翻译后修饰的一个形式，具体而言是指肽的氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键(-s-s-)的反应。许多在体内产生的生物活性肽，开始被生物合成为分子量较大的前体蛋白，其在细胞内转运的过程中，经历c末端酰胺化和/或半胱氨酸残基的二硫键化这样的翻译后修饰反应，成为成熟的生物活性肽。c末端的酰胺化通常是通过c末端酰胺化酶对前体蛋白发生作用而进行。对于具有c末端酰胺基的生物活性肽，在其前体蛋白中gly残基连接在酰胺化的c末端羧基，该gly残基通过c末端酰胺化酶转化为c末端酰胺基。此外，前体蛋白的c末端侧前肽中，存在有例如lys-arg或arg-arg等碱性氨基酸残基组合的重复序列(水野，生物化学第61卷，第12号，1435～1461页(1989))。半胱氨酸残基的二硫键化可在氧化的条件下进行。在体内，半胱氨酸残基的二硫键化通常是通过蛋白二硫键异构酶对前体蛋白发生作用而进行。作为众所周知的生物活性物质的肾上腺髓质素是肽。因此，含有肾上腺髓质素作为有效成分的药物在给药对象(例如人类患者)的体内可有效起作用的时间有可能为非常短的时间。因此，通过将肾上腺髓质素与聚乙二醇(peg)等其他基团连接而成的肾上腺髓质素衍生物的形式，进行了延长在体内的半衰期并改善药物动力学的尝试(专利文献4～6和非专利文献10)。但是，当连接肾上腺髓质素这种较小的肽和peg基这种较大的基团时，所得的肾上腺髓质素衍生物的各种性质可能会取决于peg基的分子量变化很大。此外，当肾上腺髓质素的氨基酸残基的侧链与其他基团连接时，肾上腺髓质素部分的构象会发生变化，与识别肾上腺髓质素的肾上腺髓质素受体的亲和性可能会下降。这种情况下，所得的肾上腺髓质素衍生物作为肾上腺髓质素的药理作用可能会降低。肾上腺髓质素具有很强的扩张血管作用。因此，当将有效治疗量的肾上腺髓质素或其衍生物进行单次给药时，由于很强的扩张血管作用，有可能引起不良的副作用(例如，血压过度降低、伴随反射性的交感神经活性增高的心动过速和/或肾素活性增高等)。尤其是在期待表现扩张血管作用以外的药理作用而使用肾上腺髓质素或其衍生物的情况下，这种副作用的产生会成为问题。为了避免产生上述问题，含有肾上腺髓质素或其衍生物作为有效成分的药物需要通过持续静脉输注向给药对象进行给药。这种给药方法有可能向给药对象强加负担。这就要求维持肾上腺髓质素的药理作用且提高体内的持续性的肾上腺髓质素衍生物即使在向给药对象进行单次给药的情况下，也能够发挥肾上腺髓质素的药理效果，而不会实质产生不良副作用。本发明人发现，通过具有特定氨基酸序列的肽的连接基团连接肾上腺髓质素的n末端的α氨基与免疫球蛋白的fc区域，由此可以保持肾上腺髓质素的生物活性。在本
技术领域：
中，已知免疫球蛋白的fc区域与特定蛋白质或肽连接而成的融合蛋白在向给药对象给药时，与作为母体化合物的蛋白质或肽相比，能够延长在给药对象体内的半衰期(例如专利文献8、9)。因此，通过将本实施方式的由式(i)表示的化合物应用于可由肾上腺髓质素来预防或治疗的状况、疾病和/或紊乱，能够实质性抑制不良的副作用，并持续地预防或治疗该状况、疾病和/或紊乱。式(i)中，b需为由肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物衍生的肽部分。本发明中，“由肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物衍生的肽部分”是指具有从肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物中去掉1个氢原子(通常为氨基的1个氢原子，典型为n末端α氨基的1个氢原子)所得结构的一价自由基。本发明中，“肾上腺髓质素的修饰物”是指上述的天然肾上腺髓质素经化学修饰而得的肽。此外，本发明中，“肾上腺髓质素活性”是指肾上腺髓质素所具有的生物活性。作为肾上腺髓质素活性可列举如下。(1)心血管系统：扩张血管作用、降血压作用、抑制血压升高作用、增加心输出量与改善心功能不全作用、改善肺动脉高压症作用、血管生成作用、淋巴管生成作用、改善血管内皮功能作用、抗动脉硬化作用、心肌保护作用(例如，缺血再灌注损伤或炎症时的心肌保护作用)、抑制心肌梗塞后重塑的作用、抑制心脏肥大的作用和抑制血管紧张素转换酶的作用。(2)肾脏与水电解质系统：利尿作用、利尿钠作用、抑制抗利尿激素的作用、降低醛固酮作用、肾脏保护作用(例如，高血压或缺血再灌注损伤时的肾脏保护作用)、抑制饮用水行为的作用和抑制食盐要求的作用。(3)脑与神经系统：神经保护与抑制脑损伤的作用、抗炎症作用、抑制凋亡的作用(例如，缺血再灌注损伤或炎症时抑制凋亡的作用)、维持自动调节能力的作用、抑制氧化应激的作用、改善痴呆症作用和抑制交感神经作用。(4)泌尿生殖系统：改善勃起的作用、改善血流的作用和促进着床的作用。(5)消化系统：抗溃疡作用、组织修复作用、粘膜生成作用、改善血流的作用、抗炎症作用和改善肝功能的作用。(6)骨科：刺激成骨细胞的作用和改善关节炎的作用。(7)内分泌代谢系统：脂肪细胞分化作用、控制脂肪分解的作用、改善胰岛素敏感性的作用、控制胰岛素分泌的作用、抑制抗利尿激素分泌的作用和抑制醛固酮分泌的作用。(8)其他：改善循环的作用、抗炎症作用、控制细胞因子的作用、器官保护作用、抑制氧化应激的作用、组织修复作用(例如，抗褥疮作用)、改善败血症性休克的作用、抑制多器官功能障碍的作用、抑制自身免疫性疾病的作用、抗菌作用、生发作用和护发作用。上述降血压作用优选为血管扩张性降压作用。上述消化系统的抗炎症作用优选为如类固醇耐受型或类固醇依赖型的炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩病或肠白塞病)这样的炎症性肠病的预防或治疗作用。上述肾上腺髓质素活性通过细胞内camp的浓度升高来表现。因此，可以将细胞内camp的浓度升高作为肾上腺髓质素活性的指标。通过含有由具有上述这样的生物活性的肾上腺髓质素或其修饰物衍生的肽部分b，本实施方式的由式(i)表示的化合物可以表现出与天然肾上腺髓质素实质上基本相同的生物活性(即肾上腺髓质素活性)。上述肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物优选为选自于下述组中的肽：(i)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成的肽；(ii)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成且该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(iii)在(ii)的肽中所述二硫键被亚乙基取代且具有肾上腺髓质素活性的肽；(iv)在(i)～(iii)任一个肽中缺失、取代或添加1～15个氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；(v)在(i)～(iv)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及(vi)在(i)～(iv)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。在一个实施方式中，上述肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物优选为选自于下述组中的肽：(i)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成的肽；(ii)由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成且该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(v)在(i)或(ii)的肽中c末端被酰胺化的肽；以及(vi)在(i)或(ii)的肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。所述(i)～(vi)的肽中，(v)所包含的肽相当于成熟的天然肾上腺髓质素，所述肽由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成，c末端被酰胺化且该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成二硫键。(i)的由肾上腺髓质素的氨基酸序列组成的肽相当于在经历c末端酰胺化和半胱氨酸残基的二硫键化的翻译后修饰之前的(即未成熟的)形式的天然肾上腺髓质素。所述(i)～(vi)的肽中，除了以上描述的肽之外的其他肽相当于肾上腺髓质素的修饰物。上述(ii)的肽可以将上述(i)的肽的两个半胱氨酸残基的硫醇基通过空气氧化或使用适合的氧化剂进行氧化转化为二硫键而形成。通过使用上述(ii)的肽，可以使肽部分b的构象类似于天然肾上腺髓质素的构象。由此，由式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。上述(iii)的肽可以通过使上述(ii)的肽的二硫键转化为亚乙基而形成。由二硫键向亚乙基的取代可以通过本
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众所周知的方法来进行(o.keller等人，helv.chim.acta，1974年，第57卷，1253页)。通过使用上述(iii)的肽，可以使肽部分b的构象稳定化。由此，由式(i)表示的化合物可以在体内持续地表现肾上腺髓质素活性。上述(iv)的肽中，缺失、取代或添加的氨基酸残基，优选为1～15个的范围，更优选为1～10个的范围，进一步优选为1～8个的范围，特别优选为1～5个的范围，最优选为1～3个的范围。优选(iv)的肽是在(i)～(iii)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～12位、第1～10位、第1～8位、第1～5位或第1～3位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽，更优选(iv)的肽是在(i)～(iii)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～10位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽。上述优选的肽中，还可以进一步缺失、取代或添加1个或更多个(例如，1～5个、1～3个，或者1个或两个)氨基酸残基。通过使用上述(iv)的肽，由式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。此外，通过使用上述(iv)的肽，由式(i)表示的化合物可以在体内持续地表现肾上腺髓质素活性。上述(vi)的肽可以通过c末端酰胺化酶的作用来使c末端的甘氨酸残基转化为c末端酰胺基，从而转化为上述(v)的肽。因此，通过向给药对象给予上述(vi)的肽，在该给药对象的体内经过一定时间后，可以形成c末端被酰胺化的肽。由此，由式(i)表示的化合物可以在体内持续地表现肾上腺髓质素活性。更优选地，上述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：(a)由seqidno:1的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:1的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(b)由seqidno:4的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:4的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(c)由seqidno:6的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:6的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(d)由seqidno:8的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:8的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e)由seqidno:10的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:10的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(f)由seqidno:12的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:12的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(g)在(a)～(f)任一个肽中所述二硫键被亚乙基取代且具有肾上腺髓质素活性的肽；(h)在(a)～(g)任一个肽中缺失、取代或添加1～15个氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；(i)在(a)～(h)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及(j)在(a)～(h)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。进一步优选地，在一个实施方式中，上述肾上腺髓质素或其修饰物为选自于下述组中的肽：(a)由seqidno:1的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:1的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(b)由seqidno:4的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:4的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(c)由seqidno:6的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:6的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(d)由seqidno:8的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:8的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e)由seqidno:10的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:10的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(f)由seqidno:12的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:12的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(i)在(a)～(f)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及(j)在(a)～(f)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。上述(h)的肽中，缺失、取代或添加的氨基酸残基，优选为1～12个的范围，更优选为1～10个的范围，进一步优选为1～8个的范围，特别优选为1～5个的范围，最优选为1～3个的范围。优选(h)的肽是在(a)～(g)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～12位、第1～10位、第1～8位、第1～5位或第1～3位的氨基酸且具有肾上腺髓质素活性的肽，更优选(h)的肽是在(a)～(d)任一个肽中从n末端侧起缺失第1～15位、第1～10位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性，或者，在(e)或(f)的肽中从n末端侧起缺失第1～13位、第1～8位或第1～5位的氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽。上述优选的肽中，还可以进一步缺失、取代或添加1个或更多个(例如，1～5个、1～3个，或者1个或两个)氨基酸。通过使用上述(h)的肽，由式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。此外，通过使用所述(h)的肽，由式(i)表示的化合物可以在体内持续地表现肾上腺髓质素活性。式(i)中，a为免疫球蛋白的fc区域，优选地，a为免疫球蛋白g1(igg1)的fc区域，或免疫球蛋白g4(igg4)的fc区域。在本
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中，已知免疫球蛋白的fc区域与特定蛋白质或肽连接而成的融合蛋白在向给药对象给药时，与作为母体化合物的蛋白质或肽相比，能够延长给药对象体内的半衰期(例如专利文献8、9)。因此，具有免疫球蛋白的fc区域的本实施方式的由式(i)表示的化合物可以在体内持续地表现肾上腺髓质素活性。式(i)中，作为用作a的免疫球蛋白的fc区域的来源的哺乳动物可根据以下说明的给药对象适当选择，其中，该给药对象被应用含有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物作为有效成分的药物。a优选为人或非人哺乳动物(例如，猪、犬、牛、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、猫、猴、狒狒或黑猩猩等温血动物)来源的免疫球蛋白的fc区域，更优选为应用与本发明一实施方式的药物的给药对象相同的人或非人哺乳动物来源的免疫球蛋白的fc区域。通过具有人或非人哺乳动物来源的免疫球蛋白的fc区域，本实施方式的由式(i)表示的化合物可以保持天然肾上腺髓质素的药理作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。在式(i)中，l为由具有任意氨基酸序列的肽组成的连接基团。l没有限制，将n设为重复数，可以使用由具有(gggs)n(seqidno:26)(n为2～10的范围的整数，优选为4～6的范围的整数)、(ggggs)n(seqidno:27)(n为2～6的范围的整数，优选为3)、(gggs)n+gggk(seqidno:26、seqidno:28)(n为1～9的范围的整数，优选为3～5的范围的整数)，或(ggggs)n+ggggk(seqidno:27、seqidno:29)(n为1～5的范围的整数，优选为2)的氨基酸序列的肽组成的连接基团。在上述氨基酸序列中，重复单位中的g的数量和重复数n可以适当改变。l特别优选为由具有ggggsggggsggggs(seqidno:22)或ggggsggggsggggk(seqidno:24)的氨基酸序列的肽组成的连接基团，通过利用具有上述氨基酸序列的连接基团l连接免疫球蛋白的fc区域a与由肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物衍生的肽部分b，本实施方式的由式(i)表示的化合物可以保持天然肾上腺髓质素的药理作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。优选地，在式(i)中，fc区域a通过其c末端的羧基与连接基团l的n末端的α氨基形成肽键，来与其余部分连接，并且，肽部分b通过其n末端的α氨基与连接基团l的c末端的羧基形成肽键，来与其余部分连接。即，本实施方式的由式(i)表示的化合物作为整体，具有蛋白质或多肽的结构。通过具有这种结构，本实施方式的由式(i)表示的化合物能够具有很高的生物相容性。因此，本实施方式的由式(i)表示的化合物可以抑制不良的副作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。优选的由式(i)表示的化合物中，a为免疫球蛋白g1(igg1)的fc区域，或免疫球蛋白g4(igg4)的fc区域，b为选自于下述组中的肽，即由肾上腺髓质素或具有肾上腺髓质素活性的其修饰物衍生的肽部分：(a)由seqidno:1的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:1的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(b)由seqidno:4的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:4的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(c)由seqidno:6的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:6的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(d)由seqidno:8的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:8的氨基酸序列组成且第16位的半胱氨酸残基与第21位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e)由seqidno:10的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:10的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(f)由seqidno:12的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:12的氨基酸序列组成且第14位的半胱氨酸残基与第19位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(i)在(a)～(f)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及(j)在(a)～(f)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽，l为由具有ggggsggggsggggs(seqidno:22)或ggggsggggsggggk(seqidno:24)的氨基酸序列的肽组成的连接基团，fc区域a通过其c末端的羧基与连接基团l的n末端的α氨基形成肽键，来与其余部分连接，并且，肽部分b通过其n末端的α氨基与连接基团l的c末端的羧基形成肽键，来与其余部分连接。特别优选的由式(i)表示的化合物为选自于下述组中的肽：(e-a-1)由seqidno:15的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:15的氨基酸序列组成且第259位的半胱氨酸残基与第264位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-2)由seqidno:17的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:17的氨基酸序列组成且第259位的半胱氨酸残基与第264位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-3)由seqidno:19的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:19的氨基酸序列组成且第256位的半胱氨酸残基与第261位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-4)由seqidno:21的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:21的氨基酸序列组成且第256位的半胱氨酸残基与第261位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-5)由seqidno:31的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:31的氨基酸序列组成且第254位的半胱氨酸残基与第259位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-6)由seqidno:33的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:33的氨基酸序列组成且第254位的半胱氨酸残基与第259位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-7)由seqidno:35的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:35的氨基酸序列组成且第249位的半胱氨酸残基与第254位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-8)由seqidno:37的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:37的氨基酸序列组成且第249位的半胱氨酸残基与第254位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-9)由seqidno:41的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:41的氨基酸序列组成且第251位的半胱氨酸残基与第256位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-10)由seqidno:43的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:43的氨基酸序列组成且第251位的半胱氨酸残基与第256位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-11)由seqidno:45的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:45的氨基酸序列组成且第246位的半胱氨酸残基与第251位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-a-12)由seqidno:47的氨基酸序列组成的肽，或者由seqidno:47的氨基酸序列组成且第246位的半胱氨酸残基与第251位的半胱氨酸残基形成二硫键的肽；(e-g)在(e-a-1)～(e-a-12)任一个肽中所述二硫键被亚乙基取代且具有肾上腺髓质素活性的肽；(e-h)在(e-a-1)～(e-g)任一个肽中缺失、取代或添加1～15个氨基酸残基且具有肾上腺髓质素活性的肽；(e-i)在(e-a-1)～(e-h)任一个肽中c末端被酰胺化的肽；以及(e-j)在(e-a)～(e-h)任一个肽中在c末端添加甘氨酸残基的肽。具有上述特征的本实施方式的由式(i)表示的化合物可以保持天然肾上腺髓质素的药理作用，并实质性抑制不良的副作用，在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。本发明中，由式(i)表示的化合物不仅包含该化合物本身，还包含其盐。当由式(i)表示的化合物为盐的形式时，优选为药学上可接受的盐。作为由式(i)表示的化合物的盐的反离子，并没有限制，例如优选为如钠离子、钾离子、钙离子、镁离子，或者取代或者非取代的铵离子这样的阳离子；或者如氯离子、溴离子、碘离子、磷酸根离子、硝酸根离子、硫酸根离子、碳酸根离子、碳酸氢根离子、高氯酸离子、甲酸根离子、乙酸根离子、三氟乙酸根离子、丙酸根离子、乳酸根离子、马来酸根离子、羟基马来酸根离子、甲基马来酸根离子、富马酸根离子、己二酸根离子、苯甲酸根离子、2-乙酰氧基苯甲酸根离子、对氨基苯甲酸根离子、烟酸根离子、肉桂酸根离子、抗坏血酸根离子、帕莫酸根离子、琥珀酸根离子、水杨酸根离子、双亚甲基水杨酸根离子、草酸根离子、酒石酸根离子、苹果酸根离子、柠檬酸根离子、葡萄糖酸根离子、天冬氨酸根离子、硬脂酸根离子、棕榈酸根离子、衣康酸根离子、乙醇酸根离子、谷氨酸根离子、苯磺酸根离子、环己基氨基磺酸根离子、甲磺酸根离子、乙磺酸根离子、羟乙磺酸根离子、苯磺酸根离子、对甲苯磺酸根离子或者萘磺酸根离子这样的阴离子。当由式(i)表示的化合物为与上述反离子的盐的形式时，该化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。在本发明中，由式(i)表示的化合物不仅包含上述化合物本身，还包含该化合物或其盐的溶剂化物。当由式(i)表示的化合物或其盐为溶剂化物的形式时，优选为药学上可接受的溶剂化物。作为可以与上述化合物或其盐形成溶剂化物的溶剂，并没有限制，例如优选为水；或者如甲醇、乙醇、2-丙醇(异丙醇)、二甲基亚砜(dmso)、乙酸、乙醇胺、乙腈或乙酸乙酯这样的有机溶剂。当由式(i)表示的化合物或其盐为与上述溶剂的溶剂化物的形式时，该化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。本发明中，由式(i)表示的化合物不仅包含所述化合物或下述化合物本身，还包含其受保护的形式。本说明书中，“受保护形式”是指在一个或更多个的官能团(例如赖氨酸残基的侧链氨基)中引入保护基的形式。此外，本说明书中，“保护基”是指为了防止不希望的反应进行而引入至特定的官能团的基团，在特定的反应条件下可定量地除去，且在除此之外的反应条件下基本上稳定，即为反应惰性的基团。作为可以形成所述化合物的受保护的形式的保护基，并没有限制，例如可列举：叔丁氧基羰基(boc)、2-溴苄氧基羰基(brz)、9-芴基甲氧基羰基(fmoc)、对甲苯磺酰基(tos)、苄基(bzl)、4-甲基苄基(4-mebzl)、2-氯苄氧基羰基(clz)、环己基(chex)和苯甲酰甲基(pac)；作为氨基的其他保护基：苄氧基羰基、对氯苄氧基羰基、对溴苄氧基羰基、对硝基苄氧基羰基、对甲氧基苄氧基羰基、二苯甲氧基羰基、2-(对联苯基)异丙氧基羰基、2-(3,5-二甲氧基苯基)异丙氧基羰基、对苯基偶氮苄氧基羰基、三苯基磷酰基乙氧基羰基、9-芴基甲氧基羰基、叔戊氧基羰基、二异丙基甲氧基羰基、异丙氧基羰基、乙氧基羰基、烯丙氧基羰基、2-甲基磺酰基乙氧基羰基、2,2,2-三氯乙氧基羰基、环戊氧基羰基、环己氧基羰基、金刚烷氧基羰基、异莰氧基羰基、苯磺酰基、均三甲苯磺酰基、甲氧基三甲基苯磺酰基、2-硝基苯磺酰基、2-硝基苯磺酰基、4-硝基苯磺酰基和4-硝基苯磺酰基；作为羧基的其他保护基：甲酯、乙酯、叔丁酯、对甲氧基苄酯和对硝基苄酯；作为arg的其他侧链保护基：2,2,4,6,7-五甲基-2,3-苯并二氢呋喃-5-磺酰基、4-甲氧基-2,3,6-三甲基苯磺酰基、2,2,5,7,8-五甲基色满-6-磺酰基和2-甲氧基苯磺酰基；作为tyr的其他保护基：2,6-二氯苄基、叔丁基和环己基；作为cys的其他保护基：4-甲氧基苄基、叔丁基、三苯甲基、乙酰胺甲基和3-硝基-2-吡啶次磺酰基；作为his的其他保护基：苄氧基甲基、对甲氧基苄氧基甲基、叔丁氧基甲基、三苯甲基和2,4-二硝基苯基；以及作为ser和thr的其他保护基：叔丁基等。当由式(i)表示的化合物为所述保护基的受保护的形式时，该化合物的肾上腺髓质素活性可以与天然肾上腺髓质素实质上基本相同。此外，在本发明中，由式(i)表示的化合物还包含该化合物的各对映体和非对映体、以及外消旋体这样的该化合物的立体异构体的混合物。通过具有上述特征，本实施方式的由式(i)表示的化合物可以保持天然肾上腺髓质素的药理作用，并在体内持续地表现出肾上腺髓质素活性。<2.肾上腺髓质素衍生物的药物用途>本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物在体内可以持续地表现与作为母体分子的肾上腺髓质素实质上基本相同的生物活性(即肾上腺髓质素活性)。因此，本发明的另一实施方式涉及一种含有本发明由式(i)表示的化合物作为有效成分的药物。当将本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物应用于药物用途时，可以单独使用该化合物，也可以与一种或更多种药学上可接受的成分组合使用。本发明的药物根据所希望的给药方法，可以配制成在本
技术领域：
中常用的各种剂型。因此，本实施方式的药物还可以提供为含有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物和一种或更多种药学上可接受的载体的药物组合物的形式。本发明一实施方式的药物组合物除了上述成分之外，还可以包含药学上可接受的一种或更多种载体、赋形剂、粘合剂、媒介物、增溶剂、防腐剂、稳定剂、膨化剂、润滑剂、表面活性剂、油性液体、缓冲剂、安抚剂、抗氧化剂、甜味剂和调味剂等。含有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物作为有效成分的药物的剂型，并没有特别限制，可以是用于肠胃外给药的制剂，也可以是用于口服给药的制剂。此外，本实施方式的药物的剂型可以是单位剂量形式的制剂，也可以是多次给药形式的制剂。作为用于肠胃外给药的制剂，例如可列举：水或除水之外的药学上可接受的液体的无菌溶液或混悬液等注射剂。作为可以与注射剂混合的添加剂，并没有限制，例如可列举：如生理盐水、含有葡萄糖或其他辅助剂(例如，d-山梨醇、d-甘露醇或氯化钠)的等渗液这样的媒介物；如醇(例如乙醇或者苄醇)、酯(例如苯甲酸苄酯)、多元醇(例如丙二醇或者聚乙二醇)这样的增溶剂；如聚山梨酯80或聚氧乙烯氢化蓖麻油这样的非离子表面活性剂；如芝麻油或大豆油这样的油性液体；如磷酸盐缓冲液或乙酸钠缓冲液这样的缓冲剂；如苯扎氯铵或盐酸普鲁卡因这样的安抚剂；如人血清白蛋白或聚乙二醇这样的稳定剂；以及防腐剂及抗氧化剂等。配制的注射剂通常填充到适当的小瓶(例如安瓿瓶)中，保存在适合的环境下直至使用。作为用于口服给药的制剂，例如可列举：根据需要施以糖衣、水溶性包衣的片剂、胶囊剂、酏剂、微囊剂、糖浆、混悬液等。作为可以与片剂或胶囊剂等混合的添加剂，并没有限制，例如可列举：如明胶、玉米淀粉、黄蓍胶和阿拉伯胶这样的粘合剂；如微晶纤维素这样的赋形剂；如玉米淀粉、明胶和海藻酸这样的膨化剂；如硬脂酸镁这样的润滑剂；如蔗糖、乳糖或糖精这样的甜味剂；如薄荷、白珠油(akamonooil)或樱桃这样的调味剂等。当制剂为胶囊剂时，可以进一步含有油脂这样的液状载体。本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物可以在体内持续地表现出与作为母体分子的肾上腺髓质素实质上基本相同的肾上腺髓质素活性。因此，含有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物作为有效成分的药物可以配制为长效制剂。这种情况下，可以将呈长效制剂剂型的本实施方式的药物，例如通过埋入皮下或者肌肉内或肌肉注射来给药。通过将本实施方式的药物应用于长效制剂，可以长时间持续地表现出本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物的肾上腺髓质素活性。含有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物作为有效成分的药物，可以与作为药物有用的一种或更多种其他药剂同时使用。这种情况下，本实施方式的药物可以提供为包含本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物与一种或更多种其他药剂的单一药物的形式，也可以提供为包含本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物与一种或更多种其他药剂分别制剂化的多个制剂的药物组合或试剂盒的形式。在药物组合或试剂盒的形式的情况下，可以将各自的制剂同时或分别(例如连续地)给药。当将本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物应用于药物用途时，由式(i)表示的化合物不仅包含该化合物本身，还包含该化合物的药学上可接受的盐和它们的药学上可接受的溶剂化物。作为本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物的药学上可接受的盐和它们的药学上可接受的溶剂化物，并没有限制，例如优选为如上述举例的盐或溶剂化物。当由式(i)表示的化合物为上述盐或溶剂化物的形式时，可以将该化合物应用于所希望的药物用途。含有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物作为有效成分的药物，可以对由肾上腺髓质素进行预防或治疗的各种状况、疾病和/或紊乱进行同样的预防或治疗。作为上述状况、疾病和/或紊乱，并没有限制，例如可举出如下内容。(1)循环系统疾病：心功能不全、肺动脉高压症、闭塞性动脉硬化症、血栓闭塞性脉管炎、心肌梗塞、淋巴肿大、川崎病、心肌炎、高血压、高血压所致的器官紊乱和动脉硬化症。(2)肾脏与水电解质系统疾病：肾衰竭和肾炎。(3)脑与神经系统疾病：脑梗塞、痴呆症和脑炎。(4)泌尿生殖系统疾病：勃起功能障碍(ed)。(5)消化系统疾病：炎症性肠病、溃疡性疾病、肠白塞病和肝功能不全。(6)骨科疾病：关节炎。(7)内分泌代谢疾病：糖尿病和糖尿病所致的器官紊乱和原发性醛固酮增多症。(8)其他：败血症性休克、自身免疫性疾病、多器官衰竭、褥疮、创伤愈合和脱发症。上述循环系统疾病优选为心肌梗塞、肺动脉高压症或心功能不全等疾病。上述消化系统疾病优选为类固醇耐受型或类固醇依赖型的炎症性肠病(例如，溃疡性结肠炎、克罗恩病或肠白塞病)这样的炎症性疾病。本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物具有通过肽的连接基团连接作为天然生物活性肽的肾上腺髓质素与免疫球蛋白的fc区域的结构。因此，本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物安全且毒性低。因此，含有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物作为有效成分的药物，可以适用于需要预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱的各种给药对象。上述给药对象优选为人或非人哺乳动物(例如，猪、犬、牛、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、鸡、羊、猫、猴、狒狒或黑猩猩等温血动物)的受试对象或患者。通过对上述给药对象给予本实施方式的药物，可以对由肾上腺髓质素进行预防或治疗的各种状况、疾病和/或紊乱进行预防或治疗。本说明书中，“预防”是指实质上防止状况、疾病和/或紊乱的发生(发病或表现)。此外，本说明书中，“治疗”是指抑制(例如抑制发展)、明显缓解、修复和/或治愈发生(发病或表现)的状况、疾病和/或紊乱。本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物可以在具有上述状况、疾病和/或紊乱(例如，循环系统疾病、炎症性疾病、血管疾病或肾疾病)的给药对象中，用于预防或治疗该状况、疾病和/或紊乱。因此，本实施方式的药物优选为用于预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱的药物，更优选为用于预防或治疗循环系统疾病、炎症性疾病、血管疾病或肾疾病的药物。此外，本发明涉及一种含有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物作为有效成分的循环系统疾病、炎症性疾病、血管疾病或肾疾病的预防或治疗剂。通过将本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物用于预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱，可以持续地预防或治疗该状况、疾病和/或紊乱。本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物可以在具有上述状况、疾病和/或紊乱(例如，循环系统疾病、炎症性疾病、血管疾病或肾疾病)的给药对象中，用于预防或治疗该状况、疾病和/或紊乱。因此，本发明的另一实施方式是预防或治疗上述疾病或者状况的方法，上述方法包括对需要预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱的给药对象，给予有效量的本发明由式(i)表示的化合物或其药学上可接受的盐，或者它们的药学上可接受的水合物。上述状况、疾病和/或紊乱优选为循环系统疾病、炎症性疾病、血管疾病或肾疾病。通过对需要预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱的给药对象给予本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物，可以预防或治疗该状况、疾病和/或紊乱。本发明的另一实施方式是用于预防或治疗上述说明的状况、疾病和/或紊乱的本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物或其药学上可接受的盐、或者它们的药学上可接受的水合物。本发明的再一实施方式是本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物或其药学上可接受的盐、或者它们的药学上可接受的水合物用于制备用于预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱的药物的用途。上述状况、疾病和/或紊乱优选为循环系统疾病、炎症性疾病、血管疾病或肾疾病。通过将本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物或药物用于预防或治疗上述状况、疾病和/或紊乱，可以持续地预防或治疗该状况、疾病和/或紊乱。当将含有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物作为有效成分的药物向给药对象、特别是人患者给药时，精确的给药量和给药次数要考虑到给药对象的年龄、性别、需要预防或治疗的状况、疾病和/或紊乱的精确状态(例如重症度)、以及给药途径等多种因素，主治医生应最终确定治疗上有效的给药量和给药次数。因此，本实施方式的药物中，作为有效成分的由式(i)表示的化合物可以以治疗上有效量和次数向给药对象给药。例如，当本实施方式的药物对人患者给药时，作为有效成分的由式(i)表示的化合物的给药量通常为在每天每60kg体重0.01～100mg的范围，典型地为每天每60kg体重0.01～10mg的范围。含有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物作为有效成分的药物的给药途径和给药次数并没有特别限制，可以口服单次或多次给药，也可以肠胃外单次或多次给药。本实施方式的药物优选为经静脉给药、灌肠给药、皮下给药、肌肉内给药或腹腔内给药这样的肠胃外途径给药，更优选为静脉给药或皮下给药。此外，本实施方式的药物优选为单次给药。本实施方式的药物特别优选为用于经静脉或皮下单次给药。作为本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物的母体分子的肾上腺髓质素具有很强的扩张血管作用。因此，当将有效治疗量的肾上腺髓质素进行单次给药时，由于很强的扩张血管作用，可能引起血压下降过度、伴随反射性的交感神经活性增高的心动过速和/或肾素活性增高这样的不良副作用。与此相对，本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物在保持与天然肾上腺髓质素实质上基本相同的肾上腺髓质素活性的同时，与天然肾上腺髓质素相比，可显著延长血液中半衰期。因此，将含有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物作为有效成分的药物单次向对象静脉给药，可以在抑制由肾上腺髓质素的扩张血管作用引起的不良副作用的同时，持续地预防或治疗给药对象的状况、疾病和/或紊乱。<3.肾上腺髓质素衍生物的制造方法>本发明的再一实施方式涉及一种本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物的制造方法。即，本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物作为整体，具有蛋白质或多肽的结构。因此，本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物可以基于本
技术领域：
中用于合成蛋白质或多肽的合成方法或培养方法等各种方法来制造。例如，当基于培养方法来制造本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物时，可以制作能够产生本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物的宿主细胞，然后在该宿主细胞中大量表达目的化合物。因此，当基于培养方法制造时，本实施方式的方法包括表达步骤，该步骤使在能够产生本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物的宿主细胞中，大量表达该化合物。能够产生本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物的宿主细胞可以通过以下方式获得：得到具有编码本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物的碱基序列的分离核酸，然后将该核酸与载体连接并导入到大肠杆菌或芽殖酵母等的细胞，进行转化。因此，本发明的另一实施方式涉及一种分离的核酸，其含有编码本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物的碱基序列。此外，本发明的另一实施方式涉及一种载体或宿主细胞，其含有本发明一实施方式的核酸。本发明一实施方式的分离的核酸优选具有与上述本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物的各种实施方式相对应的碱基序列，更优选具有选自于由seqidno:14、seqidno:16、seqidno:18、seqidno:20、seqidno:30、seqidno:32、seqidno:34、seqidno:36、seqidno:40、seqidno:42、seqidno:44、seqidno:46组成的组的碱基序列。本发明一实施方式的载体和宿主细胞可以使用本
技术领域：
中通常用于重组基因的表达和/或重组表达的各种载体和宿主细胞来获得。作为用于获得本实施方式的载体的载体，例如作为用于基因表达的载体可举出puc119、puc118和pgemt-easy载体等质粒载体，作为用于蛋白质表达的载体可举出pet-11a、pet-3a和pet-32a等质粒载体。此外，作为用于获得本实施方式的宿主细胞的细胞，例如可举出大肠杆菌、芽殖酵母和动物细胞(hek293和cho等)等细胞。例如，当基于合成方法制造本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物时，可以通过固相体系或液相体系的肽合成，来合成具有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物的氨基酸序列的肽链。因此，当基于合成方法制造时，本实施方式的方法包括肽链合成步骤，该步骤使通过固相体系或液相体系的肽合成，来合成具有本发明一实施方式的由式(i)表示的化合物的氨基酸序列的肽链。在基于上述合成方法的本实施方式的方法中，通过将利用肽链合成步骤获得的肽链的氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基的硫醇基二硫键化，可以得到该氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基形成有二硫键的由式(i)表示的化合物。此外，通过将利用肽链合成步骤获得的肽链的氨基酸序列中的两个半胱氨酸残基之间形成的二硫键用亚乙基取代，可以得到该二硫键被亚乙基取代的由式(i)表示的化合物。上述二硫键化反应和亚乙基的取代反应可以根据本
技术领域：
中常用的条件来实施。在基于合成方法的本实施方式的方法中，当利用肽链合成步骤获得的肽链或其前体中的至少一种为它们的受保护形式时，本实施方式的方法可以包括以下步骤：根据预期在肽链或其前体中引入一种或更多种保护基的保护步骤，和/或，对受保护形式的肽链或其前体中的一种或更多种保护基的至少任一种去保护的去保护步骤。上述保护步骤和去保护步骤可以通过本
技术领域：
中常用的保护化反应和去保护化反应来实施。实施例下面利用实施例对本发明进行更具体的说明。但是，本发明的技术范围并不限于这些实施例。<实验i：编码肾上腺髓质素衍生物的重组基因的制作>[实验i-1：重组基因的设计和分析]根据免疫球蛋白g1(igg1)的fc区域、免疫球蛋白g4(igg4)的fc区域、人肾上腺髓质素(am)和下述连接基团，设计具有下述结构的肾上腺髓质素衍生物的重组基因。对使用的基因进行的碱基序列中的限制酶位点的寻找、碱基序列的确认和引物的设计、以及所对应的蛋白质的氨基酸序列、分子量和等电点等的分析，使用基因信息处理软件genetixver.13(genetix公司)来进行。实施例1：(igg1fc区域)+(连接肽s)+(am-gly)；(seqidno:14、seqidno:15)实施例2：(igg1fc区域)+(连接肽k)+(am-gly)；(seqidno:16、seqidno:17)实施例3：(igg4fc区域)+(连接肽s)+(am-gly)；(seqidno:18、seqidno:19)实施例4：(igg4fc区域)+(连接肽k)+(am-gly)；(seqidno:20、seqidno:21)实施例5：(igg1fc区域)+(连接肽s)+(am(6-52)-gly)；(seqidno:30、seqidno:31)实施例6：(igg1fc区域)+(连接肽k)+(am(6-52)-gly)；(seqidno:32、seqidno:33)实施例7：(igg1fc区域)+(连接肽s)+(am(11-52)-gly)；(seqidno:34、seqidno:35)实施例8：(igg1fc区域)+(连接肽k)+(am(11-52)-gly)；(seqidno:36、seqidno:37)比较例1：(igg1fc区域)+(am-gly)；(seqidno:38、seqidno:39)实施例9：(igg4fc区域)+(连接肽s)+(am(6-52)-gly)；(seqidno:40、seqidno:41)实施例10：(igg4fc区域)+(连接肽k)+(am(6-52)-gly)；(seqidno:42、seqidno:43)实施例11：(igg4fc区域)+(连接肽s)+(am(11-52)-gly)；(seqidno:44、seqidno:45)实施例12：(igg4fc区域)+(连接肽k)+(am(11-52)-gly)；(seqidno:46、seqidno:47)比较例2：(igg4fc区域)+(am-gly)；(seqidno:48、seqidno:49)连接肽s：氨基酸序列：ggggsggggsggggs；(seqidno:22)碱基序列：ggaggaggaggatcaggaggaggaggatcaggaggaggaggatca(seqidno:23)连接肽k：氨基酸序列：ggggsggggsggggk(seqidno:24)碱基序列：ggaggaggaggatcaggaggaggaggatcaggaggaggaggaaag(seqidno:25)[实验i-2：dna片段的制作]将编码igg1的fc区域、igg4的fc区域和人肾上腺髓质素(am)的dna片段进行克隆。igg1的fc区域参考ellison等人的文献(ellisonjw,nucleicacidsres.1982；10(10)；4071-9)和genbank：jn222933。igg4的fc区域参考labrijn等人的文献(labrijnaf,jimmunol.2011；187(6):3238-46.)。am参考kitamura等人的文献(kitamuraket.al.bbrc.1993；194(2)；720-5.)。各dna片段的克隆使用rtaq(宝生物株式会社)进行。关于pcr，在94℃、2分钟后按照94℃30秒、50℃30秒以及72℃1分钟进行30个循环，之后在72℃10分钟的反应条件下进行。关于连接基团部分，使用dna合成装置来合成具有以下碱基序列的dna片段。[实验i-3：dna片段的纯化]通过琼脂糖凝胶电泳，将利用pcr扩增的dna片段分离。使用qiaquick凝胶提取试剂盒(qiagen公司)，将目的dna片段从琼脂糖凝胶中切下并进行纯化。[实验i-4：限制酶处理]按照高保真(hf)限制酶套装(newenglandbiolabs公司)的步骤，对纯化的dna片段和载体的dna进行限制酶处理。载体使用基因表达用载体puc119(宝生物株式会社)(novagen)。[实验i-5：连接]将经过限制酶处理的目的dna片段(插入dna)和50ng的载体dna，按照插入dna:载体的摩尔比为3:1的比例进行混合。向该混合液中加入与混合液等量的2×ligationmix(nippongene)，在16℃反应30分钟。[实验i-6：转化]按照用于表达基因的大肠杆菌(hst04dam-/dcm-感受态细胞(宝生物株式会社))的步骤，将连接后的质粒dna导入到大肠杆菌中进行转化。[实验i-7：重组基因的碱基序列的确认]使用qiaprep离心小量提取试剂盒(qiagen公司)，从转化后的大肠杆菌的菌落中纯化重组质粒。使用appliedbiosystems3730xldna分析仪(美国应用生物系统公司)，确认纯化的质粒的碱基序列。结果确认出实施例1～12和比较例1、2均具有指定的碱基序列。<实验ii：肾上腺髓质素衍生物蛋白的制备>[实验ii-1：重组基因的设计和分析]按照newenglandbiolabs的步骤，用ndei和bamhi对导入到基因表达用载体puc119的目的dna片段和蛋白质表达用载体pet-11a(novagen)进行限制酶处理。通过琼脂糖凝胶电泳，将通过限制酶处理而获得的dna片段分离。使用qiaquick凝胶提取试剂盒(qiagen公司)，将目的dna片段从琼脂糖凝胶中切下并进行纯化。[实验ii-2：连接]将经过限制酶处理的目的dna片段(插入dna)和50ng的载体dna，按照插入dna:载体的摩尔比为3:1的比例进行混合。向该混合液中加入与混合液等量的2×ligationmix(nippongene)，在16℃反应30分钟。[实验ii-3：转化]按照默克密理博公司的用于大肠杆菌基因表达的步骤，将连接后的质粒dna导入到大肠杆菌中进行转化。作为用于表达基因的大肠杆菌，实施例1、2、5～12和比较例1、2的肾上腺髓质素衍生物的重组体使用bl21感受态细胞，实施例3、4的肾上腺髓质素衍生物的重组体使用rosetta感受态细胞。[实验ii-4：目的蛋白的表达诱导]使用确认到导入有导入了目的dna片段的质粒dna的大肠杆菌，通过异丙基-β-硫代半乳糖苷(iptg)对目的蛋白进行表达诱导。在正式培养的前一天，从培养在加入氨苄青霉素的lb琼脂培养基的大肠杆菌的菌落中，用牙签挑取菌体，接种到加入氨苄青霉素的lb液体培养基中。将接种在该lb液体培养基的大肠杆菌在37℃振荡培养过夜(预培养)。在加入氨苄青霉素的lb液体培养基中添加总体积10％的量的预培养的菌液，在37℃振荡培养(正式培养)。正式培养持续到培养液在600nm下的吸收强度变为0.5～1.0的范围为止。bl21株用3小时达到指定的吸收强度，rosetta株则用4小时达到指定的吸收强度。在培养液中添加iptg，以使浓度变为1mm。在35℃进行4小时振荡培养后，从培养液中回收菌体。[实验ii-5：菌体的回收]向50ml试管中加入50ml在实验ii-4中得到的正式培养的培养液，以10,000×g，在4℃离心分离5分钟。除去上清液后，向同一试管中添加50ml培养液，在相同条件下进行离心分离。除去上清液后，相对于10ml培养液中添加5ml的25mmtris-hcl+2.5mmedta+1％nacl+0.2mmdtt(ph7.2)，悬浮菌体。将悬浮液以10,000×g，在4℃离心分离5分钟。除去上清液后，菌体沉淀在-80℃冷冻过夜。将冷冻的菌体保存在-20℃。[实验ii-6：菌体的粉碎]向在实验ii-5中得到的菌体，添加用于回收菌体的培养液的五分之一量的25mmtris-hcl+2.5mmedta+1％nacl+0.2mmdtt(ph7.2)，悬浮菌体。将悬浮液以20,000×g，在室温下离心分离5分钟。除去上清液后，向沉淀添加每100ml用于回收菌体的培养液为5ml的量的bugbustermastermix(默克密理博公司)，悬浮菌体。将悬浮液在室温下振荡20分钟后，以16,000×g，在4℃离心分离20分钟。回收上清液后，向沉淀添加用于回收菌体的培养液的十分之一量的25mmtris-hcl+2.5mmedta+0.1％triton+0.2mmdtt(ph7.2)，悬浮菌体。将悬浮液以20,000×g，在室温下离心分离5分钟。之后，将上清液与沉淀分开，分别保存。[实验ii-7：利用sds-page确认蛋白质]根据实验书(“page初次电泳蛋白质的page篇”(http://www.atto.co.jp/site/download_request/experiment)，atto公司)，利用sds-page确认在实验ii-6中得到的粉碎后的菌体的上清液和沉淀中是否含有目的蛋白。将利用sds-page分离在实验ii-6中得到的粉碎后的菌体的沉淀组分的结果示于图1。图中，泳道1、6分别表示分子量标准物质，泳道2、3、4、5分别表示从实施例1、2、3、4的肾上腺髓质素衍生物的重组体得到的沉淀组分。如图1所示，确认到沉淀组分中含有目的蛋白作为包涵体(图中箭头)。<实验iii：重组蛋白的再折叠，以及其分离和纯化>[实验iii-1：再折叠]向包涵体中加入8m尿素+25mmtris-hcl+2.5mmedta+0.2mmdtt(ph7.5)进行悬浮。利用超声波处理，使悬浮液中所含有的沉淀充分溶解。将溶解的沉淀的浓度调节至200μg/ml。将该溶液加入到snakeskin(商标)透析管(赛默飞世尔科技公司)中，将25mmtris-hcl+2.5mmedta+0.1mmgssg(ph7.2)作为透析外液，在4℃进行5小时透析。将外液更换成新的25mmtris-hcl+2.5mmedta+0.1mmgssg(ph7.2)，在4℃再透析过夜。此外，外液的更换进行1或2次。在该透析中，也可以使用含有精氨酸的外液。将透析后的样本回收到试管中，在20,000×g、4℃、20分钟的条件下进行离心分离。以下的纯化使用离心分离后的上清液。关于实施例1～12，将每400ml培养液的再折叠后的纯化物的回收量示于表1。比较例1、2虽然在大肠杆菌内的表达产生没有问题，但在实验iii-1的再折叠步骤中明显产生了缔合和沉淀，其原因推测为不良的物理性质所导致。结果，在这些比较例中，难以获得纯化物。[表1]实施例280nm吸光度回收量(ml)18.45844.222.16752430.32647.540.4155453.15421560.275311071.7332482.9474892.52864100.36637.7110.23815.5120.36455[实验iii-2：再折叠的重组蛋白的纯化]按照hitrap蛋白ahp和ab缓冲液试剂盒(gehealthcare公司)的步骤，从在实验iii-1中得到的离心分离后的上清液中纯化再折叠的重组蛋白。用20mm柠檬酸缓冲液(ph7.2)将纯化后的重组蛋白稀释。用amiconultra-15ultracel-10k(默克密理博公司)进行稀释液的浓缩和溶剂置换。[实验iii-3：使用蛋白测序仪确认重组蛋白的氨基酸序列]利用sds-page将在实验iii-2中得到的实施例1、2、3、4、5的再折叠的重组蛋白分离。使用ezblot(atto公司)，将sds-page后的凝胶转移到聚偏氟乙烯(pvdf)膜。使用蛋白测序仪(实施例1～4：procise494ht蛋白测序系统，美国应用生物系统公司；实施例5：ppsq-33a，岛津制作所)，确认转移到pvdf膜的样本中所含有的实施例1、2、3、4、5的重组蛋白的n末端侧的氨基酸序列。结果确认到，实施例1、2、5的重组蛋白与igg1的n末端氨基酸序列相同，实施例3、4的重组蛋白与igg4的n末端氨基酸序列相同。[实验iii-4：重组蛋白的酰胺化]在130μg的实施例1的重组蛋白中加入4mm抗坏血酸、10μmcuso4、100μg/ml过氧化氢酶和500ng/ml酰胺化酶(重组人肽酰甘氨酸α-酰胺化单加氧酶/pam、r&dsystems公司)，用50mm乙酸钠溶液(ph5.5)调节至合计200μl。将反应液在37℃反应1小时。之后，在反应液中加入20μl的250mmedta，停止反应。使用识别肾上腺髓质素的酰胺化c末端的抗体，利用irma法(ohtah,tsujit,asais等人，one-stepdirectassayformature-typeadrenomedullinwithmonoclonalantibodies.clinchem,第45卷,p.244-251,1999年)确认重组蛋白已被酰胺化。<实验iv：肾上腺髓质素衍生物的使用例(1)>[实验iv-1：肾上腺髓质素衍生物的细胞内camp浓度升高作用]已知am的生理作用通过增加细胞内camp的浓度来表现(参考非专利文献1)。所以，在表达am受体的培养细胞系(hek293细胞系)中添加实施例的肾上腺髓质素衍生物，测定细胞内camp的产生量。在0.5mm的ibmx存在下，向汇合的hek293细胞中添加10-7m的实施例1或2的肾上腺髓质素衍生物或肾上腺髓质素-甘氨酸(am-gly)，孵育15分钟。然后，使用campelisa检测试剂盒(gehealthcare,#rpn2251)，测量各测试样品的hek293细胞中的细胞内camp浓度。结果，试验的实施例1、2的肾上腺髓质素衍生物均显示出与am-gly同等程度的细胞内camp浓度升高作用。因此可以推测，连接有免疫球蛋白的fc区域的肾上腺髓质素衍生物保持着与作为母体化合物的am-gly同等程度的生物活性。[实验iv-2：酰胺化的肾上腺髓质素衍生物的细胞内camp浓度升高作用]向表达am受体的培养细胞系hek293细胞中，添加酰胺化的实施例1～12的化合物以及人am(ham)中的任一种，孵育15分钟。其他步骤与实验iv-1记载的步骤同样地进行。将添加ham时的最大活性设为100％，将添加10-6m的实施例1～12的化合物时的结果作为相对值计算。将结果示于表2。[表2]如表2所示，n末端侧缺失的am的fc融合体与全长am即ham的fc融合体相比，确认到活性相对高的趋势。尤其是实施例5～8那样的igg1的fc区域的融合体，明显表现出高活性。[实验iv-3：肾上腺髓质素衍生物在皮下给药时血液浓度随时间的推移]对7周龄的wistar大鼠(约300g)皮下给予10nmol/kg的实施例1的化合物(以下也会简单记作“实施例1”)或实施例5的化合物(以下也会简单记作“实施例5”)的生理盐水溶液。在给药前(0)、给药60分钟后、160分钟后、8小时后、1天后和2天后，用异氟烷进行吸入麻醉。在麻醉状态下，在添加edta-2na和抑肽酶的状态下，从锁骨下静脉采集200μl血液。将得到的血液以3,000转离心分离10分钟，从而获得血浆。血浆中的am浓度通过irma法测定。将皮下给予实施例1或5时的am衍生物的血液中浓度随时间的变化示于图2。如图2所示，即使在皮下给予实施例1或5的情况下，在给药2天后，在治疗范围中也会有足够量的am衍生物存在于血液中。[实验iv-4：肾上腺髓质素衍生物在尾静脉给予时血液中浓度随时间的推移]对7周龄的wistar大鼠(约300g)，从尾静脉给予10nmol/kg的实施例1或5的生理盐水溶液。在给药前(0)和给药2天后，用异氟烷进行吸入麻醉。在麻醉状态下，在添加edta-2na和抑肽酶的状态下，从锁骨下静脉采集200μl血液。将得到的血液以3,000转离心分离10分钟，从而获得血浆。血浆中的am浓度通过irma法测定。将尾静脉给予实施例1或5时的am衍生物在给药2天后的血液中浓度示于图3。如图3所示，即使在尾静脉给予实施例1或5的情况下，在给药2天后，在治疗范围中也会有足够量的am衍生物存在于血液中。<实验v：肾上腺髓质素衍生物的使用例(2)>[实验v-1：肾上腺髓质素衍生物在自发性高血压大鼠(shr)中的血压升高抑制效果]通过以下步骤，考察皮下给予实施例5对shr的血压升高的抑制效果。对给予了高盐食物的8周龄shr，皮下单次给予50nmol/kg的实施例5的生理盐水溶液。作为对照组，皮下单次给予同等量的生理盐水。利用尾套管在给药前和给药9天后测定血压。在实验结束时(给药10天后)采血，测定实施例5的血液中浓度。将皮下给予实施例5对shr的血压升高的抑制效果示于图4。图中，纵轴表示给药9天后的收缩期血压减去给药前的收缩期血压而得到的血压差(mmhg)。*表示通过t检验(n＝5)计算出的相对于给予生理盐水的对照组的p值低于0.05。如图4所示，与给予生理盐水的对照组相比，在实施例5给药组中，血压升高明显受到抑制。此外，在给药10天后，实施例5仍然在血液中存在(数据未显示)。[实验v-2：在葡聚糖硫酸钠(dss)诱导结肠炎模型中的药理效果]通过以下步骤，考察皮下给予实施例5对大鼠dss诱导结肠炎模型的炎症改善效果。对小鼠的背部皮下给予50nmol/kg的实施例5的生理盐水溶液。作为对照组，皮下单次给予同等量的生理盐水。在给药次日，通过给予5天3％dss饮用水，开始制备结肠炎模型。在第0、3、5天，观察体重和粪便的性状，并按照表3所示的评分进行评价。在最后一天采集肠道，比较其湿重。将皮下给予实施例5对dss诱导结肠炎模型的炎症改善效果示于图5。图中，纵轴表示对照组或实施例5给药组在第5天的总得分。*表示通过t检验(n＝10)计算出的相对于给予生理盐水的对照组的p值低于0.05。[表3]如图5所示，在第5天，与给予生理盐水的对照组相比，在实施例5给药组中，炎症评分明显减轻。此外，肠道的湿重与给予生理盐水的对照组相比，在实施例5给药组中明显减轻(数据未显示)。这些结果表明，实施例5的给药减轻了大肠的炎症。本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请直接作为参考而纳入本说明书中。序列表<110>国立大学法人宫崎大学<120>长效肾上腺髓质素衍生物<130>ph-7274-pct<150>jp2017-064369<151>2017-03-29<160>49<170>patentinver.2.1<210>1<211>52<212>prt<213>智人(homosapiens)<400>1tyrargglnsermetasnasnpheglnglyleuargserpheglycys151015argpheglythrcysthrvalglnlysleualahisglniletyrgln202530phethrasplysasplysaspasnvalalaproargserlysileser354045proglnglytyr50<210>2<211>1449<212>dna<213>智人(homosapiens)<220><221>cds<222>(157)..(711)<400>2ctggatagaacagctcaagccttgccacttcgggcttctcactgcagctgggcttggact60tcggagttttgccattgccagtgggacgtctgagactttctccttcaagtacttggcaga120tcactctcttagcagggtctgcgcttcgcagccgggatgaagctggtttccgtc174metlysleuvalserval15gccctgatgtacctgggttcgctcgccttcctaggcgctgacaccgct222alaleumettyrleuglyserleualapheleuglyalaaspthrala101520cggttggatgtcgcgtcggagtttcgaaagaagtggaataagtgggct270argleuaspvalalasergluphearglyslystrpasnlystrpala253035ctgagtcgtgggaagagggaactgcggatgtccagcagctaccccacc318leuserargglylysarggluleuargmetsersersertyrprothr404550gggctcgctgacgtgaaggccgggcctgcccagacccttattcggccc366glyleualaaspvallysalaglyproalaglnthrleuileargpro55606570caggacatgaagggtgcctctcgaagccccgaagacagcagtccggat414glnaspmetlysglyalaserargserprogluaspserserproasp758085gccgcccgcatccgagtcaagcgctaccgccagagcatgaacaacttc462alaalaargileargvallysargtyrargglnsermetasnasnphe9095100cagggcctccggagctttggctgccgcttcgggacgtgcacggtgcag510glnglyleuargserpheglycysargpheglythrcysthrvalgln105110115aagctggcacaccagatctaccagttcacagataaggacaaggacaac558lysleualahisglniletyrglnphethrasplysasplysaspasn120125130gtcgcccccaggagcaagatcagcccccagggctacggccgccggcgc606valalaproargserlysileserproglnglytyrglyargargarg135140145150cggcgctccctgcccgaggccggcccgggtcggactctggtgtcttct654argargserleuproglualaglyproglyargthrleuvalserser155160165aagccacaagcacacggggctccagcccccccgagtggaagtgctccc702lysproglnalahisglyalaproalaproproserglyseralapro170175180cactttctttaggatttaggcgcccatggtacaaggaatagtcgcgcaa751hispheleu185gcatcccgctggtgcctcccgggacgaaggacttcccgagcggtgtggggaccgggctct811gacagccctgcggagaccctgagtccgggaggcaccgtccggcggcgagctctggctttg871caagggcccctccttctgggggcttcgcttccttagccttgctcaggtgcaagtgcccca931gggggcggggtgcagaagaatccgagtgtttgccaggcttaaggagaggagaaactgaga991aatgaatgctgagacccccggagcaggggtctgagccacagccgtgctcgcccacaaact1051gatttctcacggcgtgtcaccccaccagggcgcaagcctcactattacttgaactttcca1111aaacctaaagaggaaaagtgcaatgcgtgttgtacatacagaggtaactatcaatattta1171agtttgttgctgtcaagattttttttgtaacttcaaatat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