一种检测Eps8基因表达水平的试剂盒的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种检测eps8基因表达水平的试剂盒。

背景技术：

eps8(epidermalgrowthfactorreceptorpathwaysubstratenumber8)是一种表皮生长因子受体的酪氨酸激酶活化底物，能够被egfr酪氨酸磷酸化，也能被其他几种受体酪氨酸激酶磷酸化。人eps8基因位于染色体12q23-q24，有p97^eps8和p68^eps8两种亚型和eps8l1-3三种家族成员，主要成圆状分布在细胞核周围的细胞质中。

近年来研究发现eps8在多种人肿瘤标本及细胞系中过表达，以eps8-e3b1-sos1、eps8-abi1-p85-sos1和irsp53-eps8复合体的形式被赋予rac特异活性，诱导肌动蛋白细胞骨架重排，通过egfr、pi3k/akt、mapk等多条信号通路促进细胞的有丝分裂和转化能力，参与多种肿瘤如宫颈癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、乳腺癌、肠癌、头颈部鳞状细胞癌、口腔鳞状细胞癌、恶性血液肿瘤的发生发展。所以检测eps8基因可以为多种癌症的诊断及治疗提供参考依据。

本发明采用实时荧光定量pcr技术，根据荧光pcr绝对定量的原理，即利用已知浓度的标准品稀释至不同浓度，作为模板进行pcr反应，以标准品拷贝数的对数值为横坐标，以测得的ct值为纵坐标绘制曲线对未知样品定量。标准品与未知样品目的基因的扩增效率相同，最后结合标准曲线及未知样品目的基因ct值推算出样品中目的基因所含的模板量，从而判断样品中目的基因的表达情况。本发明检测试剂盒使用方便，操作快速，灵敏度高。

实时荧光定量pcr法具有较高的灵敏度和特异性，能对pcr进行实时检测，反应靶基因在组织中的初始表达量。常见的qrt-pcr方法有sybrgreeni染料法，双探针杂交法以及taqman技术等。sybrgreeni染料法特异性不如双探针杂交法以及taqman法，需监测溶解曲线判断其特异性，双探针杂交法成本昂贵，所以本研究采用taqman探针法检测eps8基因表达水平。

技术实现要素：

本发明设计了eps8基因和abl基因的引物及探针序列，用荧光定量pcr技术检测eps8基因表达水平。通过调整两个基因引物和探针浓度及比例，优化pcr反应体系和反应条件，以健康供者eps8表达量为参照，开发一种的eps8基因表达水平检测方法。用于白血病辅助诊断及mrd监测的检测方法，主要包括红细胞裂解液；trizol；氯仿；异丙醇；无水乙醇；takara逆转录试剂盒及tbgreen试剂。

本发明一个方面提供了一种检测eps8基因的引物和探针组合物，其包括如下所述的序列：

eps8-f：tcactgcaacaaagcaacaatgseqidno.1

eps8-r：gccctgaatgacagacaccatseqidno.2

eps8-probe：fam-ttgtccatgattcaaaatctaagc-bhq-plusseqidno.3

本发明另一方面提供了一种检测eps8基因相对表达量的引物和探针组合物，其包括如下所述的序列：eps8-f：tcactgcaacaaagcaacaatgseqidno.1

eps8-r：gccctgaatgacagacaccatseqidno.2

eps8-probe：fam-ttgtccatgattcaaaatctaagc-bhq-plusseqidno.3

abl-f：gtgagtgacatagcctcatgttcseqidno.4

abl-r：gcaggcgtgctctgtgaaatseqidno.5

abl-probe：quasar670-tcagggagggttaggaaaaccac-bhq-plusseqidno.6。

本发明另一个方面提供了检测eps8基因相对表达量的试剂盒，其包括前述的检测eps8基因相对表达量的引物和探针组合物。

在本发明的技术方案中，所述的试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。

在本发明的技术方案中，所述的试剂盒中还包括红细胞裂解液、trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、水、takara逆转录试剂。

本发明另一个方面提供了所述的试剂盒或检测eps8基因相对表达量的引物和探针组合物在制备检测肿瘤的试剂或工具中的用途。

在本发明的技术方案中，所述的肿瘤优选为宫颈癌、胰腺癌、甲状腺乳头状癌、乳腺癌、肠癌、头颈部鳞状细胞癌、口腔鳞状细胞癌、恶性血液肿瘤。

本发明提供了一种检测eps8基因相对表达量的引物和探针组合物，包括：扩增覆盖eps8基因的上下游引物eps8-f、eps8-r和探针eps8-probe，检测内参基因abl用引物abl-f、abl-r和探针abl-probe；其碱基序列为：

eps8-f：tcactgcaacaaagcaacaatgseqidno.1

eps8-r：gccctgaatgacagacaccatseqidno.2

eps8-probe：fam-ttgtccatgattcaaaatctaagc-bhq-plusseqidno.3

abl-f：gtgagtgacatagcctcatgttcseqidno.4

abl-r：gcaggcgtgctctgtgaaatseqidno.5

abl-probe：quasar670-tcagggagggttaggaaaaccac-bhq-plusseqidno.6

本发明还提供了一种检测eps8基因相对表达量的方法，其步骤如下：

(1)提取血液中总rna；

(2)将rna逆转录为cdna；

(3)利用检测eps8基因相对表达量的引物和探针组合物对步骤(2)的cdna分别进行扩增；

其中检测eps8基因的引物和探针，分别为：

eps8-f：tcactgcaacaaagcaacaatgseqidno.1

eps8-r：gccctgaatgacagacaccatseqidno.2

eps8-probe：fam-ttgtccatgattcaaaatctaagc-bhq-plusseqidno.3

检测abl内参基因的引物和探针，分别为：

abl-f：gtgagtgacatagcctcatgttcseqidno.4

abl-r：gcaggcgtgctctgtgaaatseqidno.5

abl–probe：quasar670-tcagggagggttaggaaaaccac-bhq-plusseqidno.6

同时，还包括阳性对照品的扩增和阴性对照品的扩增。

本发明还提供了一种检测eps8基因相对表达量的试剂盒，包括pcr反应液，其特征在于，所述pcr反应液包括eps8基因扩增的上、下游引物eps8-f、eps8-r和探针eps8-probe，检测内参基因abl用引物abl-f、abl-r和探针abl-probe；

其中检测eps8基因的引物和探针，分别为：

eps8-f：tcactgcaacaaagcaacaatgseqidno.1

eps8-r：gccctgaatgacagacaccatseqidno.2

eps8-probe：fam-ttgtccatgattcaaaatctaagc-bhq-plusseqidno.3

检测abl内参基因的引物和探针，分别为：

abl-f：gtgagtgacatagcctcatgttcseqidno.4

abl-r：gcaggcgtgctctgtgaaatseqidno.5

abl–probe：quasar670-tcagggagggttaggaaaaccac-bhq-plusseqidno.6

进一步的还包括红细胞裂解液、trizol、氯仿、异丙醇、无水乙醇、depc水等试剂、takara逆转录试剂、阳性对照品和阴性对照品。

有益效果

试剂盒将qrt-pcr技术结合taqman探针，利用双标准曲线的方法，分别构建目的基因eps8和内参基因abl的定量标准曲线，检测受测者骨髓eps8的相对于内参基因abl的表达水平。与现如今流行的δδct法相比，该试剂盒及检测方法具有结果精确度高等优点。此外，本试剂盒已将反应体系所需的引物及探针浓度和比例进行合理优化，促使实验条件达到最佳，从而节省大量摸索条件的时间，提升实验效率。本发明检测试剂盒使用方便，操作快速，灵敏度高，特异性好。该试剂盒有利于白血病的早期诊断及微小残留病灶(mrd)的监测，有助于早期干预治疗、完善治疗方案、评估疗效及监测疾病复发。

附图说明

图1是eps8基因标准曲线图；

图2是abl基因标准曲线图；

图3是健康人骨髓标本的检测结果图；

图4是白血病患者骨髓标本的检测结果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。

实施例1试剂盒的制备

主要包括以下试剂：红细胞裂解液、trizol；氯仿；异丙醇；无水乙醇；

检测体系pcr反应液：takaraqpcrmix，检测目的基因eps8的上下游引物eps8-f、eps8-r和探针eps8-probe，检测内参基因abl用引物abl-f、abl-r和探针abl-probe，阳性对照品和阴性对照品。

其中检测eps8基因的引物和探针，分别为：

eps8-f：tcactgcaacaaagcaacaatg

eps8-r：gccctgaatgacagacaccat

eps8-probe：fam-ttgtccatgattcaaaatctaagc-bhq-plus

检测abl内参基因的引物和探针，分别为：

abl-f：gtgagtgacatagcctcatgttc

abl-r：gcaggcgtgctctgtgaaat

abl–probe：quasar670-tcagggagggttaggaaaaccac-bhq-plus

阳性对照品：含eps8基因组的溶液；

阴性对照品：不含eps8基因组的溶液。

实施例2本发明方法的操作流程

(1)提取骨髓中总rna：在洁净的15ml离心管中加入8ml红细胞裂解液，取抗凝骨髓样品2ml加入并混匀。4℃静置10min后1500rpm离心5min，丢弃上清并再次向细胞沉淀中加入红细胞裂解液裂解红细胞，重复此操作直至红细胞裂解完全；向所得细胞中加入1mltrizol并反复吹打直至沉淀完全溶解，将所得液体转移至洁净的1.5mlep管中。室温静置10min后加入0.2ml氯仿，充分震荡混匀，4℃静置10min后12000rpm离心15min；轻取上清至另一新的ep管中并加入等体积的异丙醇，充分混匀后4℃静置10min，12000rpm离心10min；弃上清，加入1ml75％乙醇洗涤沉淀，7500rpm离心10min，弃上清；室温干燥5-10min，加入20μldepc水充分溶解沉淀。

(2)参考takara公司的primescripttmrtreagentkitwithgdnaeraser试剂盒说明书，将rna逆转录为cdna。

(3)试剂配置：按检测人份数配置检测体系pcr反应液各xμl，每人份18μl分装：

x＝18μl反应液×(4份目的基因(标准曲线)+4份内参(标准曲线)+n份标本+1份阳性对照品+1份阴性对照品)；

(4)加样：pcr反应液中加入2μlcdna；阳性对照和阴性对照直接加2μl阳性对照品和阴性对照品；空白对照加2μldepc水；

(5)检测：使用实时荧光定量pcr仪检测，可用仪器包括bio-radcfx96manager等。反应条件：95℃预变性30s；95℃5s，55℃30s，72℃30s40个循环，荧光信号于72℃30s时采集。

结果判断：将阈值线调整至背景信号及阴性扩增线以上，系统根据标准曲线和ct值自动计算出拷贝数。

内参阳性时，检测结果才有效。当内参ct<36为结果可信；36≤ct≤38，需要重新检测；ct>38为检测结果有误，不可信。

实施例3eps8基因标准曲线的建立

以eps8质粒浓度为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴拷贝/μl作为模板进行实验，每个浓度重复3次，建立eps8基因检测的标准曲线，结果如图1所示；

实施例4abl基因标准曲线的建立

以abl质粒浓度为10⁷、10⁶、10⁵、10⁴拷贝/μl作为模板进行实验，每个浓度重复3次，建立abl基因检测的标准曲线，结果如图2所示；

实施例5采用本发明所述检测方法检测健康人群标本

取待测健康样品10例，按实施例2所述方法提取总rna、配制试剂并检测。

每份样品各取2μl加入检测体系pcr反应液中，同时做阳性、阴性对照。每份样品重复3次，一份阳性对照和一份阴性对照。结果如表1所示，eps8与abl的拷贝数比值均小于0.12。样品1的检测结果图见图3。

表110例健康样本eps8基因表达水平

实施例6采用本发明所述检测方法检测白血病临床标本

取待检测白血病临床样本10例，按实施例2所述方法提取总rna、配制试剂并检测。

每份样品各取2μl加入检测体系pcr反应液中，同时做阳性、阴性对照。每份样品重复3次，一份阳性对照和一份阴性对照。实验结果如下表2所示，eps8与abl的拷贝数比值均大于0.14。样品1的检测结果见图4。

表210例临床样本eps8基因表达水平

sequencelisting

<110>南方医科大学

<120>一种检测eps8基因表达水平的试剂盒

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