芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记及制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记及制备方法和应用，所述的标记GB50的正向引物序列为：ATGGGTTTATGGCAGGCT，反向引物序列为：GGACTACTCCTCCTCCCCA；SBM298的正向引物的序列为：CCCCTTTTCACTTACGTACAGCAG，反向引物的序列为：CTCTTCCTCCACCATCTCCTCTTC。步骤是：A、在苗期对显性细胞核雄性不育兄妹交分离群体各编号，分单株采集幼嫩叶片，经液氮处理后冰箱储存备用；B、利用EST-SSR引物SBM系列，生物合成；C、采用PCR程序进行扩增；D、PCR扩增与产物检测；E、多态性标记的获得；F、与雄性不育相关分子标记的获得。获得100%雄性不育的群体，显著提高芝麻轮回选择的效率，避免了利用形态特征只有等到花期才能拔除50%可育株的麻烦。本发明效果明显、成本低、无公害，应用前景十分广阔。
【专利说明】芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记及制备方法和应用
【技术领域】
[0001]本发明属于芝麻遗传育种和分子生物学领域，更具体涉及一种芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记，同时还涉及一种芝麻显性细胞核雄性不育相关分子标记的制备方法，还涉及一种芝麻显性细胞核雄性不育分子标记在分子标记辅助选择中的应用，以提高利用芝麻显性细胞核雄性不育基因进行高产育种的效率。
【背景技术】
[0002]芝麻是我国主要油料作物之一，芝麻油芳香纯正，营养价值高，素有“油中之王”的美誉。我国芝麻年种植面积60万公顷左右，占世界总面积的十分之一，总产60-70万吨，占世界总产的四分之一，其总产和单产均居世界首位(杨湄，黄凤洪.中国芝麻产业现状与存在问题、发展趋势与对策建议.中国油脂，2009，34 (1):7-12)，是农业结构调整的优势作物，也是传统的出口创汇作物。但近十年来，国内芝麻消费量大幅度上升，年均消费芝麻籽80万吨以上，其中20万吨靠进口，芝麻已经转变为纯进口作物。因此，进一步提高芝麻单产和总产以满足国内消费需求是当前的紧迫任务。
[0003]芝麻在全国各地均可种植，但主要集中在河南、湖北、安徽、江西四省。我国芝麻产业发展中存在的主要问题有:①产量常常低而不稳，长期徘徊在亩产70公斤的水平(杨湄，黄凤洪.中国芝麻产业现状与存在问题、发展趋势与对策建议.中国油脂，2009，34 (I):7-12);②抗病性差，易发生茎点枯病、枯萎病，且目前未发现免疫或高抗材料(Zhang X R,Zhao Y Z, Cheng Y, Feng X F， et al.Establishment of sesame germplasm core collectionin China.Genetic Resources and Crop Evolution, 2000, 47: 273-279);③外观品质差，含油量低，市场竞争力不强 。因此开展高产、优质、抗病芝麻新品种选育是当前的主要育种目标。
[0004]芝麻具有很强的杂种优势，通过杂种优势利用可以大幅度提高芝麻的产量(屠礼传，柳家荣，梁秀银.芝麻杂种优势研究.中国油料，1988 (2):8-12 ;乐美旺，曹开蔚，张冬仙等.黑芝麻杂种优势研究.江西农业学报，2006，18 (1):1-5)。作物杂种优势利用途径主要有:细胞质雄性不育、细胞核雄性不育、化学杀雄、自交不亲和等(傅廷栋主编.杂交油菜的育种与利用(第二版).武汉:湖北科学技术出版社，2000;刘后利主编，作物育种学论丛.北京:中国农业大学出版社，2002)。在芝麻中，目前杂种优势利用的主要方式为隐性细胞核雄性不育，尚未见到显性细胞核不育的报道。利用芝麻隐性细胞核雄性不育虽然育成了一些杂交品种，但芝麻隐性核不育的缺点是缺乏完全的保持系，只能以两型系的形式加以利用，在生产杂交种时存在着必须及时拔除两型系中50%可育株的问题，较费时费力，人工成本高，因此限制了其在芝麻生产上的应用。
[0005]显性核不育是杂种优势利用的另外一条重要途径，在油菜、白菜等作物中已经被广泛应用。本发明 申请人:通过种间杂交，首次创制出芝麻显性细胞核雄性不育两型系W1098AB，其不育系败育彻底、稳定、无不良胞质效应。通过前期研究表明，W1098AB兄妹交群体的育性分离比例稳定在1:1，可育株自交后代全部可育，而且利用17份芝麻地方品种与不育株测交，所有Fl代均发生育性分离。上述结果进一步说明，W1098AB为显性核不育，可能受I对基因控制，绝大部分品种为其保持系。该雄性不育在芝麻轮回选择育种中是一个很好的材料，可进行广泛的基因重组和品种选育。但轮回选择一般需于初花期及时拔除不育系中50%的可育株(张立森，江庆芬，泰立芳.太谷显性核不育小麦轮回选择育种简报.河北农业大学学报，1989，12 (4): 143-144)，而芝麻W1098AB不育株与可育株的形态特征十分相似，在营养生长期无法区别，只能等到开花后根据花粉有无进行区分，十分费时费力，去除不及时将产生大量花粉污染，影响选择效率。针对上述问题，本发明利用分子标记技术，开发出多个与育性紧密连锁的分子标记，在苗期即可对可育株进行准确识别和拔除，获得100%雄性不育的群体，显著提高芝麻轮回选择的效率，应用前景广阔。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是在于提供了一种芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记，开发出多个与育性紧密连锁的分子标记，在苗期即可对可育株进行准确识别和拔除，获得100%雄性不育的群体，显著提高芝麻轮回选择的效率，避免了利用形态特征只有等到花期才能拔除50%可育株的麻烦。本发明效果明显、成本低、无公害，应用前景十分广阔。
[0007]本发明的另一个目的是在于提供了一种芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记的制备方法，方法易行，操作性强，其特点是特异性强，扩增重复性好，可以确定植株或品系中是否有不育基因的存在，从而在早期鉴定芝麻植株的育性。 [0008]本发明的再一个目的是在于提供了一种芝麻显性细胞核雄性不育基因的分子标记在芝麻亲本选择中的应用，通过分子标记辅助选择，鉴定和筛选不育材料速度快，极大地减轻了在鉴定过程中必需经过测交及后代种植观察的工作量，有效提高了选择的效率和准确性，从而大大提高了芝麻显性细胞核雄性不育基因选育的速度与鉴定效率，加快了杂交种选育的进程。
[0009]为了实现上述目的，本发明采用以下技术措施:
一种芝麻显性细胞核雄性不育基因分子标记的制备方法，其步骤是:
A、在苗期首先对显性细胞核雄性不育兄妹交分离群体各单株编号挂牌，然后分单株采集幼嫩叶片，经液氮处理后于-70°C超低温冰箱储存备用。在盛花期，利用田间观察和室内醋酸洋红染色等方法(刘绚霞，醋酸洋红染色法测定油菜花粉的生活力.陕西农业科学，1998，(I):23-24)，综合调查群体的花粉育性，将其准确划分为可育株或不育株。
[0010]B、利用本课题组开发的EST-SSR引物SBM系列(Kun Wu，Minmin Yang,Hongyan Liuj Ye Taoj Ju Meij Yingzhong Zha0.Genetic analysis and molecularcharacterization of Chinese sesame {SesamumindicumL.) cultivars usingInsertion-Deletion (InDel) and Simple sequence repeat (SSR) markers.BMC Genetics,2014，15)，并根据文献(张鹏，张海洋，郭旺珍，郑永战，魏利斌，张天真.以SRAP和EST-SSR标记分析芝麻种质资源的遗传多样性.作物学报，2007,33(10):1696-1702 ;Dixit A，JinM H，Chung J Wj Yu J Wj Chung H K，Ma K H，Park Y J，Cho E G.Development of polymorphicmicrosatellite markers in sesame {Sesamumindicum L.).Molecular Ecology Notes,2005，5: 736-738)下载SSR引物序列，共1500多对，委托上海英骏生物合成公司合成。
[0011]C、用 CTAB 法(Doyle J.DNA protocols for plants — CTAB total DNAisolation.1n: Hewitt G M， Johnston A.Molecular Techniques in Taxonomy, Berlin:Springer-Verlag, 1991.P283-293)提取芝麻显性细胞核雄性不育系兄妹交群体中的可育株与不育株叶片DNA，采用PCR程序(刘红艳，杨敏敏，左阳，舒岩，赵应忠.芝麻SSR检测体系的优化与应用.中国农学通报，2011,27(21): 138-143)进行扩增，所用PCR仪型号为ABI9700。
[0012]D、PCR产物的检测根据所需的分辨率不同可采用两种不同的方法，第一种为在1%~1.5%浓度(g/v)的琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕后，进行溴化乙啶染色，凝胶成像系统拍照保存，记录多态性结果。第二种为在聚丙烯酰胺凝胶中点样，电泳完毕后，用2%浓度(g/v) AgNO3银染，普通蒸馏水漂洗，显影液中显影，及时用凝胶成像系统拍照保存，并记录多态性结果。
[0013]E、由于所用材料是显性细胞核雄性不育兄妹交后代，电泳时差异条带呈现出可育(基因型为msms)为无带，不育(基因型为Msms)为有带。为方便记录，在相同迁移率位置上，将有带记为“1”，无带记为“0”，并统计SSR扩增产物。为保证数据准确、可靠，每胶板均由2人独立记录(仅记录主带),然后比对确认。
[0014]F、利用能检测出多态性的引物对全部单株逐一进行检测，将所得数据输入电脑，并用 JoinMap3.0软件(Van Ooijen J ff, Voorips R E.JoinMap Version 3.0: Software forthe Calculation of Genetic Linkage Maps[M].ffageningen, The Netherlands: PlantResearch International, 2001)进行分析,遗传图距用Kosambi函数加以转换(KosambiD D.The estimation of map distance from recombination values.Annals of Eugenics,1944，12:172-175)，两个性状(标记)间的重组交换率由以下公式计算:交换率(％)=重组型的配子数/总配子数X 100。
[0015]G、将重组交换率 高于15%的标记予以剔除(因为它们与不育基因呈松散的连锁关系)，找出重组交换率为15%以内、特异扩增片段大小为100-500bp的标记。
[0016]H、将所得标记检测结果使用 JoinMap软件(Van Ooijen J ff, Voorips R E.JoinMapVersion 3.0: Software for the Calculation of Genetic Linkage Maps[M].ffageningen,The Netherlands: Plant Research International, 2001)分析，设定 LOD 值为 2.0，如果发现所有标记都分为一组，随后将LOD值设置为最高值10.0,如果这些标记仍然没有分开，则表明它们之间是紧密连锁的。运行“Calculate Map”命令，即可获得一个遗传连锁图。从这张遗传连锁图上可以看出每个标记与不育基因间的遗传距离及方向，以及各个标记间的距离与方向。通过本方法目前已获得了 13个与不育基因紧密连锁的标记(请见表1)，其中标记SBM298和GB50距离不育基因最近。标记GB50的正向引物的序列为:ATGGGTTTATGGCAGGCT，反向引物的序列为:GGACTACTCCTCCTCCCCA ；SBM298 的正向引物的序列为:CCCCTTTTCACTTACGTACAGCAG，反向引物的序列为:CTCTTCCTCCACCATCTCCTCTTC。SBM298标记的引物为本实验室开发。
[0017]表1多态性引物序列
【权利要求】
1.一种芝麻显性细胞核雄性不育基因的分子标记，其特征在于:标记GB50的正向引物序列为:ATGGGTTTATGGCAGGCT,反向引物序列为:GGACTACTCCTCCTCCCCA ；SBM298的正向引物的序列为:CCCCTTTTCACTTACGTACAGCAG,反向引物的序列为:CTCTTCCTCCACCATCTCCTCTTC。
2.权利要求1所述的一种芝麻显性细胞核雄性不育基因的分子标记的制备方法，其步骤是: A、在苗期对显性细胞核雄性不育兄妹交分离群体各单株编号挂牌，然后分单株采集幼嫩叶片，经液氮处理后于-70°C超低温冰箱储存备用，在盛花期，利用田间观察和室内醋酸洋红染色方法，调查群体各单株的花粉育性，将其划分为可育株或不育株； B、利用EST-SSR引物SBM系列，并根据文献下载SSR引物序列，生物合成； C、用CTAB法提取芝麻显性细胞核雄性不育系兄妹交群体中的可育株与不育株叶片DNA，采用PCR程序进行扩增； D、PCR产物的检测根据分辨率不同采用两种不同的方法，第一种为在1%~1.5%浓度g/v的琼脂糖凝胶上电泳，电泳完毕后，进行溴化乙啶染色，凝胶成像系统拍照保存，记录多态性结果；第二种为在聚丙烯酰胺凝胶中点样，电泳完毕后，用2%浓度g/v的AgNO3银染，普通蒸馏水漂洗，显影液中显影，用凝胶成像系统拍照保存，并记录多态性结果； E、所用材料是显性细胞核雄性不育兄妹交后代，电泳时差异条带呈现出可育为无带，不育为有带； F、利用能检测出多态性的引物对全部单株逐一进行检测，将所得数据输入电脑，并用JoinMap3.0软件进行分析,遗传图距用Kosambi函数加以转换,两个性状间的重组交换率由以下公式计算:交换率％=重组型的配子数/总配子数X 100 ； G、将重组交换率高于15%的标记予以剔除，找出重组交换率为15%以内、特异扩增片段大小为100-500bp的标记； H、将所得标记检测结果使用JoinMap软件分析，设定LOD值为2.0，发现所有标记都分为一组，随后将LOD值设置为最高值10.0，这些标记没有分开，表明它们之间紧密连锁，获得一个遗传连锁图，标明每个标记与不育基因间的遗传距离及方向，及各个标记间的距离与方向，最终获得了 13个与不育基因紧密连锁的标记。
3.权利要求1所述的一种芝麻显性细胞核雄性不育基因的分子标记在芝麻亲本选择中的应用。
【文档编号】C12Q1/68GK103993011SQ201410111566
【公开日】2014年8月20日 申请日期:2014年3月24日 优先权日:2014年3月24日
【发明者】刘红艳, 赵应忠, 吴坤, 杨敏敏 申请人:中国农业科学院油料作物研究所