本申请属于化学合成
技术领域：
，具体地说，涉及一种tubulysin家族化合物中间体tup的合成方法。
背景技术：
：tup是天然抗癌药物tubulysin家族化合物(结构式如下)的关键中间体(虚线圈内区域所示)。表tubulysins家族分子的结构式2000年，等人(sasse,f.；steinmetz,h.；heil,j.；g.；reichenbach,h.j.antibiot.2000,53,879.)首次报导了一种从粘细菌中分离提取的线性四肽小分子。由于它们主要作用在细胞的微管蛋白细胞骨架(tubulincytoskeleto)上，因此把这一类化合物命名为tubulysins。研究发现，tubulysins不仅具有很高的抗癌活(n14-desacetoxytubulysinh的ic50约为紫杉醇的100-5000倍，为埃博霉素b的10倍以上)，而且能够有效地抑制耐药性癌细胞的生长，但它的具体作用机理却是与埃博霉素和紫杉醇相反，即促进微管蛋白的聚合。长春碱的作用机理虽与其相似，但活性差很多。另外，kaur等人(g.kaur,m.hollingshead,s.holbeck,etal.biochem.j.2006,396,235-242.)还发现tubulysins还具有抑制血管新生的作用。此外，在水溶性方面tubulysins相比其它抗癌药物有着明显的优势，其对特定的癌细胞表现出超强的抗癌活性，使其成为新型抗癌新药研发中颇受关爱的目标分子之一。tup的化学结构式：目前关于tup的合成方法，国内外文献报道还不是很多，主要有以下几种路线：1)2013年，意大利化学家matteozanda小组(org.biomol.chem.,2013,11,2273–2287)报道化合物2和3首先发生wittig反应得到了化合物4，接着用钯碳加氢还原碳碳双键得到了5和6的混合物，它们的比例是1:2。然后将分离得到的6在强酸作用下水解得到tup。该路线立体选择性不高，难以应用。反应路线如下：2)2010年，日本化学家osamutamura小组(chem.eur.j.2010,16,11678-11688)报道了化合物8和9首先发生evans羟醛缩合反应得到了化合物10，接着通过barton-mccombie脱羟基反应得到化合物11。最后脱保护得到tup。该路线立体选择性非常好，但使用了价格昂贵且对水分高度敏感的三氟甲磺酸二正丁基化硼(bu2botf)；该步羟醛缩合反应的可重复性不好，操作不方便。而且下一步还使用了剧毒的氢化锡试剂，故该路线实际应用意义不大。反应路线如下：3)2006年jonathana.ellman小组(j.am.chem.soc.,2006,128(50):16018-16019)报道了在二碘化钐(smi2)的诱导下，化合物13和14发生加成反应立体选择性地得到化合物15，然后脱保护得到tup。但是该路线立体选择性并不高，得到了比例80:15:3:2四种异构体。实际意义不大。反应路线如下：4)2004年peterwipf等人(org.lett.,2004,6(22):4057-4060)报道化合物2和16发生wittig反应得到了化合物17，接着用氢氧化钠水解乙酯，钯碳加氢还原碳碳双键以及用硼氢化钠还原混酐得到了17和17’的混合物，它们的比例是3:1。该路线立体选择性也不高，难以应用。反应路线如下：5)2013年南开大学陈悦教授(chem.asianj.2013,8,1213-1222)报道以化合物18为原料，首先用臭氧切断末端双键得到化合物19，接着与(s)-叔丁基亚磺酰胺20反应得到化合物21，然后与格氏试剂苄基氯化镁反应得到化合物22，最后用盐酸回流得到tup。该路线立体选择性相对较好，d.r.值达到了9.6:1，但实验操作麻烦，难以实现大规模制备。根据目前文献报道的制备tup的方法，这些方法虽然各有特点，但存在很多不足：如试剂价格昂贵，立体选择性不好，操作很不方便。另外，路线及反应时间较长等。而目前文献从l-苯丙氨酸制备tup的方法的还未见报道。技术实现要素：有鉴于此，本申请提供了一种tubulysin家族化合物中间体tup的合成方法。为了解决上述技术问题，本申请公开了一种tubulysin家族化合物中间体tup的合成方法，其合成路线如下：包括以下步骤：步骤1、先用l-苯丙氨酸制得l-苯丙氨醇23；步骤2、合成化合物24：将步骤1所得化合物23溶于甲醇，加入苯甲醛，加热回流反应，然后加硼氢化钠反应，减压浓缩、淬灭反应调整溶液ph、萃取，合并有机相，干燥，减压浓缩，加入四氢呋喃/水混合溶剂，加入碳酸氢钠固体和氯甲酸苄酯，于室温下反应并进行快速柱层析得到化合物24；步骤3、合成化合物25：将步骤2所得化合物24溶于dmso中，水浴冷却下加入三乙胺和三氧化硫-吡啶复合物，发生氧化反应；加入二氯甲烷中，加入wittig试剂乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦，于室温下搅拌通过wittig反应，然后进行快速柱层析得到化合物25；步骤4、化合物26的合成：将步骤3所得化合物25溶于甲醇，冰水浴冷却下加入六水合氯化镍和硼氢化钠，于0℃搅拌反应得到化合物26；步骤5、化合物27的合成：将步骤4所得化合物26溶于甲醇/四氢呋喃/水混合溶剂中，冰水浴冷却下加入氢氧化锂，再于室温反应；加入二氯甲烷，(s)-4-苄基-2-恶唑烷酮，edci和dmap发生缩合反应得到化合物27；步骤6、化合物28的合成：在氮气保护下，将步骤5所得化合物27溶于无水四氢呋喃中，-78℃冷却下加入nahmds，再滴加碘甲烷，缓慢升到室温反应，能够立体专一性地得到化合物28；步骤7、终产物tup的合成：将步骤6所得化合物28溶于四氢呋喃/水混合溶剂，冰水浴冷却下加入30％双氧水和氢氧化锂，再于室温反应；然后加入甲醇及10％钯碳催化剂，然后在氢气球下压力下反应得到终产物tup。可选地，所述步骤2中的化合物23：苯甲醛：硼氢化钠：碳酸氢钠：氯甲酸苄酯的摩尔比为1：1-1.05：2-4：3-5：1-1.05；化合物23和苯甲醛的反应时间为3-5h；加硼氢化钠反应，减压浓缩、淬灭反应调整溶液ph、萃取，合并有机相，干燥，减压浓缩具体为：分批慢加硼氢化钠，然后于室温下搅拌反应2-5h，减压浓缩，加稀盐酸淬灭反应，再加氢氧化钠水溶液碱化至溶液的ph＝10，二氯甲烷取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到粗品；加入四氢呋喃/水混合溶剂、碳酸氢钠固体和氯甲酸苄酯，于室温下反应并进行快速柱层析得到化合物24具体为：加入四氢呋喃/水混合溶剂，同时加入碳酸氢钠，搅拌均匀后用冰水浴冷却到0℃，缓慢滴加氯甲酸苄酯，30min后升到室温搅拌反应10h-15h，减压浓缩，加水稀释，二氯甲烷萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物24，其中，洗脱液为体积比为10:1的石油醚和乙酸乙酯。可选地，所述步骤3中的化合物24：三乙胺：三氧化硫-吡啶复合物：乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦的摩尔比为1：3-3.5：3-3.5：1-1.5；将步骤2所得化合物24溶于dmso中，水浴冷却下加入三乙胺和三氧化硫-吡啶复合物，发生氧化反应具体为：将化合物24溶于dmso，水浴冷却下加入三乙胺和三氧化硫-吡啶复合物，于室温下搅拌反应2-5h后，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用1m的khso4溶液洗，水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，过滤浓缩抽干；加入二氯甲烷、加入wittig试剂乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦，于室温下搅拌通过wittig反应，然后进行快速柱层析得到化合物25具体为：加入二氯甲烷及乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦，于室温下搅拌反应8h-12h后，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物25，其中，洗脱液为体积比为20：1的石油醚和乙酸乙酯。可选地，所述步骤4中化合物25：六水合氯化镍：硼氢化钠的摩尔比为1：3-5：3-4；将步骤3所得化合物25溶于甲醇，冰水浴冷却下加入六水合氯化镍和硼氢化钠，于0℃搅拌反应得到化合物26具体为：将化合物25溶于甲醇，冰水浴冷却到0℃，加入六水合氯化镍，搅拌均匀后分批缓慢加入硼氢化钠，加毕继续在0℃下反应30min，加饱和氯化铵水溶液淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物26，其中，洗脱液为体积比为20：1的石油醚和乙酸乙酯。可选地，所述步骤5中化合物26：氢氧化锂：(s)-4-苄基-2-恶唑烷酮：edci：dmap的摩尔比为1：5-20：1-1.5：3-6：3-6；化合物27的合成具体为：将化合物26溶于甲醇/四氢呋喃/水混合溶剂,冰水浴冷却下加入一水合氢氧化锂固体，30min后升到室温搅拌反应1-5h，冰水浴冷却，加稀盐酸酸化至溶液的ph＝2，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩；加入无水二氯甲烷、(s)-4-苄基-2-恶唑烷酮、edci和dmap，在氮气保护下搅拌反应12-20h，加水淬灭反应，二氯甲烷萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物27，其中，洗脱液为体积比为4：1的石油醚和乙酸乙酯。可选地，所述步骤6中化合物27：nahmds：碘甲烷的摩尔比为1：2-3：2-4；化合物28的合成具体为：在氮气保护下，将化合物27溶于干燥的四氢呋喃，干冰-丙酮浴冷却到-78℃，加入nahmds，反应0.5-1h后滴加碘甲烷，在-78℃下反应2-4h，然后缓慢升到室温反应10-20h；加饱和氯化铵水溶液淬灭反应，乙酸乙酯萃取三次，合并有机相用水洗，饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液快速柱层析得化合物28，其中，洗脱液为体积比为5：1的石油醚和乙酸乙酯。可选地，所述步骤7中化合物28：30％双氧水：氢氧化锂：10％钯碳的摩尔比为1：5-15：5-15：0.2-1；将步骤6所得化合物28溶于四氢呋喃/水混合溶剂，冰水浴冷却下加入30％双氧水和氢氧化锂，再于室温反应得到具体为：将化合物28溶于四氢呋喃/水混合溶剂，冰水浴冷却下加入30％双氧水和一水合氢氧化锂固体，30min后升到室温搅拌反应2-4h，冰水浴冷却，加饱和亚硫酸钠水溶液淬灭反应，减压浓缩，加稀盐酸酸化至溶液的ph＝1，乙酸乙酯萃取三次，合并的有机相用饱和食盐水洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品；将上述粗品溶于甲醇，加入10％钯碳催化剂，然后在氢气球下压力下反应得到终产物tup具体为：将上述粗品溶于甲醇，加入10％钯碳催化剂，抽气换气三次，在氢气球压力下搅拌反应10-15h，过滤，滤渣用甲醇洗，滤液减压浓缩将溶剂去掉，将浓缩残留物溶于水，水相用二氯甲烷洗三次，去掉有机相，将水相减压浓缩得到终产物tup。与现有技术相比，本申请可以获得包括以下技术效果：1)本发明的制备方法符合绿色化学标准：利用可再生性资源、可回收、所用试剂毒性较小、反应经处理后对环境污染很小等。2)本发明总产率高、立体选择性非常好、成本低、分离纯化简单方便、可用于大量制备。3)本发明选用l-苯丙氨酸为起始原料，经过七步反应制备出终产物tup；该路线立体选择性非常好，总产率高，解决了文献中普遍存在的立体选择性不高的问题，并且大大简化了反应步骤，缩短了反应周期。当然，实施本申请的任一产品必不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。具体实施方式以下将配合实施例来详细说明本申请的实施方式，藉此对本申请如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。实施例1tubulysin家族化合物关键中间体tup的合成方法，其合成路线如下：包括以下步骤：步骤1、化合物24的合成，命名为：(s)-苄基苄基(1-羟基-3-苯基丙烷-2-基)氨基甲酸酯；其结构式如下所示：包括以下步骤：首先按文献(organicletters,2012,14(21):5396-5399)制得化合物23。将化合物23(40g,264.5mmol)溶于甲醇(500ml)，加入苯甲醛(26.7ml,264.5mmol)，加热回流反应3h后，冰水浴冷却到0℃，分批慢加硼氢化钠(30.4g,0.8mol)，然后于室温下搅拌反应5h，减压浓缩，加稀盐酸淬灭反应，再加氢氧化钠水溶液碱化至溶液的ph＝10，二氯甲烷(300ml)萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩。然后加入四氢呋喃/水(1:1，500ml)混合溶剂，同时加入碳酸氢钠(67.2g,8.0mol)，搅拌均匀后用冰水浴冷却到0℃，缓慢滴加氯甲酸苄酯(37.2ml,264.5mmol)，30min后升到室温搅拌反应12h，减压浓缩，加水(200ml)稀释，二氯甲烷(300ml)萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝10：1为洗脱液快速柱层析得化合物24，为无色液体84.4g，两步产率85％。合成的化合物24，经1hnmr,13cnmr,hrms检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]d25-65(c0.5,chcl3)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.42–7.01(m,15h),5.21(dd,j＝22.7,12.0hz,2h),4.49(d,j＝15.7hz,1h),3.97(d,j＝15.3hz,1h),3.72(m,3h),2.91(d,j＝87.6hz,2h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ157.12,138.63,137.98,136.45,129.16,128.67,128.54,128.12,127.97,127.55,127.46,16.45,67.43,64.00,63.21,51.86,34.95；hr-esimsm/z:calculatedforc24h25no3+[m+h]+:376.1834,found376.1887.步骤2、化合物25的合成，命名为(s,e)-4-(苄氧基羰基)-5-苯基戊-2-烯酸乙酯，其结构式如下所示：包括以下步骤：将化合物24(60g,160mmol)溶于dmso(200ml)，水浴冷却下加入三乙胺(66.7ml,480mmol)和三氧化硫-吡啶复合物(76.4g,480mmol)，于室温下搅拌反应3h后，加水(400ml)淬灭反应，二氯甲烷(300ml)萃取三次，合并有机相用1m的khso4溶液(200ml)洗，水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，过滤浓缩抽干。然后加入二氯甲烷(400ml)，同时加入乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦(66.9g,192mmol)，于室温下搅拌反应10h后，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝20：1为洗脱液快速柱层析得化合物25为无色液体58.2g，两步产率82％。步骤3、化合物26的合成，命名为(r)-4-(苄氧基羰基)-5-苯基-戊酸乙酯，其结构式如下所示：包括以下步骤：将化合物25(58.2g，131.2mmol)溶于甲醇(300ml)，冰水浴冷却到0℃，加入六水合氯化镍(15.6g，65.6mmol)，搅拌均匀后分批缓慢加入硼氢化钠(15.0g，393.6mmol)，加毕继续在0℃下反应30min，加饱和氯化铵水溶液(300ml)淬灭反应，二氯甲烷(200ml)萃取三次，合并有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝20：1为洗脱液快速柱层析得化合物26为油状物49.7g，产率85％。合成的化合物26，经1hnmr,13cnmr,hrms检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]d25-26.6(c1,ch2cl2)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.53–6.93(m,15h),5.18(d,j＝6.6hz,2h),4.34(dd,j＝56.0,47.2hz,2h),4.05(d,j＝6.6hz,3h),3.08–2.64(m,2h),2.26–1.72(m,4h),1.20(d,j＝6.6hz,3h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ172.59,156.75,155.55,138.15,136.18,128.63,127.93,127.71,127.60,127.43,127.24,126.71,125.86,67.03,66.53,59.80,58.96,49.02,39.93,39.06,30.78,30.64,27.23,26.59,13.68；hr-esimsm/z:calculatedforc28h31no4+[m+h]+:446.2253,found446.2292.步骤4、化合物27的合成，命名为苄基苄基((r)-5-((s)-4-苄基-2-氧代恶唑烷-3-基)-5-氧代-1-苯基-戊-2-基)氨基甲酸酯，其结构式如下所示：包括以下步骤：将化合物26(35g，78.6mmol)溶于甲醇/四氢呋喃/水混合溶剂(1:1:1,300ml),冰水浴冷却下加入一水合氢氧化锂固体(33g，786mmol)，30min后升到室温搅拌反应3h，冰水浴冷却，加稀盐酸酸化至溶液的ph＝2，乙酸乙酯(200ml)萃取三次，合并有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩。然后加入无水二氯甲烷(200ml)，同时加入(s)-4-苄基-2-恶唑烷酮(18.1g,102.2mmol)，edci(60.4g,315mmol)和dmap(38.5g,315mmol)，在氮气保护下搅拌反应18h，加水(300ml)淬灭反应，二氯甲烷(200ml)萃取三次，合并有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝4：1为洗脱液快速柱层析得化合物27为油状物34.0g，产率75％。合成的化合物27，经1hnmr,13cnmr,hrms检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]d25+6.6(c1,ch2cl2)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.45–6.99(m,20h),5.16(dd,j＝27.6,12.7hz,2h),4.58–4.29(m,2h),4.22–3.79(m,4h),3.25–2.95(m,2h),2.97–2.45(m,5h),2.17–1.84(m,2h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ172.04,155.46,155.23,152.76,138.28,136.27,134.89,128.89,128.66,128.46,127.96,127.89,127.53,127.39,126.83,126.55,125.84,67.07,66.51,65.59,58.73,54.50,39.93,38.93,37.42,31.87,31.59,26.43,25.81；hr-esimsm/z:calculatedforc36h36n2o5+[m+h]+:577.2624,found577.2690.步骤5、化合物28的合成，命名为苄基苄基((2r,4s)-5-((s)-4-苄基-2-氧代-恶唑烷-3-基)-4-甲基-5-氧代-1-苯基-戊-2-基)-氨基甲酸酯，其结构式如下所示：包括以下步骤：在氮气保护下，将化合物27(10.0g,17.3mmol)溶于干燥的四氢呋喃(100ml)，干冰-丙酮浴冷却到-78℃，加入nahmds(1.0minthf,35ml)，反应45min后滴加碘甲烷(3.3ml,52mmol)，在-78℃下反应3h，然后缓慢升到室温反应15h；加饱和氯化铵水溶液(200ml)淬灭反应，乙酸乙酯(200ml)萃取三次，合并有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝5：1为洗脱液快速柱层析得化合物28为油状物7.2g，产率70％。合成的化合物28，经1hnmr,13cnmr,hrms检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]d25+97(c0.6,meoh)；1hnmr(400mhz,cdcl3)δ7.37–7.12(m,24h),5.11(d,j＝12.3hz,1h),5.01(d,j＝11.5hz,1h),4.75(s,1h),4.41–4.06(m,4h),3.68(s,1h),3.19(d,j＝10.7hz,1h),2.84(dq,j＝21.4,14.0hz,4h),2.01(dd,j＝21.4,10.3hz,2h),0.94(d,j＝7.0hz,3h)；13cnmr(101mhz,cdcl3)δ176.67,157.17,153.47,138.79,138.06,136.57,135.52,129.45,128.79,128.39,127.73,127.66,127.18,127.03,126.28,67.22,66.26,55.13,54.75,53.40,39.34,38.24,36.32,34.18,18.32；hr-esimsm/z:calculatedforc37h38n2o5+[m+h]+:591.2781,found591.2822.步骤6、终产物tup的合成，命名为(2s,4r)-4-氨基-2-甲基-5-苯基戊酸，其结构式如下所示：包括以下步骤：将化合物28(7.2g，12.2mmol)溶于四氢呋喃/水混合溶剂(1:1,200ml)，冰水浴冷却下加入质量百分含量为30％的双氧水(50ml)和一水合氢氧化锂固体(5.1g，122mmol)，30min后升到室温搅拌反应3h，冰水浴冷却，加饱和亚硫酸钠水溶液(300ml)淬灭反应，减压浓缩，加稀盐酸酸化至溶液的ph＝1，乙酸乙酯(200ml)萃取三次，合并的有机相用饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩；得到粗品；然后加入甲醇(200ml)，同时加入质量百分含量为10％钯碳催化剂(2.0g)，抽气换气三次，在氢气球压力下搅拌反应12h，过滤，滤渣用甲醇(300ml)洗，滤液减压浓缩将溶剂去掉，将浓缩残留物溶于水(400ml)，水相用二氯甲烷(100ml)洗三次，去掉有机相，将水相减压浓缩得到终产物tup。合成的终产物tup，经1hnmr,13cnmr,hrms检测，其产品为纯的化合物，其各性能指标或表征数据如下：[α]d25+4.0(c1,meoh)；1hnmr(400mhz,d2o)δ7.42(ddd,j＝28.7,14.4,7.0hz,5h),3.72–3.58(m,1h),3.09(dd,j＝14.1,6.6hz,1h),3.03–2.88(m,1h),2.74(dd,j＝14.6,7.1hz,1h),2.16–2.01(m,1h),1.86–1.71(m,1h),1.23(d,j＝7.0hz,3h)；13cnmr(101mhz,d2o)δ182.83,138.38,132.40,132.04,130.51,54.20,41.26,38.72,38.38,19.57；hr-esimsm/z:calculatedforc12h17no2+[m+h]+:209.1259,found209.1302.实施例2tubulysin家族化合物关键中间体tup的合成方法，其合成路线如实施例1所示，包括以下步骤：步骤1、化合物24的合成，命名及结构式同实施例1；首先按文献(organicletters,2012,14(21):5396-5399)制得化合物23。将化合物23(200mmol)溶于甲醇(500ml)，加入苯甲醛(200mmol)，加热回流反应3h后，冰水浴冷却到0℃，分批慢加硼氢化钠(400mol)，然后于室温下搅拌反应3h，减压浓缩，加稀盐酸淬灭反应，再加氢氧化钠水溶液碱化至溶液的ph＝10，二氯甲烷(300ml)萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩；加入四氢呋喃/水(1:1，500ml)混合溶剂，同时加入碳酸氢钠(600mol)，搅拌均匀后用冰水浴冷却到0℃，缓慢滴加氯甲酸苄酯(210mmol)，30min后升到室温搅拌反应10h，减压浓缩，加水(200ml)稀释，二氯甲烷(300ml)萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液(石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝10：1)快速柱层析得化合物24，为无色液体84.4g，两步产率82％。合成的化合物24的1hnmr，13cnmr，hrms检测及结果如实施例1所示。步骤2、化合物25的合成，命名及结构式同实施例1；将化合物24(160mmol)溶于dmso(200ml)，水浴冷却下加入三乙胺(560mmol)和三氧化硫-吡啶复合物(560mmol)，于室温下搅拌反应2h后，加水(400ml)淬灭反应，二氯甲烷(300ml)萃取三次，合并有机相用1m的khso4溶液(200ml)洗，水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，过滤浓缩抽干；加入二氯甲烷(400ml)，同时加入乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦(160mmol)，于室温下搅拌反应12h后，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液(石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝20：1)快速柱层析得化合物25为无色液体58.2g，两步产率80％。步骤3、化合物26的合成，命名及结构式同实施例1；将化合物25(150mmol)溶于甲醇(300ml)，冰水浴冷却到0℃，加入六水合氯化镍(750mmol)，搅拌均匀后分批缓慢加入硼氢化钠(600mmol)，加毕继续在0℃下反应30min，加饱和氯化铵水溶液(300ml)淬灭反应，二氯甲烷(200ml)萃取三次，合并有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液(石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝20：1)快速柱层析得化合物26为油状物49.7g，产率81％。合成的化合物26的1hnmr，13cnmr，hrms检测及结果如实施例1所示。步骤4、化合物27的合成，命名及结构式同实施例1；将化合物26(60mmol)溶于甲醇/四氢呋喃/水混合溶剂(1:1:1,300ml)，冰水浴冷却下加入一水合氢氧化锂固体(300mmol)，60min后升到室温搅拌反应1h，冰水浴冷却，加稀盐酸酸化至溶液的ph＝2，乙酸乙酯(200ml)萃取三次，合并有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩；然后加入无水二氯甲烷(200ml)，同时加入(s)-4-苄基-2-恶唑烷酮(60mmol)，edci(180mmol)和dmap(180mmol)，在氮气保护下搅拌反应12h，加水(300ml)淬灭反应，二氯甲烷(200ml)萃取三次，合并有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液(石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝4：1)快速柱层析得化合物27为油状物34.0g，产率77％。合成的化合物27的1hnmr，13cnmr，hrms检测及结果如实施例1所示。步骤5、化合物28的合成，命名及结构式同实施例1；在氮气保护下，将化合物27(20mmol)溶于干燥的四氢呋喃(100ml)，干冰-丙酮浴冷却到-78℃，加入nahmds(40mmol)(1.0minthf,35ml)，反应45min后滴加碘甲烷(40mmol)，在-78℃下反应2h，然后缓慢升到室温反应10h；加饱和氯化铵水溶液(200ml)淬灭反应，乙酸乙酯(200ml)萃取三次，合并有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液(石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝5：1)快速柱层析得化合物28为油状物7.2g，产率69％。合成的化合物28的1hnmr，13cnmr，hrms检测及结果如实施例1所示。步骤6、终产物tup的合成，命名及结构式同实施例1；将化合物28(15mmol)溶于四氢呋喃/水混合溶剂(1:1,200ml)，冰水浴冷却下加入30％双氧水(75ml)和一水合氢氧化锂固体(75mmol)，30min后升到室温搅拌反应2h，冰水浴冷却，加饱和亚硫酸钠水溶液(300ml)淬灭反应，减压浓缩，加稀盐酸酸化至溶液的ph＝1，乙酸乙酯(200ml)萃取三次，合并的有机相用饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩；然后加入甲醇(200ml)，加入10％钯碳催化剂(3mmol)，抽气换气三次，在氢气球压力下搅拌反应10h，过滤，滤渣用甲醇(300ml)洗，滤液减压浓缩将溶剂去掉，将浓缩残留物溶于水(400ml)，水相用二氯甲烷(100ml)洗三次，去掉有机相，将水相减压浓缩得到终产物tup。合成的终产物tup的1hnmr，13cnmr，hrms检测及结果如实施例1所示。实施例3tubulysin家族化合物关键中间体tup的合成方法，其合成路线如实施例1所示，包括以下步骤：步骤1、化合物24的合成，命名及结构式同实施例1；首先按文献(organicletters,2012,14(21):5396-5399)制得化合物23。将化合物23(200mmol)溶于甲醇(500ml)，加入苯甲醛(210mmol)，加热回流反应3h后，冰水浴冷却到0℃，分批慢加硼氢化钠(800mol)，然后于室温下搅拌反应2h，减压浓缩，加稀盐酸淬灭反应，再加氢氧化钠水溶液碱化至溶液的ph＝10，二氯甲烷(300ml)萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩；加入四氢呋喃/水(1:1，500ml)混合溶剂，同时加入碳酸氢钠(1mol)，搅拌均匀后用冰水浴冷却到0℃，缓慢滴加氯甲酸苄酯(200mmol)，30min后升到室温搅拌反应15h，减压浓缩，加水(200ml)稀释，二氯甲烷(300ml)萃取三次，合并有机相，无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液(石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝10：1)快速柱层析得化合物24，为无色液体84.4g，两步产率80％。合成的化合物24的1hnmr，13cnmr，hrms检测及结果如实施例1所示。步骤2、化合物25的合成，命名及结构式同实施例1；将化合物24(160mmol)溶于dmso(200ml)，水浴冷却下加入三乙胺(480mmol)和三氧化硫-吡啶复合物(480mmol)，于室温下搅拌反应5h后，加水(400ml)淬灭反应，二氯甲烷(300ml)萃取三次，合并有机相用1m的khso4溶液(200ml)洗，水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，过滤浓缩抽干；加入二氯甲烷(400ml)，同时加入乙氧甲酰基亚甲基三苯基膦(240mmol)，于室温下搅拌反应8h后，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝20：1为洗脱液快速柱层析得化合物25为无色液体58.2g，两步产率79％。步骤3、化合物26的合成，命名及结构式同实施例1；将化合物25(58.2g，131.2mmol)溶于甲醇(300ml)，冰水浴冷却到0℃，加入六水合氯化镍(15.6g，65.6mmol)，搅拌均匀后分批缓慢加入硼氢化钠(15.0g，393.6mmol)，加毕继续在0℃下反应30min，加饱和氯化铵水溶液(300ml)淬灭反应，二氯甲烷(200ml)萃取三次，合并有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝20：1为洗脱液快速柱层析得化合物26为油状物49.7g，产率83％。合成的化合物26的1hnmr，13cnmr，hrms检测及结果如实施例1所示。步骤4、化合物27的合成，命名及结构式同实施例1；将化合物26(75mmol)溶于甲醇/四氢呋喃/水混合溶剂(1:1:1,300ml),冰水浴冷却下加入一水合氢氧化锂固体(1.5mol)，30min后升到室温搅拌反应5h，冰水浴冷却，加稀盐酸酸化至溶液的ph＝2，乙酸乙酯(200ml)萃取三次，合并有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩；然后加入无水二氯甲烷(200ml)，同时加入(s)-4-苄基-2-恶唑烷酮(112.5mmol)，edci(450mmol)和dmap(450mmol)，在氮气保护下搅拌反应20h，加水(300ml)淬灭反应，二氯甲烷(200ml)萃取三次，合并有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用石油醚：乙酸乙酯＝4：1为洗脱液快速柱层析得化合物27为油状物34.0g，产率71％。合成的化合物27的1hnmr，13cnmr，hrms检测及结果如实施例1所示。步骤5、化合物28的合成，命名及结构式同实施例1；在氮气保护下，将化合物27(51.9mmol)溶于干燥的四氢呋喃(100ml)，干冰-丙酮浴冷却到-78℃，加入nahmds(1.0minthf,35ml)，反应30min后滴加碘甲烷(3.3ml,52mmol)，在-78℃下反应4h，然后缓慢升到室温反应20h；加饱和氯化铵水溶液(200ml)淬灭反应，乙酸乙酯(200ml)萃取三次，合并有机相用水(200ml)洗，饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩，得到粗品，用洗脱液(石油醚：乙酸乙酯(v/v)＝5：1)快速柱层析得化合物28为油状物7.2g，产率66％。合成的化合物28的1hnmr，13cnmr，hrms检测及结果如实施例1所示。步骤6、终产物tup的合成，命名及结构式同实施例1；将化合物28(12.2mmol)溶于四氢呋喃/水混合溶剂(1:1,200ml)，冰水浴冷却下加入30％双氧水(183ml)和一水合氢氧化锂固体(183mmol)，30min后升到室温搅拌反应4h，冰水浴冷却，加饱和亚硫酸钠水溶液(300ml)淬灭反应，减压浓缩，加稀盐酸酸化至溶液的ph＝1，乙酸乙酯(200ml)萃取三次，合并的有机相用饱和食盐水(200ml)洗涤，分液，有机相加无水硫酸钠干燥，减压浓缩；然后加入甲醇(200ml)，同时加入10％钯碳催化剂(12.2g)，抽气换气三次，在氢气球压力下搅拌反应15h，过滤，滤渣用甲醇(300ml)洗，滤液减压浓缩将溶剂去掉，将浓缩残留物溶于水(400ml)，水相用二氯甲烷(100ml)洗三次，去掉有机相，将水相减压浓缩得到终产物tup。合成的终产物tup的1hnmr，13cnmr，hrms检测及结果如实施例1所示。用hplc测产物tup的ee值大于98％，见表1。表1hplc测产物tup的ee值该路线的总产率26.4％关键中间体化合物28的ee值>98％产物tup的ee值>98％如在说明书及权利要求当中使用了某些词汇来指称特定成分或方法。本领域技术人员应可理解，不同地区可能会用不同名词来称呼同一个成分。本说明书及权利要求并不以名称的差异来作为区分成分的方式。如在通篇说明书及权利要求当中所提及的“包含”为一开放式用语，故应解释成“包含但不限定于”。“大致”是指在可接收的误差范围内，本领域技术人员能够在一定误差范围内解决所述技术问题，基本达到所述技术效果。说明书后续描述为实施本申请的较佳实施方式，然所述描述乃以说明本申请的一般原则为目的，并非用以限定本申请的范围。本申请的保护范围当视所附权利要求所界定者为准。还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的商品或者系统不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种商品或者系统所固有的要素。在没有更多限制的情况下，由语句“包括一个……”限定的要素，并不排除在包括所述要素的商品或者系统中还存在另外的相同要素。上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。当前第1页12