专利名称：利用体细胞核转移胚胎作为细胞供体进行附加核转移的方法和系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用体细胞核转移方法产生的胚胎细胞作为供体进行第二轮核转移来产生转基因动物(“再克隆”)的改良方法，特别是非人哺乳动物。更具体地，本发明提供了再克隆以提高转基因动物的转基因表达和表达水平的改良方法。
背景技术：
本发明主要涉及体细胞核转移(SCNT)领域以及目的转基因动物的建立。更加具体地，它涉及产生体细胞来源的细胞系、转化这些细胞系、并利用这些转化细胞通过一轮以上的核转移来产生转基因非人哺乳动物种类的方法。
长久以来人们一直期望具有一定所需的特性或性质，例如增加的体重、奶量、产奶体积、哺乳间隔期以及疾病抵抗力的动物。传统的饲养方法能够生产具有一些特定所需特性的动物，但通常这些特性伴随着一些不需要的性质、耗时、昂贵而不可靠。而且，这些方法根本不能使特定的动物系生产基因产品，例如所需的蛋白治疗剂，从目标物种的遗传补足物中完全缺失(如，牛乳中的蛛丝蛋白)。
能够产生转基因动物的技术的建立，提供了一种生产由基因改造携带特定特性或被设计表达某些蛋白或其它分子化合物的转基因动物的异常精确的方法。即，转基因动物为携带发育早期慎重地导入体细胞和/或生殖细胞的基因的动物。随着动物的发育和生长，由基因工程引入动物的蛋白产品或特定的发育改变就显现出来。
目前能获得的产生转基因家畜动物的技术效率低且耗时，通常产生极低比例的存活胚胎。在转基因的建立过程中，DNA序列通常随机插入，可能导致一系列的问题。首要问题为插入失活，它是由于编码或调控序列被引入的DNA中断而导致必需基因的失活。另一问题为转基因可能根本不整合，或整合但不表达。另一个问题为由于位置效应导致不精确调控的可能性，这指基因表达水平的可变性和用同一转基因构建体生产的不同建立者(founder)动物之间的基因调控的精确性。因此，产生大量的建立者(founder)动物且经常确定其中少于5％以保障转基因系维持的方式表达转基因并非罕见。
另外，产生转基因家畜动物的效率较低，产生的100个后代中只有一个转基因动物的效率并非罕见(Wall，1997)。结果产生转基因动物的花费可以高达每只表达动物25-50万美元(Wall，1997)。
现有技术方法已经典型地在克隆程序中应用胚胎细胞类型。这包括Campbell等人(Nature，1996)以及Stice等人(Biol.Reprod.1996)的工作。在这些研究中，胚胎细胞系均来自少于10天妊娠的胚胎。在这两项研究中，细胞都在饲喂层上维持，防止用于克隆步骤的供体细胞的明显分化。本发明采用分化细胞。我们认为胚胎细胞类型也可能与从分化供体核起始的克隆胚胎一起用于本发明的方法。
因此，根据本发明，包括羊的哺乳动物的高级基因型的增殖是可能的。这将允许具有被证明的遗传优越性或其它所需特性的成年动物的繁殖。在例如包括山羊、啮齿动物、牛和兔的许多重要哺乳动物物种中的进步将加速。通过本发明，可能几十亿胎儿或成年细胞可以被收获并用于克隆程序。这将潜在地在短时期内产生许多同样的后代。
因此，尽管已经用多种方法在几个不同物种生产了转基因动物，仍然缺乏以合理的成本容易地和可重复地生产能够大量表达目的蛋白或展示转基因的插入所导致的遗传改变的转基因动物的方法。而且，根据本发明，在第一轮克隆中运用体外成熟的卵母细胞，产生2-，4-，8-，16-，32-细胞、桑椹胚和胚泡，并运用这些卵裂球作为供体细胞用体内成熟的卵母细胞再克隆，可节省费用，因为体外成熟的卵母细胞可能比体内产生的卵母细胞便宜。
相应地，存在对使建立转基因动物的生产效率提高的改良核转移方法的需要，特别是关于通过采用一轮以上的核转移，建立稳定表达目的转基因的转基因动物的活化。
发明简述简要地说，本发明提供了通过连续的核转移过程克隆非人哺乳动物的方法，包括获得所需的分化哺乳动物细胞用作供体核的来源；从与供体核来源的细胞相同物种的哺乳动物得到至少一个卵母细胞；使该至少一个卵母细胞去核；将所需的分化细胞或细胞核转移到去核的卵母细胞；同时融合和活化细胞偶联体(couplet)以形成第一转基因胚胎，并使其成熟为至少两细胞的阶段；接着采用第一转基因胚胎的至少一个细胞作为供体细胞进行至少另一轮的核转移；培养活化的第二轮胚胎，接着利用产生的细胞或最终将第二转基因胚胎转移到合适的宿主哺乳动物中，因此胚胎发育为胎儿。典型地，上述方法通过利用在所述的分化的哺乳动物细胞或细胞核插入所述的去核的卵母细胞之前插入、去除或改变目的基因的供体细胞核而完成。还应该注意的是采用的卵母细胞优选为在去核之前在体外成熟的事实，但根据本发明也可以在体内成熟。
还需指出的是本申请也可以用于提高CICM细胞、胎儿或后代的实用性，例如，可以用于细胞、组织和器官移植。通过从动物中取出胎儿或成年细胞并用于克隆过程，当克隆胎儿经过器官形成而进行发育时可从中获得一系列的细胞、组织和可能的器官。也可以从克隆后代中分离细胞、组织和器官。该方法可为多种医学和兽医学治疗，包括细胞和基因治疗提供了“材料”的来源。如果细胞被转移回细胞来源的动物，那么就避免了免疫排斥。因为许多细胞类型可以从这些克隆中分离，用其它的方法学，例如造血嵌合状态可以避免同一物种以及不同物种动物之间的免疫排斥。
在优选的实施方案中，本发明的方法将通过改良供体细胞的重新编程(reprogramming)而提高核转移的效率，并因此提高能够在早期从单个胚胎产生的胚胎的数目。
在本发明的另一实施方案中，成熟卵母细胞可以在体外操作，以限制利用来自来源动物的体内卵母细胞的费用，因此提高了与同时利用接受者和体外供体细胞相比的效率。
本发明方法的另一有益效果为，与从单轮NT的后代相比，通过这些方法的实践，细胞的重新编程(reprogramming)将提高得到的体细胞NT后代的健康状况。
本发明的另一有益效果是通过利用早期的核转移胚胎细胞作为供体细胞来产生第二代的胚胎，第二代胚胎的重新编程(reprogramming)将被增强。
在本发明的具体实施方案中，动物为转基因动物，供体核被遗传修饰。供体核可以含有一个或多个转基因，且该遗传修饰可以在核转和胚胎重新构成前发生。
优选实施方式说明下列缩写词在说明书中具有指定的意义缩略词表体细胞核转移(SCNT)培养的内细胞团细胞(CICM)核转移(NT)合成的输卵管液(SOF)胎牛血清(FBS)聚合酶链反应(PCR)牛血清白蛋白(BSA)术语解释胚泡-有胎盘哺乳动物的植入子宫前的大约30-150细胞的胚胎(小鼠受精后大约3天，人受精后大约5天)。胚泡期在桑椹胚期之后，可以通过它独特的形态学进行区分。胚泡包括由细胞层(滋养外胚层)、充满液体的腔(囊胚腔或胚泡腔)和内部的细胞簇(内细胞团或ICM)组成的球体。ICM由未分化细胞组成，如果胚泡植入子宫，它提供将变为胎儿的物质。这些同样的ICM细胞，如果在培养基中生长，可以产生胚胎干细胞系。在植入时，小鼠胚泡由大约70个滋养层细胞和30个ICM细胞组成。
囊胚-用于形容胚胎发育的早期阶段的术语，由中空的细胞球密封被称为囊胚腔的充满液体的空腔组成。术语囊胚有时可与胚泡互换使用。
羊-不同种类山羊的或与之相关的事物。
细胞偶联体-融合和/或活化之前的去核的卵母细胞和体细胞或胎的细胞核。
卵裂型-极早期胚胎分裂中的细胞的分裂模式；每一物种的生物体表现出可以在显微镜下观察到的典型的卵裂型。背离了典型的模式通常预示该胚胎是异常的，因此卵裂型被用作胚胎植入子宫前的筛选标准。
克隆-1)一种DNA分子、细胞、组织、器官或整个植物或动物的精确复制品。2)与另一生物体具有相同的核基因组的生物体。
胚胎分裂-早期胚胎分离为具有同样遗传组成的两个或多个胚胎，是产生同样的双胞胎或更多的个体(三胞胎、四胞胎等)所必需的。
胚胎干(ES)细胞-来自胚胎的原始(未分化)的培养细胞，具有变成多种特定细胞类型的潜力(即，是多能性的)。它们起源于胚泡的内细胞团。胚胎干细胞并非胚胎；它们无法自己以有组织的形式产生需要的细胞类型，例如滋养外胚层细胞，从而产生一个完全的生物体。
胚胎干(ES)细胞系-从胚胎干细胞建立并在实验室培养的分裂细胞群。在胚胎干细胞系中为那些能够产生更多胚胎干细胞的细胞，或在分化条件下，产生包括能在植入后胚胎、胎儿或发育的生物体中发现的大多数或所有的细胞类型的细胞集合。
去核-一种通过移除细胞核材料而只留下细胞质的方法，当应用于卵时，为母本染色体的移除，该母本染色体没有被核膜包围。
荧光原位杂交(FISH)-一种用特异性设计的荧光分子“点亮(lightup)”特定的基因或染色体的部分，使它们在显微镜下可见的技术。
荧光甚至使染色体的小基因也可见。
核体-通过去核从细胞得到的细胞核，被较浅的环形细胞质和质膜包围。
桑椹胚-受精后3-4天的植入前胚胎，是由12-32个细胞(卵裂球)组成的实体团。在8细胞期后，植入前胚胎的细胞开始彼此间粘附更加紧密。变成“紧凑的”。得到的胚胎类似桑椹，被称为桑椹胚(拉丁语桑属(morus)＝桑椹(mulberry))。
核转移-一种将细胞核从供体细胞转移到去核的卵或受精卵(已经去除核的卵或受精卵)的过程。供体细胞核可以来自生殖细胞或体细胞。重新编程-重新设置核发育的时钟；例如，重新设置成熟分化细胞核的发育，使其能够进行早期胚胎细胞核的遗传程序，制造所有胚胎发育所需的蛋白。在体细胞核转移中，在体细胞核重新编程以行使胚胎细胞核功能的过程中，接受卵的细胞质组分被认为发挥重要的角色。再克隆或连续核转移-该技术的第一步为通常的核转移，其中细胞核被转移到去核卵中，形成胚胎。在第二步中，将来自得到的克隆胚胎的核转移到另一去核卵或去核受精卵(母系和父系前细胞核均被去除的受精卵)。第二步可以被重复一次或多次。该技术使细胞核具有两次(或多次)机会被卵细胞质重新编程(一次在初次核转移期间，更多次在后继的核转移期间)，因此潜在地提高了成功的核重新编程的机会。体细胞-植物或动物除了生殖细胞或生殖细胞前体的任意细胞。
体细胞核转移-也称为治疗性克隆，是体细胞与去核卵母细胞融合的过程。体细胞核提供遗传信息，而卵母细胞提供营养和其它胚胎发育需要的能量生产材料。一旦融合发生，细胞变为全能的，且最终发育为胚泡，此时细胞团分离。
转基因生物体-一种实验性转移了来自另一生物体的遗传材料的生物体，因此宿主获得了染色体组成中转移基因的遗传特性。
本发明涉及提高为进行核转移过程而建立的转基因胚胎的数目和增强产生的胚胎的重新编程的系统。本发明提供了一种按照连续核转移步骤的应用而生产转基因动物的改良的方法。该性能导致生产活化转基因胚胎效率的提高，以生产包括山羊、猪、啮齿动物、灵长类、兔和牛的多种非人哺乳动物的成活后代。
另外，本发明涉及一种克隆方法，其中将来自包括非血清饥饿分化的胎儿或成年山羊细胞的分化胎儿或成年哺乳动物的细胞核移植入与供体核同种去核卵母细胞。细胞核重新编程以指导克隆胚胎的发育，接着可以将其转移到雌性受体以生产胎儿和后代，或用于生产培养内细胞团细胞(CICM)。克隆胚胎也可以与受精胚胎结合来生产嵌合胚胎、胎儿和/或后代。
供体细胞核与去核细胞质的融合，以及后继的将得到的偶联体(couplet)的活化是通过体细胞核转移成功产生活后代所需要的重要步骤。供体细胞核与胞质的电融合为采用的最常见的方法。然而更为重要地，已经公开了一些活化方法及活化步骤时间的选择用于核转移的方法学以启动多种家畜种类胚胎发育的过程。在哺乳动物中，尽管有物种差异，启始的信号事件和后继的受精中精子诱导的Ca+2振荡为导致卵母细胞活化和胚胎发育的通常过程(Fissore等人，1992和Alberio等人，2001)。Ca+2动员的的化学和电学方法目前用于活化体细胞核转移而产生的偶联体。然而，这些方法不产生与典型的体内受精模式中精子同样的Ca+2振荡模式。
自从在羊中利用体细胞成功的最初报道后(Wilmut等人，1997)，已经发生了核转移的显著进步。已经从体细胞克隆了许多其它物种(Baguisi等人，1999和Cibelli等人，1998)，取得了不同程度的成功。许多其它胎儿和成年机体组织类型(Zou等人，2001和Wells等人，1999)，以及胚胎(Yang等人，1992；Bondioli等人，1990；以及Meng等人，1997)，也已经被报道。
根据本发明，运用重组体细胞系进行核转移，以及通过采用“再克隆”胚胎增加可利用的细胞的数目而提高该程序的效率，不仅使通过传统转染方法将转基因导入更多的转基因动物，而且充分提高了转基因动物生产的效率，改良了细胞重新编程，使发育为动物的转基因胚胎正常和健康地发育。
通过本发明中采用的方法学和系统，通过体细胞核转移产生转基因动物，山羊，且显示能够在克隆动物的乳汁中产生靶治疗性蛋白。
根据本发明的一个优选实施方案，从体细胞NT(核转移)得到的在不同细胞阶段的胚胎，包括2-、40-、8-、16-、32-细胞、桑椹胚和胚泡细胞阶段均可以用作细胞供体通过第二轮NT(再克隆)而生产转基因动物。
在本发明的另一个实施方案中，运用体外成熟的卵母细胞进行NT得到不同细胞阶段的胚胎，包括2-、40-、8-、16-、32-细胞、桑椹胚和胚泡细胞阶段均可以用作细胞供体通过第二轮NT而生产转基因动物。
在本发明的另一个实施方案中，运用体内成熟的卵母细胞进行NT得到不同细胞阶段的胚胎，包括2-、40-、8-、16-、32-细胞、桑椹胚和胚泡细胞阶段均可以用作细胞供体通过第二轮NT而生产转基因动物。
尽管前述的发明已经为理解的目的通过说明和举例较为详细地描述，显然对本领域技术人员而言可以实行一定的变化和改良。因此，描述和举例不应解释为对本发明范围的限制，该范围通过附加的权利要求描绘。
材料和方法动情期同步和排卵过度的供体被用作卵母细胞供体，显微操作按照1996年Gavin W.G.描述的进行，在此引入作为参考。原代体细胞的分离和建立，以及用作细胞核供体的体细胞的转染和制备也按照前述的方法进行。原代体细胞为获自采用标准的基于脂质的转染步骤用目的基因转染的动物组织的分化非生殖细胞。检测转染的细胞，按照1999年Baguisi等人的描述培养和制备转基因阳性细胞，用作核转移的供体细胞。应当记住去核和重建步骤可以用或不用通过DNA染色剂Hoechst 33342或其它显示核酸的荧光感光组合物进行染色卵母细胞而进行。然而优选采用大约0.1-5.0μg/ml Hoechst 33342使遗传材料在中期板上显现。
山羊用于本研究的纯种混合饲养的无羊痒病的阿尔卑斯山羊(Alpine)、萨能奶山羊(Saanen)和托根伯格(Toggenburg)奶山羊羊群按照规范化农业(Good Agricultural Practice(GAP))指南饲养。
羊胎儿体细胞分离用作细胞核供体的原代羊胎儿纤维原细胞系来源于用从转基因雄性动物新鲜收集的精液人工受精的2个非转基因雌性动物的35和40天的胎儿。外科手术取出胎儿并放置在平衡磷酸盐缓冲盐水(PBS，无Ca++/Mg++)中。切碎胎儿组织，在38℃暴露于0.025％的胰蛋白酶、0.5mM EDTA中10分钟，制备单个细胞悬浮液。用含有10％胎牛血清(FBS)，补充了核苷、0.1mM 2-巯基乙醇、2mM L-谷氨酰胺及1％青霉素/链霉素(10,000I.U.每种/ml)]的胎儿细胞培养基[平衡培养基199(M199，Gibco)冲洗细胞，并在25cm2瓶中培养。孵育4天后用胰蛋白酶收集汇合单层原代胎儿细胞，然后在培养基中维持或冷藏。
区分供体细胞系的性别和基因型从胎儿组织中分离基因组DNA，并通过聚合酶链反应(PCR)分析靶信号序列的存在以及用于鉴别性别的序列。通过扩增一段367bp的序列检测靶转基因序列。采用zfX/zfY引物对和Sac I限制型内切酶消化扩增片段进行性别区分。
制备进行多轮核转移的供体细胞转基因雌性动物系被用于所有的核转移程序。胎儿体细胞被种于含胎儿细胞培养基的4孔板中，并在培养基中维持(5％CO2，39℃)。48小时后，用新鲜低浓度血清(0.5％FBS)胎儿细胞培养基替换培养基。在后来的7天中，每48到72小时用低浓度血清胎儿细胞培养基替换原培养基。在第一次加入低血清培养基后的第7天，用胰蛋白酶消化收集体细胞(用作细胞核供体)。在与去核卵母细胞融合前，细胞在含有补充了2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素(10,000I.U.每种/ml)的10％FBS的平衡M199中重新悬浮1到3小时。
收集卵母细胞根据本发明的一个实施方案，进行第一轮核转移的卵母细胞供体雌性动物按照前述的方法(Gavin W.G.，1996)进行同步化和排卵过度，且在48小时的间隔后与切除输精管的雄性动物交配，收集卵母细胞后，将其在含有补充了2mM L-谷氨酰胺、1％青霉素/链霉素(10,000I.U.每种/ml)的10％FBS的平衡M199中培养。类似地，以后的核转移也采用可能在体内或体外成熟的卵母细胞。体内成熟的卵母细胞来源于上文说明的预先用转基因胚胎植入的供体。在收集并用于另一轮核转移前，体外成熟的卵母细胞在体外发育至特定的细胞阶段。
细胞质制备和核去除将粘附了丘细胞(Cumulus cells)的卵母细胞弃除。没有丘细胞的卵母细胞被分为两组停滞中期-II(arrested Metaphase-II)(单极体)和末期-II(Telophase-II)(无清晰可见的极性体或部分突出的第二极性体的存在)步骤。在停滞中期-II步骤中的卵母细胞首先被去核。通过在M199/10％FBS中培养2到4小时制备分配在活化的末期-II步骤的卵母细胞。在这期间后，所有活化的卵母细胞(具有部分突出的第二极性体)被分组为培养基诱导、钙活化末期-II的卵母细胞(末期II-Ca)并去核。在培养期间没有活化的卵母细胞随后在M199，含有7％乙醇的10％FBS中孵育5分钟诱导活化，接着在含有10％FBS的M199中另外培养3小时，达到末期-II(末期II-EtOH步骤)。
在去核前将所有的卵母细胞用细胞松弛素B(cytochalasin-B)(Sigma，在含有10％FBS的M199中为5□g/ml)处理15到30分钟。用25到30□m的玻璃吸管吸取第一极性体和环绕极性体的邻近的细胞质(～30％的细胞质)去除中期板使末期II阶段的卵母细胞去核，通过去除第一极性体和含有部分突出的第二极性体的周围的细胞质(10％到30％的细胞质)摘除分裂末期II-Ca和末期-II-EtOH卵母细胞核，去核后，对所有卵母细胞立即进行重建(reconstructed)。核转移和重建(reconstruction)在与用于卵母细胞去核同样的培养基中进行供体细胞注射。用玻璃吸管将一个供体细胞置于透明带和卵质膜之间。在电融合和活化步骤之前将细胞-卵母细胞偶联在M199中孵育30到60分钟。重建的卵母细胞在融合缓冲液(300mM甘露醇，0.05mMCaCl2，0.1mM MgSO4，1mM K2HPO4，0.1mM谷胱苷肽，0.1mg/ml BSA)中平衡2分钟。电融合和活化在室温下，在充满融合培养基的具有2个制成“融合玻片(fusion slide)”的不锈钢电极的融合腔(500μm间距；BTX-Genetronics，San Diego，CA)中进行。
融合使用融合玻片进行，融合玻片置于融合平皿内，平皿中注满足够量的融合缓冲液，覆盖融合玻片的电极。将偶联体从培养孵育器中移出，并用融合缓冲液冲洗。采用立体显微镜将偶联体等距地置于电极之间，细胞核/细胞质的连接与电极平行。应当注意应用于增强偶联体的活化和融合的的电压范围可以为从1.0kV/cm到10.0kV/cm。然而优选的起始单个同步融合和活化电脉冲具有2.0到3.0kV/cm的电压范围，更为优选为2.5kV/cm，优选持续时间至少为20μsec。该条件采用BTX ECM 2001 Electrocell Manipulator应用于细胞偶联体。微脉冲的持续时间可以为10到80μsec不等。该程序后，处理的偶联体通常被转移到一滴新鲜的融合缓冲液中。融合处理的偶联用平衡SOF/FBS冲洗，接着转移到含有或不含细胞松弛素B的平衡SOF/FBS中。如果采用细胞松弛素B，它的浓度可以为1到15μg/ml不等，最优选的为5μg/ml。将偶联体在37-39℃的空气中含有大约5％CO2的潮湿气体箱中孵育。应当注意，在现有公开提供的任意的操作步骤中，均可采用甘露醇代替细胞松弛素B(含有Ca+2和BSA的HEPES缓冲的基于甘露醇(0.3mm)的培养基)。融合后从10到90分钟，最优选融合后30分钟开始，确定了实际细胞核/细胞质融合的出现，进行转基因胚胎的发育，以进行后来的植入或用于另外轮的核转移。
环己酰亚胺处理后，用补充至少0.1％的牛血清白蛋白，优选至少0.7％，优选0.8％，加入100U/ml的青霉素和100μg/ml的链霉素的平衡SOF培养基(SOF/BSA)充分冲洗偶联体。将偶联体转移到平衡SOF/BSA，且在含有大约6％O2、5％CO2、平衡氮气的潮湿标准组件孵育箱中，在37-39℃无干扰地培养24-48小时。将发育与年龄相符的核转移胚胎(24到48小时由1个细胞到8个细胞)转移到同步化的替代受体。
核转移胚胎的培养和转移至受体根据本发明的一个优选实施方案，所有的核转移胚胎在50□l含10％FBS的覆盖矿物油的M199小滴中，在单层原代山羊输卵管上皮细胞上共培养。在将胚胎转移到受体雌性动物中前，胚胎培养在39℃下，含有5％CO2的潮湿的孵育箱中维持48小时。胚胎的受体转移按前述的方法进行。
在本发明建立过程中的试验操作中，去核和核转移后，细胞核/细胞质偶联体在补充了1％到15％胎牛血清，优选10％FBS，及加入了100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的平衡的合成输卵管液培养基(SOF/FBS)中孵育。在融合前，将偶联体在空气中含有大约5％CO2的37-39℃潮湿的气体箱中孵育至少30分钟。
通过采用至少两轮核转移步骤，本发明提供额外产生的活化和融合转基因胚胎，使转基因程序的效率提高。得到的胚胎可以植入替代动物或可以克隆增殖和储存或利用。通过将核转移与体外改良和选择这些细胞的能力相结合，该程序提高了第二核转移胚胎自身重新编程的能力，导致转基因动物的高效生产和更健康的转基因动物。通过这一方式，本发明比以前的转基因胚胎技术效率更高。根据本发明，这些转基因克隆胚胎可以用于生产CICM细胞系或其它具有增强的稳定性的胚胎细胞系。因此，本发明排除了对有助于基因工程技术的体外来源和维持的未分化细胞系的需要。
因此，一方面，本发明提供了一种克隆哺乳动物的方法。通常一个哺乳动物可以通过包括下列步骤的核转移方法生产一种通过核转移方法克隆非人哺乳动物的方法，包括(i)获得目的分化哺乳动物细胞用作供体核的来源；(ii)从与供体核来源的细胞同样种类的哺乳动物中获得至少一个卵母细胞；(iii)使所述的至少一个卵母细胞去核；(iv)将目的分化细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞；(v)同时融合和活化细胞偶联体以形成第一转基因胚胎；(vi)培养所述的第一转基因胚胎直至达到至少2细胞发育阶段；以及(vii)利用所述第一转基因胚胎的至少一个细胞作为供体细胞通过至少另一轮核转移生产第二转基因胚胎产生转基因动物。
本发明也包括一种克隆基因工程或转基因哺乳动物的方法，通过该方法，在将分化哺乳动物细胞或细胞核插入去核的卵母细胞之前，在分化哺乳动物细胞或细胞核中将目的基因插入、去除或修饰。
本发明还提供了根据上述方法得到的哺乳动物，以及这些哺乳动物的后代。本发明优选用于克隆羊。本发明进一步提供核转移胎儿和核转移和嵌合后代在细胞、组织和器官移植领域的应用。
另一方面，本发明提供一种生产CICM细胞的方法。该方法包括(i)获得目的分化哺乳动物细胞用作供体核的来源；(ii)从与供体核来源的细胞相同物种的哺乳动物中获得卵母细胞；(iii)所述的卵母细胞去核；(iv)将目的分化细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞；(v)同时融合和活化细胞偶联体以形成第一转基因胚胎；(vi)活化未融合以产生第一转基因胚胎的细胞偶联体，但是通过提供包括额外的电冲击的至少一次附加的活化步骤而在最初电冲击后被活化以产生第二转基因胚胎；(vii)培养所述的活化第一和/或第二转基因胚胎直至超过2细胞发育阶段；以及(viii)培养从所述的第二转基因胚胎得到的细胞来获得CICM细胞。
这里描述的方法来源的CICM细胞也可以方便地用于细胞、组织和器官移植的领域，或用于生产胎儿或后代，包括转基因胎儿或后代。分化哺乳动物细胞为那些通过早期胚胎阶段的细胞。分化细胞可以来源于外胚层、中胚层或内胚层的组织或细胞层。
哺乳动物细胞，包括人类细胞可以通过众所周知的方法获得。用于本发明的哺乳动物细胞包括例如，上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B和T淋巴细胞)、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、单核的细胞、成纤维细胞、心肌细胞及其它肌细胞等等。另外，用于核转移的哺乳动物细胞可以从不同的器官获得，例如，皮肤、肺、胰、肝、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾脏、尿道和其它泌尿器官等等。这些仅仅是合适的供体细胞的实例，可用于本发明的合适的供体细胞可以从机体的任意细胞或器官获得，包括所有的体细胞或生殖细胞。
成纤维细胞为一种理想的细胞类型，因为它们可以从发育中的胎儿和成年动物中大量获得。成纤维细胞已分化到一定程度，因此曾被认为是不适用于克隆程序的细胞类型。重要的是，这些细胞倍增时间短，可以在体外容易地增殖，且能够克隆增殖以用于基因打靶操作。本发明的创新之处还在于采用了分化的细胞类型。本发明的优势在于这些细胞可以在体外容易地繁殖、遗传修饰和筛选。
合适的卵母细胞的哺乳动物的来源包括山羊、绵羊、牛、猪、兔、豚鼠、小鼠、仓鼠、大鼠、灵长类等等。优选地，卵母细胞可以从羊和有蹄类动物获得，且最优选山羊。分离卵母细胞的方法是现有技术中众所周知的。基本上包括从哺乳动物如山羊的卵巢或生殖管道分离卵母细胞。山羊卵母细胞的便利来源是激素诱导的雌性动物。
为了成功运用例如基因工程、核转移和克隆的技术，在卵母细胞作为受体细胞进行核转移之前，以及在由精子细胞受精而发育为胚胎前，卵母细胞可以优选在体内成熟。在体内成熟的分裂中期II阶段的卵母细胞已经成功地运用于核转移技术。基本上，成熟的中期II卵母细胞是从发情后或注射了人绒毛膜促性腺激素(hCG)或类似激素几个小时后，用外科方法从非超排卵或超排卵的动物中收集的。
而且，应当注意，通过转基因技术改变动物基因组的能力提供了制造重组蛋白的新的选择。在转基因畜牧动物乳汁中的人重组医药品的生产解决了许多与微生物反应器相关的问题(例如，缺乏转录后修饰、不恰当的蛋白质折叠、高纯化费用)或与动物细胞反应器相关的问题(例如，高资金花费、昂贵的培养基、低产量)。
已经报道去核和核转移的卵母细胞的成熟阶段对核转移方法的成功与否很重要。通常，成功的哺乳动物胚胎克隆操作采用分裂中期II阶段的卵母细胞作为受体卵母细胞，因为具信在这一时期，卵母细胞能够或充分地被活化以处理引入的细胞核，如同它处理受精精子一样。在驯养动物中，特别是山羊中，卵母细胞活化期通常发生在精子与之接触和穿入卵母细胞质膜的时候。
在一定时间的成熟期后使卵母细胞去核，该成熟期大约在10到40小时的范围内，优选大约16-18小时。在去核前优选取出卵母细胞，放入含有1毫克每毫升的透明质酸酶的EMCARE培养基中，再去除卵丘细胞。可以通过反复用极细吸液管吸液或轻微振荡而实现。接着根据极性体的有无筛查被剥离的卵母细胞，存在极性体的为应选的分裂中期II卵母细胞，再将其用于核转移。然后去核。
可以通过已知的方法去核，例如U.S.专利No.4,994,384中所描述的，这里作为参考引入。例如，中期II卵母细胞被置于EMCARE培养基中，优选含有7.5微克每毫升的细胞松弛素B，进行立即去核，或可以置于一种合适的培养基中，例如，胚胎培养基，如加入10％FBS的CR1aa，接着进行去核，优选不多于24小时后，更优选16-18小时后。
去核可以通过采用微移液管移除极性体和周围细胞质的显微外科方法完成。接着可以筛查卵母细胞来鉴定已经被成功地去核的卵母细胞。筛查可以通过用含1微克每毫升的33342 Hoechst染料的EMCARE或SOF对卵母细胞进行染色，接着在少于10秒的紫外线照射下观察卵母细胞而完成，可以将已经成功去核的卵母细胞放置在合适的培养基中。
在本发明中，受体卵母细胞将优选在体外或体内成熟开始后大约10到40小时的时间范围内去核，更为优选在体外或体内成熟开始后的大约16小时到24小时，最优选体外或体内成熟开始后的16-18小时。
接着将与去核的卵母细胞相同物种的单个的哺乳动物细胞转移到用于产生活化胚胎的去核的卵母细胞的卵周隙。可以根据现有技术中已知的方法将哺乳动物细胞和去核卵母细胞用于生产活化胚胎。例如，可以通过电融合融合细胞。通过提供足够引起瞬时的质膜破裂的电脉冲而完成电融合。该质膜的破裂非常短暂，因为膜迅速重形成。因此，如果两相邻质膜被诱导而破裂，并由于脂质双分子层混合重形成，两细胞间的小通道将开放。根据这种小开放的热动力学的不稳定性，开口将扩大直至两个细胞合二为一。参见Prather等人的U.S.专利No.4,997,384(这里全部引入作为参考)，该文献对这一过程作了深入讨论。可以采用多种电融介质，包括如，蔗糖、甘露醇、山梨醇和磷酸盐缓冲液。融合也可以用仙台病毒作为融合剂实现(Ponimaskin等人，2000)。
另外在一些情形下(例如，小的供体核)，也可优选直接将核注射入卵母细胞，而不是采用电穿孔融合。该技术被Collas和Barnes，在Mol.Reprod.Dev.，38264-267(1994)中公开，在此将其全部引入作为参考。
可以用已知的方法活化活化的胚胎，该方法包括，例如，在亚生理学温度培养活化的胚胎，本质上通过对活化胚胎提供寒冷或实际上凉爽的温度刺激。这可以最方便地通过在室温下培养活化胚胎完成，与胚胎通常暴露的生理温度条件相比室温是较冷的。
另外，可以通过应用已知的活化剂而达到活化目的。例如，已经表明在受精期间精子穿入卵母细胞可活化灌注卵母细胞，从而在核转移后产生大量可生存下来的孕胎(pregnancies)以及许多遗传一致的小牛。融合后如电和化学休克的处理也可以用于活化NT胚胎。合适的卵母细胞活化方法可见U.S.专利No.5,496,720，Susko-Parrish等人，这里全部引入作为参考。
另外，活化最好同时完成，尽管相继活化的操作确实存在。在活化中，发生下列的细胞事件(i)提高卵母细胞中二价阳离子的水平，且(ii)降低卵母细胞内细胞蛋白的磷酸化作用。
可通过将二价阳离子如镁、锶、钡或钙等通过以如离子载体的形式导入卵母细胞胞质中而外界刺激发生上述事件。其它的提高二价阳离子水平的方法包括采用电休克，用乙醇处理和用caged螯合剂处理。可以通过已知方法降低磷酸化水平，如，通过加入激酶抑制剂如丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，如6-二甲基-氨基嘌呤、星形孢菌素、2-氨基嘌呤和神经鞘氨醇等。另外，也可以通过将磷酸酶如磷酸酶2A和磷酸酶2B导入卵母细胞内来抑制细胞蛋白的磷酸化。
相应地，应当理解本发明的具体实施方案提供活化和融合的“再克隆胚胎”的增加的可成活率仅仅是本发明原理应用的例证。在前描述可以证明，形态的改变、采用的方法以及公开方法的特征的应用，用于进行相继的核转移的转基因胚胎的改良的应用是创新的，且可以被改良和/或采用，而不背离本发明的实质或附加的权利要求的范围。
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权利要求
1.通过核转移方法克隆非人哺乳动物的方法，包括(i)获得目的分化的哺乳动物细胞用作供体核的来源；(ii)从与供体核来源的细胞同种的哺乳动物中获得至少一个卵母细胞；(iii)将所述的至少一个卵母细胞去核；(iv)将目的分化的细胞或细胞核转移至去核的卵母细胞；(v)同时融合和活化细胞偶联体以形成第一转基因胚胎；(vi)培养所述的第一转基因胚胎直至达到其至少2细胞发育阶段；且(vii)利用所述第一转基因胚胎的至少一个细胞作为供体细胞来通过至少另一轮核转移生产第二转基因胚胎产生转基因动物。
2.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核或供体细胞核来源的供体分化的哺乳动物细胞来自中胚层。
3.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核或供体细胞核来源的供体分化的哺乳动物细胞来自内胚层。
4.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核或供体细胞核来源的供体分化的哺乳动物细胞来自外胚层。
5.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核或供体细胞核来源的供体分化的哺乳动物细胞来自胎儿体组织。
6.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核或供体细胞核来源的供体分化的哺乳动物细胞来自胎儿体细胞。
7.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核或供体细胞核来源的供体分化的哺乳动物细胞来自成纤维细胞。
8.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核或供体细胞核来源的供体分化的哺乳动物细胞来自有蹄类动物。
9.权利要求1或8的方法，其中所述的供体细胞或供体细胞核来自选自牛、绵羊、猪、马、山羊和水牛的有蹄动物。
10.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核或供体细胞核来源的供体分化的哺乳动物细胞来自成年非人哺乳动物体细胞。
11.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核或供体细胞核来源的供体分化的哺乳动物细胞选自上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质细胞、造血细胞、黑色素细胞、软骨细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞和肌细胞。
12.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核或供体细胞核来源的供体分化的哺乳动物细胞来自选自皮肤、肺、胰、肝、胃、肠、心脏、生殖器官、膀胱、肾脏和尿道的器官。
13.权利要求1的方法，其中所述的至少一个卵母细胞去核前在体内成熟。
14.权利要求1的方法，其中所述的至少一个卵母细胞去核前在体外成熟。
15.权利要求1的方法，其中所述的非人哺乳动物为啮齿动物。
16.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核或供体细胞核来源的供体分化的哺乳动物细胞为非静止体细胞或分离自所述非静止体细胞的细胞核。
17.权利要求1或8的方法，其中胎儿发育为后代。
18.权利要求1的方法，其中所述的至少一个卵母细胞在体外成熟开始后大约10到60小时进行去核。
19.权利要求1的方法，其中在将所述的分化的哺乳动物细胞或细胞核插入所述去核卵母细胞前，在所述的分化的哺乳动物细胞或细胞核中插入、去除或修饰目的基因。
20.由权利要求1或19的方法所获得的后代。
21.权利要求19所获得的后代，进一步包括其中由所述核转移过程产生的后代为嵌合的。
22.权利要求1的方法，其中克隆步骤中采用细胞松弛素B。
23.权利要求1的方法，其中克隆步骤中不采用细胞松弛素B。
24.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核来源的分化哺乳动物细胞来自体外成熟的卵母细胞。
25.权利要求24的方法，其中当所述的第一转基因胚胎最多在发育的40细胞阶段时，采用所述的第一转基因胚胎的细胞产生至少一个所述的第二转基因胚胎。
26.权利要求24的方法，其中当所述的第一转基因胚胎在发育的32细胞阶段时，采用所述的第一转基因胚胎的细胞产生至少一个所述的第二转基因胚胎。
27.权利要求24的方法，其中当所述的第一转基因胚胎在发育的16细胞阶段时，采用所述的第一转基因胚胎的细胞产生至少一个所述的第二转基因胚胎。
28.权利要求24的方法，其中当所述的第一转基因胚胎在发育的8细胞阶段时，采用所述的第一转基因胚胎的细胞产生至少一个所述的第二转基因胚胎。
29.权利要求1的方法，其中所述的用作供体核来源的分化的哺乳动物细胞来自体内成熟的卵母细胞。
30.权利要求29的方法，其中当所述的第一转基因胚胎最多在发育的40细胞阶段时，采用所述的第一转基因胚胎的细胞产生至少一个所述的第二转基因胚胎。
31.权利要求29的方法，其中当所述的第一转基因胚胎在发育的32细胞阶段时，采用所述的第一转基因胚胎的细胞产生至少一个所述的第二转基因胚胎。
32.权利要求29的方法，其中当所述的第一转基因胚胎在发育的16细胞阶段时，采用所述的第一转基因胚胎的细胞产生至少一个所述的第二转基因胚胎。
33.权利要求29的方法，其中当所述的第一转基因胚胎在发育的8细胞阶段时，采用所述的第一转基因胚胎的细胞产生至少一个所述的第二转基因胚胎。
34.权利要求1的方法，进一步包括将所述的第二转基因胚胎转移到宿主哺乳动物，使胚胎发育为胎儿。
35.权利要求24或29的方法所获得的后代。
全文摘要
本发明提供了既提高连续核转移的效率又提高随后产生转基因细胞和/或动物的效率的方法。这种新方法通过采用至少第二轮核转移，使供体细胞能够更有效地矫正其重新编程(reprogramming)，产生更多数量的有用的转基因胚胎。由于产生的胚胎增强了重新编程，本发明可以产生更健康的转基因动物。
文档编号C12N15/00GK1735338SQ200380108536
公开日2006年2月15日 申请日期2003年12月9日 优先权日2002年12月10日
发明者E·贝布迪, E·梅米利, Y·艾彻拉德 申请人:Gtc生物治疗学公司