一种双荧光筛选β-丙氨酸合成酶的方法与流程

本发明涉及基因工程和酶工程领域，更具体地，涉及β-丙氨酸合成酶的高通量筛选体系构建。

背景技术：

β-丙氨酸主要用于如合成泛酸钙、肌肽、甜味剂、水净化絮凝剂、电镀缓蚀剂等。β-丙氨酸及其衍生物在医药、美容、食品、饲料、化工等领域应用广泛，市场需求日益上升。目前，主要通过化学法进行合成β-ala。但是，化学合成法的工艺要求比较高，产生大量腈类副产物、无机盐等“工业三废”，且副反应较多，不利于产品的分离纯化。生物酶法生产β-丙氨酸更为环保，污染少，符合绿色生产要求，具重要应用前景。

多种微生物来源的β-丙氨酸合成酶编码基因能够在基因工程菌中表达。其中，来自于谷氨酸棒杆菌和枯草芽孢杆菌的β-丙氨酸合成酶(pand)的稳定性和活性相对较高。谷氨酸棒杆菌来源的pand分别克隆到大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌中表达，所产生的粗酶液活性分别可达27μmol/g·h和2073μmol/g·h(dusch,applied&environmentalmicrobiology,1999,65:1530-1539)。大肠杆菌来源的pand酶在催化过程中存在酶失活现象，这可能是与催化活性中心丙酮酰基发生了不可逆的氨基转移引起了酶活性的丧失(greenchemistry,2009,11:1646-1652)。寻找高活性和高稳定性β-丙氨酸合成酶是解决生物法合成β-丙氨酸的关键。

邓思颖等人利用β-丙氨酸与邻二乙酰基苯和巯基乙醇形成的荧光物质表征pand催化转化天冬氨酸的活力，建立了单荧光法高通量筛选pand突变体蛋白(邓思颖等人，生物工程学报，2015,31：1184-93)。然而，该方法所测得pand酶活为发酵液的总酶活，受基因表达条件和细菌生长状态影响较大。另外，该方法采用的培养基为丰富培养基，所形成的荧光背景干扰值较大。本发明在单荧光法的基础上，进一步利用gfp荧光强弱指征pand表达量，从而更加稳定和准确地反映pand酶的比活力，提高了高酶活pand的检出率。此外，本发明采用基本盐培养基，大大降低背景荧光值，提高了酶活检测的灵敏度。

技术实现要素：

本发明目的是提供一种检测β-丙氨酸合成酶比活力的双荧光检测方法，该方法利用重组质粒将β-丙氨酸合成酶编码基因和报告基因置于相同的诱导型启动子下，从而通过报告基因的表达水平检测β-丙氨酸合成酶的表达量；通过测定β-丙氨酸与邻二乙酰基苯和巯基乙醇形成的荧光物质的量确定β-丙氨酸合成酶的总酶活。根据上述两种荧光强度的比值计算β-丙氨酸合成酶的酶活。本发明的另一个目的在于提供上述检测方法在高通量筛选β-丙氨酸合成酶中的应用。

本发明采用的技术方案如下：

本发明提供一种双荧光高通量筛选β-丙氨酸合成酶的方法，所述方法为：将荧光报告基因与β-丙氨酸合成酶基因共同导入宿主菌中，接种含阿拉伯糖的基本盐培养基，在30～37℃诱导培养后，获得发酵液；取发酵液冻融破胞，取破胞液即为粗酶液；取粗酶液(体积记为v2)加入l-天冬氨酸(l-天冬氨酸体积记为v1)，于37℃条件下静置2h进行转化反应将底物转化为β-丙氨酸，取转化液(体积记为v3)在吸收波长355nm和发射波长445nm的条件下测定荧光值，记为r1；取发酵液(体积记为v4)在吸收波长395nm和发射波长509nm的条件下测定荧光值，记为r2；根据公式(1)计算β-丙氨酸合成酶的比活力，筛选获得高活力β-丙氨酸合成酶；

r1：转化液在激发波长355nm和发射波长445nm条件下测得的荧光发射强度；

r2：发酵液在激发波长395nm和发射波长509nm条件下测得的荧光发射强度；

v1：l-天冬氨酸向β-丙氨酸转化检测反应中加入终浓度50g/ll-天冬氨酸体积；

v2：在激发波长355nm和发射波长445nm条件下检测荧光发射强度时加入的粗酶液体积；

v3：l-天冬氨酸向β-丙氨酸转化检测反应中加入的转化液体积；

v4：在激发波长395nm和发射波长509nm条件下检测荧光发射强度时加入的发酵液体积。

所述基本盐培养基组成为：k2hpo4·3h2o14g/l、kh2po45.2g/l、(nh4)2so42g/l、mgso40.3g/l、胰蛋白胨1g/l，溶剂为去离子水，自然ph值，115℃灭菌30min后从高压灭菌锅中取出，冷却至室温后，加入经0.2μm醋酸纤维膜过滤除菌的果糖至浓度为10g/l，混合均匀后备用。

进一步，所述基本培养基中阿拉伯糖加入终浓度为1-10mm，优选10mm。

进一步，所述l-天冬氨酸加入终浓度为50g/l。

进一步，所述粗酶液制备方法为：将发酵液在-80℃快速冷冻30min，37℃融化30min，重复冷冻融化3次，获得粗酶液。

进一步，所述荧光报告基因包括但不限于绿色荧光蛋白编码基因(gfp)，核苷酸序列为seqidno.1所示。

进一步，所述宿主菌为β-丙氨酸合成酶基因缺陷大肠杆菌，所述β-丙氨酸合成酶基因源自枯草芽孢杆菌。

进一步，所述β-丙氨酸合成酶基因与阿拉伯糖启动子连接后再与荧光报告基因共同导入宿主菌，所述连接阿拉伯糖启动子的β-丙氨酸合成酶基因核苷酸序列为seqidno.3所示。

本发明将β-丙氨酸合成酶编码基因pand和荧光报告基因gfp置于相同的诱导型启动子para下构建重组质粒pglo-para-pand；构建β-丙氨酸合成酶缺陷大肠杆菌δpand；采用化学转化方法将pglo-para-pand导入大肠杆菌δpand；阿拉伯糖诱导后，通过绿色荧光强度测定pand相对表达量，通过β-丙氨酸与荧光剂反应生成的荧光强度确定β-丙氨酸相对含量；通过计算上述两种荧光的比值确定β-丙氨酸合成酶比活力。

本发明所述双荧光法测定pand相对表达量方法如下：阿拉伯糖诱导大肠杆菌表达pand和绿色荧光蛋白，在吸收波长395nm和发射波长509nm的条件下检测携带pglo-para-pand大肠杆菌的绿色荧光强度，同时检测未添加阿拉伯糖时该菌绿色荧光强度，采用二者差值表征pand表达量，即r1的获取需要以不添加阿拉伯糖的荧光值为背景。

本发明所述双荧光法测定β-丙氨酸相对含量测定方法见文献(medicir，demariapd，ottenlg，straathofajj(2011)ahigh-throughputscreeningassayforaminoaciddecarboxylaseactivity.advsynthcatal353:2369-2376)，在吸收波长355nm和发射波长445nm的条件下检测β-丙氨酸与1,2-邻二乙酰苯和巯基乙醇反应生成的化合物所产生的荧光表征β-丙氨酸含量。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

单位酶转化获得更多目标代谢物是筛选高活性酶的关键，为此需要检测酶的表达量和目标代谢物的表达量。传统公知的酶定量检测方法为sdspage电泳和westernblot方法，代谢产物检测通常通过高效液相色谱定量检测，这些方法耗时耗力。本发明的重点是建立了新的高通量筛选方法，该方法采用了两种荧光分别指征酶表达量(激发波长395nm、发射波长509nm)和代谢产物量(激发波长355nm、发射波长445nm)，利用酶标仪扫描获得样品中荧光数值即可获得β-丙氨酸酶表达量和代谢产物β-丙氨酸的数据。邓思颖等人建立了单荧光检测方法(生物工程学报，2015,31：1184-93)只能实现快速定量检测代谢产物β-丙氨酸的目的，无法快速定量检测β-丙氨酸合成酶。本发明的关键点在于通过绿色荧光蛋白发射的绿色荧光指征酶表达量，该方法既精确又简便。采用传统的sdspage电泳和westernblot方法一次只能检测10～20个β-丙氨酸合成酶样品，检测一批样品通常需要1-2天。而采用本发明提供的检测方法仅需1小时左右即可同时检测96个样品，大大提高了β-丙氨酸合成酶的检测效率。因此，本发明提供的方法能够更加高效准确地检测β-丙氨酸合成酶的活力，具更好的应用前景。

此外，本发明采用的宿主菌为β-丙氨酸合成酶编码基因缺失的菌株，降低了宿主菌自身产生的β-丙氨酸背景值对测试的干扰。

附图说明

图1为pglo-para-pand构建示意图。

图2为crispr-cas9构建原理示意图。

图3为β-ala产量与阿拉伯糖浓度间关系图。

图4为gfp荧光值与诱导剂浓度间关系图。

图5为pand酶活与诱导剂浓度间关系图。

图6为β-ala合成酶筛选流程图。

具体实施方式

本发明所述基本盐培养基组成为：k2hpo4·3h2o14g/l、kh2po45.2g/l、(nh4)2so42g/l、mgso40.3g/l、胰蛋白胨1g/l，溶剂为去离子水，自然ph值，115℃灭菌30min后从高压灭菌锅中取出，冷却至室温后，加入经0.2μm醋酸纤维膜过滤除菌的果糖至浓度为10g/l。

实施例1：双荧光法测定枯草芽孢杆菌来源β-丙氨酸合成酶(pandbsu)的比活力

1、pglo-para-pand质粒图谱如图1所示，其构建方法如下：

1)将含绿色荧光蛋白编码基因(gfp)的pglo质粒经xbai和kpni酶切后得到线性化的质粒载体(核苷酸序列如seqidno.1所示)。

2)通过全基因合成的方式获得含阿拉伯糖启动子的枯草芽孢杆菌来源的pand基因，连接在通用载体puc57质粒上，记为puc57-pandbsu，核苷酸序列如seqidno.2所示。

3)puc57-pandbsu经xbai和kpni酶切，获得携带阿拉伯糖启动子的枯草芽孢杆菌来源的pand基因的dna片段(核苷酸序列如seqidno.3)。

4)通过dna连接酶连接步骤1)线性化载体与步骤3)携带阿拉伯糖启动子的枯草芽孢杆菌来源pand基因。连接产物转化大肠杆菌mg1655δpand(见实施例2)，获得携带质粒pglo-para-pandbsu的大肠杆菌mg1655δpand，从中提取重组质粒pglo-para-pandbsu。通过pcr和测序鉴定上述重组质粒。

2、荧光法检测阿拉伯糖诱导pandbsu产生β-丙氨酸的比活力

将携带质粒pglo-para-pandbsu的大肠杆菌mg1655δpand接种至96孔板中，孔板中添加有不同终浓度(1mm、5mm、10mm、20mm、30mm)阿拉伯糖的基本盐培养基200μl(以不添加阿拉伯糖的基本盐培养基为对照)，30℃诱导表达pand酶20h。各个培养液经-80℃快速冷冻30min，37℃融化30min进行冻融破胞处理，重复3次，获得冻融破胞后的培养液，即为粗酶液。取粗酶液50μl，加入底物浓度为50g/l的l-天冬氨酸，于37℃条件下静置2h进行转化反应将底物转化为β-丙氨酸，取转化液采用荧光法在激发波长355nm和发射波长445nm的条件下检测荧光发射强度(反映β-丙氨酸的含量)，结果见图3。阿拉伯糖浓度在1～10mm时，β-丙氨酸的产量与诱导剂的浓度正相关。阿拉伯糖浓度达10mm后，β-丙氨酸的产量接近峰值。

3、荧光法检测阿拉伯糖诱导pandbsu的gfp表达量

gfp和pandbsu的表达均受阿拉伯糖启动子调控，因此通过gfp的表达量可指征pandbsu表达量。

将携带质粒pglo-para-pandbsu的大肠杆菌mg1655δpand接种至96孔板中，孔板中添加有不同终浓度(1mm、5mm、10mm、20mm、30mm)阿拉伯糖的基本盐培养基200μl(以不添加阿拉伯糖的基本盐培养基为对照)，30℃诱导表达gfp蛋白20h后，获得发酵液；取发酵液采用荧光法在激发波长395nm和发射波长509nm的条件下的荧光发射强度(反映gfp蛋白含量)，结果见图4。阿拉伯糖浓度在1～10mm时，随着阿拉伯糖浓度的升高，菌体表达的绿色荧光值逐渐升高，表明gfp蛋白的表达量持续增加，当诱导剂的浓度达到10mm之后，gfp的荧光值基本维持平稳，表明gfp的表达量接近峰值。因此，培养基中阿拉伯糖浓度在1～10mm范围内，gfp蛋白的表达量与诱导剂的浓度正相关；相应地，pandbsu表达量应与诱导剂的浓度正相关。

4、计算pandbsu酶的比活力

将携带质粒pglo-para-pandbsu的大肠杆菌mg1655δpand接种至96孔板中，孔板中添加有不同终浓度(1mm、5mm、10mm、20mm、30mm)阿拉伯糖的基本盐培养基200μl(以不添加阿拉伯糖的基本盐培养基为对照)，30℃诱导表达pand酶20h，分别获得发酵液。取各个发酵液经-80℃快速冷冻30min，37℃融化30min进行冻融破胞处理，重复3次，获得冻融破胞后的培养液，即为粗酶液。取粗酶液25μl(记为v2)，加入l-天冬氨酸175μl(记为v1)使底物终浓度为50g/l，于37℃条件下静置2h进行转化反应将底物转化为β-丙氨酸，取50μl转化液(体积记为v3)采用荧光法在激发波长355nm和发射波长445nm的条件下检测荧光发射强度(反映β-丙氨酸的含量)，记为r1；取发酵液100μl(记为v4)采用荧光法在激发波长395nm和发射波长509nm的条件下的荧光发射强度(反映gfp蛋白含量)，记为r2，根据公式(1)计算pandbsu酶的比活力。

pandbsu酶的比活力可通过如下方法计算：单位体积的pand酶活/单位体积的pand蛋白表达量＝单位体积的转化液冻融破胞粗酶液产生的β-丙氨酸荧光值/单位体积的发酵液产生的gfp荧光值，其比活力计算公式如下：

r1：转化液在激发波长355nm和发射波长445nm条件下测得的荧光发射强度；

r2：发酵液在激发波长395nm和发射波长509nm条件下测得的荧光发射强度；

v1：l-天冬氨酸向β-丙氨酸转化检测反应中加入终浓度50g/ll-天冬氨酸的体积；

v2：在激发波长355nm和发射波长445nm条件下检测荧光发射强度时加入的粗酶液体积；

v3：l-天冬氨酸向β-丙氨酸转化检测反应中加入的转化液体积；

v4：在激发波长395nm和发射波长509nm条件下检测荧光发射强度时加入的发酵液体积。

基于双荧光法测定的数据计算不同阿拉伯糖浓度下pand酶的比活力的结果表明(见图5)，对于特定的pand酶，其比活力与蛋白自身的性质相关，而与诱导剂浓度和蛋白的表达量无关。因此，本方法能够较稳定地反映pand酶自身的酶学性质。

实施例2、利用双荧光法高通量筛选β-丙氨酸合成酶

1、突变文库构建

文献报道，枯草杆菌来源的pand酶活和稳定性均显著优于其他来源(wanlipei等人，applmicrobiolbiotechnol，2017，101：6015–6021；tenghuizhang等人，processbiochemistry，2018，70：117-123)。以实施例1构建的携带枯草杆菌pand基因的载体质粒pglo-para-pandbsu为模板，通过引物p1和p2进行易错pcr，易错pcr的条件见表1和表2，切胶回收纯化获得pcr产物。以pcr产物为大引物，pglo-para-pandbsu质粒为模板，扩增全长质粒，pcr产物经dpni处理后消除初始质粒模板，进而通过电击转化方法导入大肠杆菌mg1655δpand中，涂布于含10mm阿拉伯糖的基本盐培养基平板中，37℃恒温过夜培养，最终获得约1000个转化子。

引物p1：ctttaagaaggagatatacat

引物p2：gcctgcaggtcgactctaga

表1易错pcr体系

表2pcr反应条件

2、大肠杆菌mg1655δpand通过crispr/cas9系统构建，其构建原理如图2所示，具体方法如下：

1)以ptargetf为模板，通过引物p3和p4进行pcr扩增，经dpni消除模板dna后pcr产物转化大肠杆菌dh5α，从而构建出表达靶向pand基因sgrna的载体质粒ptargetf-pand。

引物p3：catcgcctgcttcgttaacgagcgattgtgtaggctggag。

引物p4：taaccagccgcagggataaccacttaacggctgacatggg。

2)以大肠杆菌mg1655基因组dna为模板，通过引物p5和p6进行pcr，扩增上游同源臂h1(核苷酸序列如seqidno.4)；通过引物p7和p8进行pcr，扩增下游同源臂h2(核苷酸序列如seqidno.5)。以pkd3质粒为模板，通过引物p9和p10进行pcr，扩增携带氯霉素抗性基因的片段m(核苷酸序列如seqidno.6)。上、下游同源臂h1和h2，以及携带抗性基因的片段m通过同源重组介导的一步克隆方法连接，构建基因编辑模板h1mh2。

引物p5：agataaccgggattgccct。

引物p6：tgagccgctatgcgtatcc。

引物p7：ctttaagaaggagatatacat。

引物p8：gcctgcaggtcgactctaga。

引物p9：catcgcctgcttcgttaacgagcgattgtgtaggctggag。

引物p10：taaccagccgcagggataaccacttaacggctgacatggg。

3)制备感受态细胞：携带pcas9的野生型大肠杆菌mg1655于lb培养基中，30℃条件下摇床培养生长至od600约为0.2时加入终浓度为15mm阿拉伯糖，继续生长至od600约为0.4时制备感受态细胞，感受态细胞重悬于含10％甘油的50mmcacl2溶液中，冻存于-80℃冰箱备用。

4)转化：通过化学转化的方法将基因编辑模板h1mh2和ptarget-pand质粒共同转入携带pcas9的大肠杆菌感受态细胞，涂布于含终浓度为50μg/ml卡那霉素和终浓度为50μg/ml壮观霉素的抗性选择性lb平板上，30℃恒温过夜培养，得到转化子。

5)以转化子菌落为模板，通过引物p11和p12进行pcr，琼脂糖凝胶电泳检测目的条带大小是否正确(1381bp)或测序后比对序列是否与抗性基因序列一致，说明靶标基因是否被抗性基因替换，获得大肠杆菌mg1655δpand。

引物p11：agataaccgggattgccct

引物p12：tgagccgctatgcgtatcc

3、β-丙氨酸合成酶高通量筛选流程(图6)

分别将野生型大肠杆菌mg1655菌株、步骤1制备的转化子菌株、步骤2制备的大肠杆菌mg1655δpand，接种至含10mm阿拉伯糖的基本盐培养基的96孔板中，37℃过夜培养，利用酶标仪测定od600，剔除明显低于野生型大肠杆菌mg1655培养液od600的转化子样品。将剩余的转化子培养液取20μl接种至另一加有180μl含10mm阿拉伯糖的基本盐培养基的96孔板，30℃培养20h后通过荧光法(同实施例1)测定培养液中β-丙氨酸量和pandbsu表达量，计算转化子中pandbsu突变体的比活力。从含1,000个pandbsu突变体的文库中，筛选获得一个比活力显著高于野生型pandbsu的突变体，经测序，其编码基因突变位点与对应的氨基酸变化如表3所示。

表3

对比例1：单荧光法测定枯草芽孢杆菌来源β-丙氨酸合成酶(pandbsu)的比活力

pglo-para-pand质粒构建方法及荧光法检测阿拉伯糖诱导pandbsu产生β-丙氨酸实验方法参照实施例1。

1.pandbsu表达量检测

将携带质粒pglo-para-pandbsu的大肠杆菌mg1655δpand接种至96孔板中，孔板中各孔添加含10mm阿拉伯糖的基本盐培养基200μl(以不添加阿拉伯糖的基本盐培养基为对照)，30℃诱导表达pand酶20h，获得发酵液；取发酵液经-80℃快速冷冻30min，37℃融化30min进行冻融破胞处理，重复3次，获得冻融破胞后的培养液，即为粗酶液。取粗酶液25μl(记为v2)，加入l-天冬氨酸175μl(记为v1)使底物终浓度为50g/l，于37℃条件下静置2h将底物转化为β-丙氨酸，取50μl转化液(体积记为v3)采用荧光法在激发波长355nm和发射波长445nm的条件下检测荧光发射强度(反映β-丙氨酸的含量)，记为r1；取100μl发酵液(体积记为v4)，利用酶标仪测定各孔od600，记为r2，视其为反映pandbsu表达量参数。

2.pandbsu酶活力比较

pandbsu酶活力参数可用如下方法计算：单位体积的pand酶活/单位体积od600＝单位体积的转化液产生的β-丙氨酸荧光值/单位体积菌液的od600，其计算公式如下：

r1：转化液在激发波长355nm和发射波长445nm条件下测得的荧光发射强度；

r2：发酵液在吸收波长为600nm条件下测得的光密度值；

v1：l-天冬氨酸向β-丙氨酸转化检测反应中加入终浓度50g/ll-天冬氨酸体积；

v2：在激发波长355nm和发射波长445nm条件下检测荧光发射强度时加入的粗酶液体积；

v3：l-天冬氨酸向β-丙氨酸转化检测反应中加入的转化液体积；

v4：在吸收波长为600nm条件下检测光密度值时加入的发酵液体积。

对比例1检测野生型pandbsu的相对酶活检测结果如表4所示。显然，相比于实施例1中所使用的双荧光法，对比例1中使用的单荧光法仅通过光密度获得发酵液菌体量推测pandbsu蛋白含量，导致同一蛋白的相对酶活测量值相差较大，无法准确反映pandbsu蛋白含量。本实施例中pandbsu与gfp共用启动子，通过gfp荧光发射强度测定pandbsu表达量，能够更加精确地反映pandbsu真实的表达水平。因此，双荧光法的采用可精确反映β-丙氨酸合成酶的活力。

表4

序列表

<110>浙江工业大学

<120>一种双荧光筛选β-丙氨酸合成酶的方法

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5360

<212>dna

<213>未知(unknown)

<400>1

ctagagtcgacctgcaggcatgcaagcttggctgttttggcggatgagagaagattttca60

gcctgatacagattaaatcagaacgcagaagcggtctgataaaacagaatttgcctggcg120

gcagtagcgcggtggtcccacctgaccccatgccgaactcagaagtgaaacgccgtagcg180

ccgatggtagtgtggggtcccccatgcgagagtagggaactgccaggcatcaaataaaac240

gaaaggctcagtgcaaagactgggcctttcgttttatctgttgtttgtcggtgaacgctc300

tcctgagtaggacaaatccgccgggagcggatttgaacgttgcgaagcaacggcccggag360

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