一种与辣椒细胞核雄性不育基因msc-2共分离的基因分子标记及其应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种与辣椒细胞核雄性不育基因msc-2共分离的基因分子标记及其应用。

背景技术：

辣椒(capsicumannuuml.)为茄科(solanaceae)辣椒属草本植物，别名番椒、海椒、辣茄、辣子等，是我国人民喜食、栽培面积最大的蔬菜种类之一。据统计，全球的辣椒种植面积已过5000万亩，年产量3700万吨，是世界上最大的调味料作物。我国辣椒种植面积超过2400万亩，占世界辣椒面积的35％以上，占全国蔬菜面积的10％左右，仅次于白菜的种植面积，辣椒的经济总产值超过700亿元，产值和效益位居蔬菜作物之首(中国蔬菜流通协会，2017)。辣椒杂种优势非常明显，目前，国内外推广的辣椒品种绝大多数为杂种一代，而雄性不育的利用可以显著地降低种子成本，且易于保证杂种的纯度，也有利于保护知识产权，所以，雄性不育的研究对辣椒杂种优势的利用具有重要的理论和实际意义。

辣椒上同时存在细胞核不育型(genicmalesterility，gms)和核质互作不育型(细胞质不育，cytoplasmicmalesterility，cms)。cms的育性由细胞质和细胞核基因共同控制，可以育成100％不育的雄性不育系，杂种种子生产时利用较方便，但父本的恢复基因主要分布在小果型辣椒中(沈火林等，1994)，大果型辣椒中恢复系较难找到，选育优良的杂交品种较困难，而且雄性不育常不稳定，影响杂种的纯度。辣椒gms的育性仅受细胞核基因控制，不受细胞质影响，目前报道利用的大多为1对隐性核基因控制，普通的自交系均能使杂种的育性全部恢复，育种中父本来源广泛，便于育成优良的杂交品种，且不育性稳定，生产种子时易于保证杂种的纯度，gms比cms应用前景更广阔。

迄今为止，世界各国学者已发现的辣椒细胞核雄性不育基因近20个(ms1--ms15,msk,msc-1，msc-2)，其中msc-1和msc-2是由国内学者发现并利用的不育基因，但是这些基因之间的关系、基因是否相同等均不清楚。目前仅有ms1和msc-1育性控制基因被克隆出来，在连锁标记开发方面，国内外研究者对5个ms基因(ms1、ms3、ms8、ms10、msc-1)进行了定位或开发了连锁标记。除了msc-1开发了一个基因标记之外，其余与ms基因连锁的分子标记要么连锁距离较远要么标记使用成本较高，在适用性上还有待提高。因此如果能够开发与ms基因连锁距离更近使用成本较低的分子标记，可以提高辣椒细胞核雄性不育在育种当中的利用效率，降低育种制种成本。

技术实现要素：

本发明的一个目的是提供检测辣椒育性的引物。

本发明提供的引物，为能扩增特异片段的引物对；

所述特异片段包括引物f和引物r组成的引物对的靶序列；

所述引物f为如下a1)或a2)：

a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；

a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；

所述引物r为如下a3)或a4)：

a3)序列表的序列2所示的单链dna分子；

a4)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子。

上述引物由所述引物f和所述引物r组成。

含有上述引物的pcr试剂或试剂盒也是本发明保护的范围。

上述试剂盒还包括bsmai酶。

上述引物、或、上述试剂盒的应用，为如下b1)-b7)中的任一种：

b1)鉴定待测辣椒携带等位基因a和/或等位基因a；

b2)辅助筛选携带所述等位基因a且不携带所述等位基因a的辣椒品种；

b3)辅助筛选携带所述等位基因a且不携带所述等位基因a的辣椒品种；

b4)辅助筛选携带所述等位基因a且携带所述等位基因a的辣椒品种；

b5)辅助鉴定待测辣椒是否细胞核雄性可育；

b6)辅助筛选或选育细胞核雄性不育的辣椒品种；

b7)辅助筛选或选育细胞核雄性可育的辣椒品种；

所述等位基因a为如下c1)或c2)或c3)：

c1)序列表中序列3所示的dna分子；

c2)在严格条件下与c1)限定的dna序列杂交且具有相同功能的dna分子；

c3)与c1)限定的dna序列具有90％以上同源性且具有相同功能的dna分子；

所述等位基因a为如下d1)或d2)或d3)：

d1)序列表中序列4所示的dna分子；

d2)在严格条件下与d1)限定的dna序列杂交且具有相同功能的dna分子；

d3)与d1)限定的dna序列具有90％以上同源性且具有相同功能的dna分子。

上述等位基因a和/或等位基因a也是本发明保护的范围；

上述等位基因a和/或所述等位基因a的应用，为如下b5)-b7)中的任一种：

b5)辅助鉴定待测辣椒是否细胞核雄性可育；

b6)辅助筛选细胞核雄性不育的辣椒品种；

b7)辅助筛选细胞核雄性可育的辣椒品种。

上述应用为，若仅含有等位基因a且不含有等位基因a或含有等位基因a和a，则为可育，若仅含有等位基因a且不含有等位基因a，则为不育。

本发明另一个目的是提供一种检测待测辣椒是否细胞核雄性可育的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：检测待测辣椒的基因型为msc-2msc-2、msc-2msc-2还是msc-2msc-2，

基因型为msc-2msc-2或msc-2msc-2的辣椒细胞核雄性可育，基因型为msc-2msc-2的辣椒细胞核雄性不育；

所述基因型msc-2msc-2为待测辣椒含有上述等位基因a且不含有所述等位基因a；

所述基因型msc-2msc-2为待测辣椒含有上述等位基因a和所述等位基因a；

所述基因型msc-2msc-2为待测辣椒含有上述等位基因a且不含有所述等位基因a。

上述检测待测辣椒的基因型为msc-2msc-2、msc-2msc-2还是msc-2msc-2的方法包括如下步骤a：

1)用上述引物对待测辣椒进行pcr扩增，得到扩增产物；

2)bsmai酶酶切所述扩增产物，检测酶切产物，

若酶切产物中仅含有大小为218bp(序列5)的片段，则待测辣椒基因型为msc-2msc-2；

若酶切产物中含有大小为218bp和186bp(序列6)的片段，则待测辣椒基因型为msc-2msc-2；

若酶切产物中仅含有186bp的片段，且不含有218bp的片段，则待测辣椒基因型为msc-2msc-2。

本发明还提供了一种检测检测待测辣椒的基因型的方法，为权利要求9所述方法中的步骤a。

上述中，待测辣椒的基因型为待测辣椒msc-2基因的基因型。

本发明的实验证明,可以利用本发明中开发的标记在苗期快速鉴定出可育株，从而省去在育种当中利用人工去拔除可育株，可以节省大量的人力和物力，对提高辣椒雄性不育的育种效率，降低育种制种成本，促进辣椒杂种优势的利用具有重要的理论和应用价值。

附图说明

图1为d-caps-msc-2在可育和不育池的扩增结果。

图2为41份已知基因型材料对d-caps-msc-2的验证。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

辣椒细胞核雄性不育f2群体17c772为将“冀研16号”的杂交种子自交，得到的群体。其中，“冀研16号”记载在如下文献中：保护地甜椒品种“冀研16号”栽培技术[j].现代农村科技,2015(2):80-80。

辣椒雄性不育两用系群体18q5430构建方法如下：(1)“冀研16号”为杂种一代，自交得到f2代，并出现育性分离，在f2代中以不育株做母本，可育株做父本，做多对株间杂交。(2)播种株间杂交组合，会有两种情况，一种群体全部可育，一种群体会出现1：1的育性分离；以育性出现分离的杂交组合中的不育株做母本，性状相似的可育株做父本进行株间杂交，后代群体育性始终保持1：1的分离比。(3)经5代以上同群体不育株和可育株株间杂交，群体主要农艺性状基本稳定，不育和可育比保持1：1，即育成了新的雄性不育两用系，编号为18q5430。

实施例1、分子标记d-caps-msc-2的获得

一、分子标记d-caps-msc-2的开发

1、定位群体的构建

本试验以辣椒细胞核雄性不育f2群体17c772以及一个雄性不育两用系群体18q5430为试验材料，获得一个包含89个单株辣椒细胞核雄性不育f2群体17c772和一个包含1034个单株的雄性不育两用系群体18q5430，单株统计花粉育性。

2、分子标记开发

(1)取辣椒细胞核雄性不育f2群体17c772的可育单株，混池，得到可育池。每个可育池的单株数为30株。

(2)取辣椒细胞核雄性不育f2群体17c772的不育单株，混池，得到不育池。每个不育池的单株数为25株。

(3)将可育池和不育池进行简化重测序。

利用可育池和不育池的重测序结果定位候选基因。

利用f2群体中可育池和不育池简化重测序结果所定位到的候选基因，克隆候选基因表明不育材料同可育材料相比候选基因在第二个外显子上有一个碱基的缺失.

可育材料中候选基因命名为等位基因a(msc-2)，其核苷酸序列为序列3；

不育材料中候选基因命名为等位基因a(msc-2)，其核苷酸序列为序列4，为将序列3第535位t缺失得到的序列。

基于该候选基因的等位变异形式，将辣椒细胞核雄性不育的f2群体分为如下基因型：基因型msc-2msc-2(等位基因a纯合)、基因型msc-2msc-2(等位基因a和等位基因a杂合)和基因型msc-2msc-2(等位基因a纯合)。

(4)基于该候选基因的等位变异形式，开发分子标记d-caps-msc-2。

标记d-caps-msc-2的引物序列如下所示：

d-caps-msc-2f：ttgtatcaatggctcattggagattgcgtct(序列1)；

d-caps-msc-2r：aactccctccctggctacaaatatgtcc(序列2)。

4、遗传连锁分析

利用筛选所得的多态性分子标记d-caps-msc-2分析18q5430群体的1034个单株以及辣椒细胞核雄性不育f2群体17c772的基因型，并结合群体的田间育性表型鉴定结果，结果表明：分子标记d-caps-msc-2与不育基因共分离，为一个基因标记。

二、分子标记d-caps-msc-2鉴定待测辣椒育性的方法建立

1、提取待测辣椒的基因组dna

提取待测辣椒的基因组dna。

2、pcr扩增和酶切

采用待测辣椒的基因组dna为模板，用标记d-caps-msc-2的引物进行pcr扩增。收集扩增产物。

上述pcr扩增的反应体系(10μl)为：dna1μl、10×buffer缓冲液(takara公司的产品rr001a)5μl、dntps0.4μl、dna聚合酶(takara公司的产品rr001a)0.2μl、d-caps-msc-2f引物和d-caps-msc-2r引物各0.5μl(10um/l)，用2.4μlddh2o将总体积补齐至20μl。

pcr扩增反应程序：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min。

向上述扩增产物中加入bsmai酶0.1μl，cutsmart1μl(neb公司产品#r0529v)，之后55度酶切3h。

将上述酶切产物用7％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，硝酸银染色后观察照相。并对酶切产物进行测序。

结果如下：

若酶切产物中只含有大小为218bp(序列5)的片段，则所述待测辣椒基因型为msc-2msc-2(等位基因a纯合)，所述待测辣椒为纯合可育；

若酶切产物中含有大小为218bp和186bp(序列6)的片段，则所述待测辣椒基因型为msc-2msc-2(等位基因aa杂合型)，所述待测辣椒为杂合可育；

若酶切产物中仅含有186bp的片段，且不含有218bp的片段，则待测辣椒基因型为msc-2msc-2(等位基因a纯合型)，所述待测辣椒为纯合不育。

待测辣椒为可育池或不育池时，实验结果见图1(m为dnamarker，f为可育池，s为不育池)。结果表明，分子标记d-caps-msc-2在两池间具有稳定的多态性，且分子标记d-caps-msc-2在可育池检测产物含有大小为218和186bp的片段，在不育池dna检测产物仅含有大小为186bp的片段，检测条带清晰，在两池间差异明显。可育池的基因型为基因型msc-2msc-2，不育池的基因型为基因型msc-2msc-2。

实施例2、分子标记d-caps-msc-2的应用

1、提取基因组dna

提取表1所示的41份已知基因型(msc-2msc-2)的辣椒纯合自交系或品种(均为可育)的基因组dna。

表1为41份辣椒自交系和品种

2、pcr扩增及酶切

采用实施例1的方法进行pcr扩增及酶切，检测酶切产物。

若酶切产物中仅含有大小为218bp的片段，则所述待测辣椒基因型为msc-2msc-2(纯合型)，所述待测辣椒为纯合可育；

若酶切产物中含有大小为218bp和186bp的片段，则所述待测辣椒基因型为msc-2msc-2(杂合型)，所述待测辣椒为杂合可育；

若酶切产物中仅含有186bp的片段，且不含有218bp的片段，则待测辣椒基因型为msc-2msc-2，所述待测辣椒为纯合不育。

41份已知基因型(msc-2msc-2)的辣椒纯合自交系或品种的基因型检测结果如表1和图2(f：可育池；s：不育池，后面依次为41份自交系材料)所示，可以看出，41份自交系材料的基因型均为msc-2msc-2，均为可育，这与已知的基因型和育性相同，证明用d-caps-msc-2标记验证的成功率为100％；表明这个标记的适用性很强，育种实际应用中可以利用此记对育性进行快速鉴定。

序列表

<110>中国农业大学

<120>一种与辣椒细胞核雄性不育基因msc-2共分离的基因分子标记及其应用

<160>6

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>31

<212>dna

<213>人工序列

<400>1

ttgtatcaatggctcattggagattgcgtct31

<210>2

<211>28

<212>dna

<213>人工序列

<400>2

aactccctccctggctacaaatatgtcc28

<210>3

<211>2007

<212>dna

<213>人工序列

<400>3

atggtgaaggagatgaaggagatgccgactttagatctaagcggatcgaaaaaaaggaag60

aggaatataaatgagaaggtgtttaagttcaagaattttggtgaacaagggtttcctata120

gagtttatagggtgcaattttgagcaaaatgttaagcttcttttggaatttgcacaacaa180

gaaaatgttagtatttggtcatttcagctagaagttcatagacatccaccaatgcatgtg240

gttctctttgttgttgaagaacaagttgagttgtccctcaatcccaattgcaagcattgt300

caatatataggctggggcaaccatctaatgtgcaacaagaagtaccatttcatgttgccc360

acaaaggacacaattgcagcttgtgtagagggaggcctaaaaaacaatattggtggagaa420

aatagaagtaagttgaatttgatagaaatagagggtcatatgatgcatggtgtgtttcac480

tctaatggttttgggcatttgctttgtatcaatggctcattggagattgcttcttctgac540

ttgcctggccactctatcatggacttttgggatcgcctttgcattggacttggtgcaagg600

aaagtgagcttaagagatgtctcaacaaagaaaggcatggatctcaggctactcaacaca660

gtagcctatggtgagccatggtttgggcgatggggttacaaatttggccgtggaagcttt720

ggtgtaactcaagaaacataccaaagtgcaatcaatgccatacaaaacatgccattagcc780

ttattggcacatcatgtaggggtcataaatattaatgagatattaacggtgttatcgagg840

taccaaatgttatctggtcattcattagtcacactttgtgatgccattcatttcatgttg900

gagctcaaatcgaggattccgaaggaaagtaaccttacctcatgttatccggggttattg960

gttgacaccacttgtaggtggtcacctaaacgcgttgagatggctattagggttgttgtg1020

gaagccctaaaaagggccgagtcacgttgggtgtctaggcaagaggttcgtgatgctgcg1080

cgtgcctatattggtgatacagggctcctagatttcgtgcttaagtcattgggaaatcat1140

attgttggaaagtacttggttcgtcgatgcttaaatccagtgaccaaagttttggaatac1200

tgtttagaggacatatctaaagcatttcctaaacaagatcaaggttttagggttaatgac1260

tcaaaagggaaacaacaatacaaaatcacatgggtacaacttatgaaggacatatacttc1320

ttgtacaagaatattttaaaagaggacaagggattaatgtccaattatacgggcgtctta1380

gctacaattccagcagcttctagaataatcctagacacgaagtacttcctcaaagaatac1440

aaagggatagaggcggattcaagaattgaagtagacaaatccaagatttactgtgcgatt1500

atgttggcaaccaaggatggatttggagtagaagaaaaagtaatgaccccatttgagtgc1560

ttcacattaagaaaagatgtcacatttgatgagctcaaaattgaagtggaaaaaactttt1620

ggggctatttatcggggactaaggaactttgctacaagatcaattaacaatttgatgagc1680

ccgattaatggatcagaattggtttttaatgttatgaaaccagggagcaaagttgtccta1740

ggaggggtgataatgtcaattgatcatcatcataataataacaatattaatggagggata1800

tttgaaggaattaagaataatattattgtggattgtctttgtgggactaaagatgaagaa1860

gatggagaaaggatggtttcatgtgatatttgtgaagtttggcagcacactagatgtgtt1920

aatatcccaaatcatgaagaaattccagacatatttctttgtaataagtgtgagcaagat1980

attttacaatttccttcattaccttag2007

<210>4

<211>2006

<212>dna

<213>人工序列

<400>4

atggtgaaggagatgaaggagatgtcgactttagatctaagcggatcgaaaaaaaggaag60

aggaatataaatgagaaggtgtttaagttcaagaattttggtgaacaagggtttcctata120

gagtttatagggtgcaattttgagcaaaatgttaagcttcttttggaatttgcacaacaa180

gaaaatgttagtatttggtcatttcagctagaagttcatagacatccaccaatgcatgtg240

gttctctttgttgttgaagaacaagttgagttgtccctcaatcccaattgcaagcattgt300

caatatataggctggggcaaccatctaatgtgcaacaagaagtaccatttcatgttgccc360

acaaaggacacaattgcagcttgtgtagagggaggcctaaaaaacaatattggtggagaa420

aatagaagtaagttgaatttgatagaaatagagggtcatatgatgcatggtgtgtttcac480

tctaatggttttgggcatttgctttgtatcaatggctcattggagattgcttctctgact540

tgcctggtcactctatcatggacttttgggatcgcctttgcattggacttggtgcaagga600

aagtgagcttaagagatgtctcaacaaagaaaggcatggatctaaggctactcaacacag660

tagcctatggtgagccatggtttgggcgatggggttacaaatttggccgtggaagctttg720

gtgtaactcaagaaacataccaaagtgcaatcaatgccatacaaaacatgccattagcct780

tattggcacatcatgtaggggtcataaatattaatgagatattaacggtgttatcgaggt840

accaaatgttatctggtcattcattagtcacactttgtgatgccattcatttcatgttgg900

agctcaaatcgaggattccgaaggaaagtaaccttacctcatgttatccggggttattgg960

ttgacaccacttgtaggtggtcacctaaacgcgttgagatggctattagggttgttgtgg1020

aagccctaaaaagggccgagtcacgttgggtgtctaggcaagaggttcgtgatgctgctc1080

gtgcctatattggtgatacagggctcctagatttcgtgcttaagtcattgggaaatcata1140

ttgttggaaagtacttggttcgtcgatgcttaaatccagtgaccaaagttttggaatact1200

gtttagaggacatatctaaagcatttcctaaacaagatcaaggttttagggttaatgact1260

caaaagggaaacaacaatacaaaatcacatgggtacaacttatgaaggacatatacttct1320

tgtacaagaatattttaaaagaggacaagggattaatgtccaattatacgggcgtcttag1380

ctacaattccagcagcttctagaataatcctagacacgaagtacttcctcaaagaataca1440

aagggatagaggcggattcaagaattgaagtagacaaatccaagatttactgcgcgatta1500

tgttggcaaccaaggatggatttggagtagaagaaaaagtaatgaccccatttgagtgct1560

tcacattaagaaaagatgtcacatttgatgagctcaaaattgaagtggaaaaaacttttg1620

gggctatttatcggggactaaggaactttgctacaagatcaattaacaatttgatgagcc1680

cgattactggatcagaattggtttttaatgttatgaaaccagggagcaaagttgtcctag1740

gaggggtgataatgtcaattgatcatcatcataataataacaatattaatggagggatat1800

ttgaaggaattaagaataatattattgtggattgtctttgtgggactaaagatgaagaag1860

atggagaaaggatggtttcatgtgatatttgtgaagtttggcagcacactagatgtgtta1920

atatcccaaatcatgaagaaattccagacatatttctttgtaataagtgtgagcaagata1980

ttttacaatttccttcattaccttag2006

<210>5

<211>218

<212>dna

<213>人工序列

<400>5

ttgtatcaatggctcattggagattgcttcttctgacttgcctggtcactctatcatgga60

cttttgggatcgcctttgcattggacttggtgcaaggtttgttattctcttcatttcatt120

ttaacttatgtcacaatgtttaaagtttgacaaacaaagaattttaaaatttatggtctt180

acacttgttgggacatatttgtagccagggagggagtt218

<210>6

<211>186

<212>dna

<213>人工序列

<400>6

ctgacttgcctggtcactctatcatggacttttgggatcgcctttgcattggacttggtg60

caaggtttgttattctcttcatttcattttaacttatgtcacaatgtttaaagtttgaca120

aacaaagaattttaaaatttatggtcttacacttgttgggacatatttgtagccagggag180

ggagtt186