专利名称：海藻细胞核基因组的同源组合的制作方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学，更具体的，涉及外源DNA元素在海藻细胞中的表达。相关技术的描述对一个细胞的DNA操作可以赋予这个细胞新的功能。比如，一个转化细胞(也就是一个吸收了外源DNA的细胞)可以比野生型细胞更加强壮。对很多所谓的生物系统模型(即一些已被充分研究的生物体)而言，已经开发出了用于转化它们的DNA元素。对于其他尚未充分了解的生物体，转化是一个重要事件，是推进基因工程的必要前提。需要对这些生物体进行有效的、非随机转化使得这项挑战变得更为复杂。因此，需要对海藻细胞核基因组进行同源重组的方法。发明概述本发明提供并例举了将脱氧核糖核酸(DNA)导入海藻细胞细胞核的方法。可以制备这样一个转化结构，该结构具有与相应第一细胞核DNA序列相似的第一 DNA序列，与相应第二细胞核DNA序列相似的第二 DNA序列，和在该转化结构中第一和第二 DNA序列之间插入的感兴趣的DNA序列。可对位于相应第一和第二细胞核DNA序列之间的目标DNA序列进行转化，从而以感兴趣的DNA序列取代目标DNA序列。在进一步的实施例中，感兴趣的DNA序列可能包括抗生素抗性标记，启动子序列和抗生素抗性标记，或者代谢物营养同化或者生物合成基因。该海藻细胞的表型特征可能被改变或者获得新的特征。本发明提供并例举了一种转化结构，该转化结构具有与相应第一海藻细胞核DNA序列相似的第一 DNA序列，与相应第二海藻细胞核DNA序列相似的第二 DNA序列，和在该转化结构中第一和第二 DNA序列之间插入的感兴趣的DNA序列。根据进一步的实施例，感兴趣DNA序列可以包含削弱或者破坏代谢物营养同化或生物合成基因的野生型功能的DNA。
图I显示，根据实施例之一，如何用例举的脱氧核糖核酸(DNA)序列向海藻细胞核导入DNA。图2是一个流程图，例举一种海藻细胞核基因组同源重组的方法。
图3显示一例DNA序列()，该序列包括硝酸盐还原酶基因的至少一部分。图4显示一例转化结构(2)，其中包含硝酸盐还原酶DNA序列作为转化结构的两侧序列。图5是显示几个转化株分子遗传学分析结果的凝胶照片。发明的详细描述图I显示，根据实施例之一，如何用例举的脱氧核糖核酸(DNA)序列向海藻细胞核导入DNA。图I中显示了一个转化结构110，海藻细胞核DNA 120，和转化了的转化海藻细胞核 DNA 130。转化结构110包含第一 DNA序列A’，其在长度和序列上与海藻细胞核 DNA 120中的第一海藻细胞核DNA序列A相似。转化结构110包含第二 DNA序列C’，其在长度和序列上与海藻细胞核DNA 120中的第二海藻细胞核DNA序列C相似。转化结构110还包含感兴趣DNA序列X，其插在转化结构110的第一 DNA序列A’和第二 DNA序列C’之间。在一例将DNA导入海藻细胞细胞核方法中，制备诸如示例性转化结构110这样的转化结构。然后，可用转化结构110来转化位于细胞核DNA 120的第一序列A和第二序列C中间的目标DNA序列B，导致目标DNA序列B被感兴趣DNA序列X所取代。在各种实施例中，分别与对应的细胞核DNA120中第一序列A和/或第二序列C相似的第一 DNA序列AIP /或第二 C’DNA序列可以是任意碱基对(bps)长度的，范围从大约Obps到大约10，000bps，或者更长。另外，第一 DNA序列A’在碱基对长度上与第二 DNA序列C’可以相同也可以不同。各种实施例中，在细胞核DNA 120第一序列A和第二序列C之间的目标DNA序列B可以是任意碱基对(bps)长度的，范围从大约Obps到大约10，000bps，或者更长。一些实施例中，感兴趣DNA序列X可以把转化结构110的第一序列A’和第二序列C’以小至约0bps、大至约10，OOObps的间距隔开。感兴趣DNA序列X可以包含各种序列，比如调控序列或者启动子序列(单向的或者双向的)，抗生素抗性标记，或者可以包含启动子序列和一个抗生素抗性标记。另一些实施例中，感兴趣DNA序列X可以包含代谢物营养同化或生物合成基因。比如，感兴趣DNA序列X可以包含编码硝酸盐还原酶或者亚硝酸盐还原酶的基因。各种实施例中，感兴趣DNA序列X可以而非必需编码多肽的至少一部分。在一些例子中，感兴趣DNA序列X可以只被转录，但是不被翻译成多肽。在其他的实例中，感兴趣DNA序列X编码的肽添加到到第一细胞核DNA序列A或者第二细胞核DNA序列C所编码的肽。感兴趣DNA序列X也可以编码非编码的调控DNA序列。在各种实施例中，感兴趣DNA序列X的长度可以与细胞核DNA 120的目标DNA序列B不相似。比如，感兴趣DNA序列X可能长约Odps，造成目标DNA序列B的缺失或者近乎缺失，如同在转化海藻细胞核DNA 130中那样。一些实施例中，可用转化结构110来转化位于细胞核DNA 120的第一序列A和第二序列C之间的目标DNA序列B，导致目标DNA序列B被感兴趣DNA序列X所取代。细胞核DNA 120可以是微拟球藻(Nannochloropsis)基因组的至少一部分。并且,所述微拟球藻的基因组可以是单倍体基因组。这里所述的转化方法可以用来改变海藻细胞的表型特征来从而赋予其新的特征。比如，所述用感兴趣DNA序列X取代的目标DNA序列B可以是至少部分取代，使得目标DNA序列的基因功能部分降低。另一些实施例中，感兴趣DNA序列X包含削弱或者破坏目标基因B的野生型功能的DNA，所述野生型功能原本代谢物生物合成或营养同化作用所需。相反地，也可以用感兴趣DNA序列X通过转化把代谢物生物合成或者营养同化基因削弱了或者破坏了的野生型功能还原成野生型功能。比如，可以用感兴趣DNA序列X转化营养缺陷型海藻细胞，导致代谢物的生物合成或营养同化。这种转化株可以通过在不含该代谢物的液体或者固体培养基中局限培养来挑选，即所述培养基不含转化了的营养缺陷型海藻细胞生长所必需的的该代谢物。图2是一个流程图，显示一例海藻细胞核基因组同源重组的方法。在210步骤中，制备一个转化结构。在实施例之一中，转化结构110 (图I)包含第一 DNA序列A’，其与海藻细胞核DNA 120(图I)中的第一海藻细胞核DNA序列A相似。转化结构110还可以包含第二 DNA序列C’，其与海藻细胞核DNA 120中的第二海藻细胞核DNA序列C相似。转化结构110可以包含感兴趣DNA序列X，插入在转化结构110 DNA的第一序列A’和第二序列C’之间。
在220步骤中，细胞核DNA的目标序列被转化。各种实施方式中，可用转化结构110来转化细胞核DNA 120的第一序列A和第二序列C之间的目标序列，导致目标DNA序列B被感兴趣DNA序列X所取代。在230步骤中，挑选转化细胞。比如，可用感兴趣DNA序列X转化营养缺陷型海藻细胞，引起某代谢物的生物合成或营养同化作用。这种转化株可以通过在不含该代谢物的液体或者固体培养基中培养来挑选，即所述培养基不包含转化了的营养缺陷型海藻细胞生长所必需的该代谢物。
实施例。为了检测微拟球藻中同源重组的机率，发明者发明了一种转化结构，该结构使用了选择标记(博来霉素基因)，其左右两侧各有一个硝酸盐还原酶DNA序列。图3显示一例DNA序列()，该序列至少包括硝酸盐还原酶基因的一部分。图3中，左侧硝酸盐还原酶DNA序列标记为310，右侧硝酸盐还原酶DNA序列标记为320。如下文所述，在310和320中间的内源硝酸盐还原酶基因的DNA序列315将被转化结构上的DNA序列所取代。图4显示一例转化结构(2)，包含用来制造转化结构两侧序列的硝酸盐还原酶DNA序列。图4显示左侧硝酸盐还原酶DNA序列310’，选择标记盒NT7 410，和右侧硝酸盐还原酶DNA序列320’。选择标记盒NT7 410包含紫黄质一叶绿素结合蛋白(“Vcp”)3’UTR，博来霉素抗性序列，和Vcp启动子序列。Vcp启动子和Vcp 3’UTR DNA序列来自两个不同的Vcp基因簇，参见2009年6月8日提交的标题为“海藻细胞转化的基于VCP的载体”的第12/480，635号美国非临时申请。包含Vcp启动子、博来霉素抗性序列和Vcp 3’ UTR的NT7盒以反平行式插入到左侧硝酸盐还原酶310’和硝酸盐还原酶320’之间。方案使用的引物。Vcp ble UTR与NR的同源重组，反向，一个外显子部分缺失P311 NR 左侧正向引物AGTCGTAGCAGCAGGAATCGACAA。
P311 NR左侧反向引物GGCACACGAGATGGACAAGATCAGTGGAATAATGAGGCGGACAGGGAA。P313 NR右侧正向引物GTGCCATCTTGTTCCGTCTTGCTTGCGCAAGCCTGAGTACATCATCAA。P314 NR 右侧反向引物ATGACGGACAAATCCTTACGCTGC。P215 NT7 互补正向引物AAGCAAGACGGAACAAGATGGCAC。P119 PL38 3UTR 折返引物CTGATCTTGTCCATCTCGTGTGCC。用Takara Taq运行PCR来生成NR两侧序列和插入盒。用P311和P312从gNDA扩增左侧序列LF(IkB)。用P313 和 P314 从 gNDA 扩增右侧序列 RF (I. 04kB)。 (注两侧序列都包括来自312和313引物的与NT7的连接区域。)用P215 和 Pl 19 从 NT7 扩增插入结构 IC (I. 817kB)。所有的PCR产物都进行凝胶纯化。LF，1C，RF片段用下面的PCR来连接。全部100 微升 PCR RXN170 纳克 LF，170 纳克 1C，与 P311 和 P215(2. 817kB)作融合 PCR，得 LF-IC。170 纳克 RF，170 纳克 1C，与 P119 和 Ρ314(2· 821kB)作融合 PCR，得 RF-IC。各片段用凝胶纯化后直接用于最后的PCR。170 纳克 LF-IC 与 170 纳克 RF-IC，与 P311 和 P314 一起做 PCR。从凝胶中回收3. 8kB的DNA片段，直接用于转化。转化200纳克DNA片段(见上文)用于此前描述的转发方法。区别在于将细胞培养在包含氯化铵的F2培养基(用2mM氯化铵代替硝酸盐)中。转化后涂板前的恢复也用2mM氯化铵培养基进行。细胞涂在含2mM氯化铵(而不是2mM硝酸盐(N03_))的F2 (包括吉欧霉素)的平板上。所有的培养基都有50%盐度，与海水相当。挑选。选择200个克隆，重新悬浮在100微升缺氮F2培养基中，并点样在含有不同氮源的方形平板(F2培养基)上。没有氮2mM 的 No2_2mM 的 N03-2mM 的 NH4C1绝大多数克隆不能在含硝酸盐的培养基上生成(变黄指示氮缺乏；硝酸盐还原酶敲除突变株不能在以硝酸盐作为唯一氮源的培养基上生长)，但是所有克隆在亚硝酸盐和氯化铵平板上生长同样地良好。并且，在硝酸盐平板上生长抑制的克隆在外观上不能区别于氮缺乏(没有氮)平板上的细胞(转化的或者没有转化的)，表明转化株在硝酸盐平板上的生长阻滞是由于不能使用硝酸盐作为氮源。野生株和硝酸盐还原酶无关转化突变株都从未出现在含硝酸盐作为唯一氮源的琼脂平板上的生长阻滞，表明克隆的硝酸盐还原酶基因失活。结果。
图5是显示对几个转化株的分子遗传学分析的凝胶照片。分析了 192个克隆。其中，目测筛出176个克隆明显地具有硝酸盐还原酶缺陷。还对克隆进行了 PCR分析。图5中的凝胶照片显示了几个转化株(标记为1，2，7，9，11和12)的分子遗传学分析。克隆2和12已被认定能够在以硝酸盐为唯一氮源上生长，而克隆1，7，9和11则不能，表明硝酸盐还原酶被破坏。用于PCR遗传学分析的引物从野生型基因获得一个较小的DNA片段，而从突变基因则获得一个较大的DNA片段，所述突变基因包含插入的大挑选标记。1，7，9和11号泳道只显示一个条带，该条带对应于与含有期望插入片段的硝酸盐还原酶基因座。2号和12号泳道显示两个条带一小条带是内源硝酸盐还原酶基因，大条带则是转化结构片段，该转化结构片段被插入到基因组的其它位置，不在硝酸盐还原酶基因座内。测序。用测序来检验重组后是否引入了错误。对6个克隆进行了 PCR分析，并且对包括两侧末端(左侧5’末端和右侧3’末端)在内的两侧序列进行了测序。没有发现错误。还从转化株(硝酸盐还原酶内插入了 ble基因盒)中扩增出了整个基因座，并且成功用于对野生型进行重复转化。发明人还成功地使用野生型硝酸盐还原酶片段作为选择标记通过同源重组修复了敲除突变野生型片段与硝酸盐还原酶基因内的ble基因插入部位重合并置换了该基因。只有那些硝酸盐还原酶基因被同源重组修复的克隆能够在以硝酸盐为唯一氮源的培养基上生长。尽管以上描述了多个实施方式，但应理解，它们仅是示例，并不构成限制。因此，优选实施方式的范围不应受任何以上所述示例性实施方式的限制。
权利要求
1.一种把脱氧核糖核酸(DNA)引入海藻细胞细胞核的转化方法，该方法包括 制备转化结构，该结构具有与相应第一细胞核DNA序列相似的第一 DNA序列，与相应第二细胞核DNA序列相似的第二 DNA序列，和在该转化结构中第一和第二 DNA序列之间插入的感兴趣的DNA序列，并且 转化相应第一和第二细胞核DNA之间的目标DNA序列，使得目标DNA序列被感兴趣的DNA序列所取代。
2.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列把分别与相应第一和第二细胞核DNA序列相似的所述第一和第二 DNA序列隔开大约4. 5kb。
3.如权利要求I所述的方法，其特征在于，分别与相应第一或第二细胞核DNA序列相似的所述第一或第二 DNA序列包含大约1000碱基对(bps)。
4.如权利要求I所述的方法，其特征在于，分别与相应第一或第二细胞核DNA相似的所述第一或第二 DNA序列包含少于大约1000碱基对。
5.如权利要求I所述的方法，其特征在于，分别与相应第一或第二细胞核DNA序列相似的所述第一或第二 DNA序列包含多于大约1000碱基对。
6.如权利要求I所述的方法，其特征在于，分别与相应第一或第二细胞核DNA序列相似的所述第一或第二序列DNA包含多于大约10，000碱基对。
7.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列还包含调控序列或启动子序列。
8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述启动子是单向的或双向的。
9.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列还包含抗生素抗性标记。
10.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列还包含启动子序列和抗生素抗性标记。
11.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列还代谢物生物合成或营养同化基因。
12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，所述基因编码硝酸盐还原酶或者亚硝酸盐还原酶。
13.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列大约0bps，使得目标DNA的缺失或者近乎缺失。
14.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列编码多肽。
15.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列被转录，但是不编码多肽。
16.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列编码肽，所编码的肽添加到由第一或者第二细胞核DNA序列编码的肽。
17.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列编码非编码调控DNA序列。
18.如权利要求I所述的方法，其特征在于，目标DNA序列与感兴趣DNA序列不相似。
19.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述海藻细胞是微拟球藻细胞。
20.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述海藻细胞是单倍体。
21.如权利要求I所述的方法，其特征在于，所述方法还包括改变所述海藻细胞的表型特征或者赋予所述海藻细胞新特征。
22.如权利要求I所述的方法，其特征在于，与相应第一细胞核DNA序列相似的第一DNA序列具有第一个碱基对长度，与相应第二细胞核DNA序列相似的第二 DNA序列具有第二个碱基对长度，两者不相等。
23.如权利要求I所述的方法，其特征在于，目标DNA序列少于lkb。
24.如权利要求I所述的方法，其特征在于，目标DNA序列被感兴趣DNA序列取代至少是部分取代，使得目标DNA序列的基因功能部分降低。
25.一种转化结构，该结构具有与相应第一海藻细胞细胞核DNA序列相似的第一 DNA序列，与相应第二海藻细胞细胞核DNA序列相似的第二 DNA序列，和在该转化结构中第一和第二DNA序列之间插入的感兴趣的DNA序列。
26.如权利要求I所述的方法，其特征在于，分别与相应第一和第二细胞核DNA序列相似的所述第一和第二序列DNA各自包含大约1000碱基对(bps)。
27.如权利要求I所述的方法，其特征在于，分别与相应第一和第二细胞核DNA序列相似的所述第一和第二序列DNA各自包含少于大约1000碱基对。
28.如权利要求I所述的方法，其特征在于，分别与相应第一和第二细胞核DNA序列相似的所述第一和第二 DNA序列各自包含多于大约1000碱基对。
29.如权利要求I所述的方法，其特征在于，分别与相应第一和第二细胞核DNA序列相似的所述第一和第二 DNA序列各自包含多于大约10，000碱基对。
30.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列还包含削弱或者破坏代谢物生物合成或营养同化基因的野生型功能的DNA。
31.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列转化营养缺陷型海藻细胞，引起代谢物的生物合成或者同化作用。
32.如权利要求31所述的方法，该方法还包括通过在培养基中培养来挑选被转化的营养缺陷型海藻细胞，所述培养基不包含被转化营养缺陷型海藻细胞生长所必需的代谢物。
33.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述基因编码硝酸盐还原酶或者亚硝酸盐还原酶。
34.如权利要求30所述的方法，其特征在于，所述方法还包括将所述营养同化或生物合成基因被削弱或破坏的野生型功能转化并还原成野生型功能。
35.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列把分别与相应第一和第二细胞核DNA序列相似的所述第一和第二序列DNA隔开大约200bps。
36.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列把分别与相应第一和第二序列细胞核DNA相似的所述第一和第二 DNA序列隔开大约10. Okb。
37.如权利要求I所述的方法，其特征在于，至少感兴趣DNA序列的一部分编码多肽。
38.如权利要求I所述的方法，其特征在于，分别与相应第一或第二细胞核DNA序列相似的所述第一或第二 DNA序列的碱基对长度约为I个碱基对到约10000碱基对。
39.如权利要求I所述的方法，其特征在于，感兴趣DNA序列的碱基对长度约为I个碱基对到约10000碱基对。
40.如权利要求32所述的方法，其特征在于，所述培养基是固体或者液体。
全文摘要
本文提供对向海藻细胞细胞核转入脱氧核糖核酸(DNA)的转化方法。可以制备这样一个转化结构，该结构有与相应第一细胞核DNA序列相似的第一DNA序列，与相应第二细胞核DNA序列相似的第二DNA序列，和在该转化结构中第一和第二DNA序列之间插入的感兴趣的DNA序列。可对相应的第一和第二核DNA之间的目标DNA序列进行转化，从而使得该目标DNA序列被感兴趣的DNA序列所取代。本发明还提供一个示例性转化结构，该转化结构有与相应第一海藻细胞核DNA序列相似的第一DNA序列，与相应第二海藻细胞核DNA序列相似的第二DNA序列，和插入在该转化结构中第一和第二DNA序列之间的感兴趣的DNA序列。
文档编号C12P19/34GK102858980SQ201080058106
公开日2013年1月2日 申请日期2010年10月19日 优先权日2009年10月19日
发明者O·基利安, B·维克 申请人:奥罗拉藻类股份有限公司