一种羰基还原酶DmCR及其编码基因、重组表达载体、重组表达细胞及其应用的制作方法

本发明涉及生物催化技术领域，尤其涉及一种羰基还原酶dmcr及其编码基因、重组表达载体、重组表达细胞及其应用。

背景技术：

(r)-1,3-丁二醇(1,3-bdo)，是一种无色、无味、低毒的粘稠液体，其结构如式(ⅰ)所示。(r)-1,3-丁二醇是一种用于合成多类药物的手性中间体，被广泛地用于碳青霉烯类抗生素母核氮杂环丁酮、香料、信息激素和杀虫剂等物质的合成。当前(r)-1,3-丁二醇的制备主要是通过化学法和生物法来进行。与传统化学合成技术相比，羰基的不对称生物还原具有立体选择性强、催化效率高、反应条件温和、以及生产过程对环境友好等优势。因此，近年来利用羰基还原酶不对称还原苯乙酮成为生产该类手性醇的方法。而开发一些新型、高效、稳定，能够适应多变生产环境的羰基还原酶成为了生物催化工业的核心，对于工业制备(r)-1,3-丁二醇具有重要的研究意义和实际应用价值。

羰基还原酶(ec1.1.1.184)是众多氧化还原酶中的一种，对酮类、醛类底物有特异性的催化能力，可以将其转化为醇类产物，转化过程中需以辅酶nadp(h)或nad(h)作为电子受体，具有高度的辅酶依赖性。在自然界中，羰基还原酶的存在非常普遍，从低等微生物如细菌、酵母，到一些高等植物、动物组织中均有分布。而在手性醇的合成应用中，尤以微生物来源的羰基还原酶研究居多。

微生物中存在的羰基还原酶有不同的分类方法，根据催化机理及三维结构主要分为以下几类：醛酮还原酶家族(aldo-ketoreductasesuperfamily，akr)、短链脱氢酶/还原酶家族(short-chaindehydrogenase/reductase，sdr)、zn依赖醇脱氢酶/还原酶家族(zinc-dependentalcoholdehydrogenases，adh)。羰基还原酶中短链脱氢酶每个分子大约有250～350个氨基酸，没有金属离子，不同来源的短链脱氢酶相互之间的同源性较低，多为15％～30％左右。至今为止，在蛋白数据库中已有两万多的短链脱氢酶序列被提交，其中大约有3/4来源于细菌。

羰基还原酶是一种具备高度的化学选择性、区域选择性、立体对映选择性的生物催化剂，通过不对称还原反应可以将潜手性酮底物转化为具有光学纯度的手性醇，是一种高效的生物转化途径。最近几十年越来越多的羰基还原酶被用于手性醇的合成。如nie等人为了提高产物(s)-1-苯基-1,2-乙二醇的产率，利用羰基还原酶对2-羟基苯乙酮进行不对称转化(niey，xiaor，xuy，etal.novelanti-prelogstereospecificcarbonylreductasesfromcandidaparapsilosisforasymmetricreductionofprochiralketones[j].orgbiomolchem，2011，9:4070-4078)；朱敦明等以羰基还原酶candidamagnoliae为生物催化剂催化多种苯乙酮衍生物，反应所得产物的光学纯度均高达99％以上(zhud,yangy,hual.stereoselectiveenzymaticsynthesisofchiralalcoholswiththeuseofacarbonylreductasefromcandidamagnoliaewithanti-prelogenantioselectivity.thejournaloforganicchemistry,2006,71(11):4202-4205)。但是目前缺乏一种对于(r)-1,3-丁二醇制备的转化率高的羰基还原酶。

技术实现要素：

本发明为了克服现有(r)-1,3-丁二醇制备中缺乏转化率高的羰基还原酶的缺陷，提供了一种新的羰基还原酶dmcr及其编码基因、重组表达载体、重组细胞及其在制备(r)-1,3-丁二醇的应用，本发明所述羰基还原酶dmcr的(r)-1,3-丁二醇转化率可达到96％以上。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种羰基还原酶dmcr，所述羰基还原酶dmcr的氨基酸序列如seqidno.1所示。

本发明还提供了一种编码上述技术方案所述羰基还原酶dmcr的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示。

本发明还提供了一种羰基还原酶dmcr的重组表达载体，所述重组表达载体包括上述技术方案所述的基因。

优选的，所述重组表达载体是将上述技术方案所述的基因插入表达载体的多克隆位点得到的。

优选的，所述表达载体包括pet-28a(+)。

优选的，所述基因通过羰基还原酶dmcr的基因的引物对扩增得到，所述引物对包括如seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列。

本发明还提供了一种羟基还原酶dmcr的重组表达细胞，包括上述技术方案所述的重组表达载体。

优选的，将所述重组表达载体导入到大肠杆菌中，即得羰基还原酶dmcr的重组细胞。

本发明还提供了前述技术方案所述羰基还原酶dmcr、前述技术方案所述编码羰基还原酶的基因、前述技术方案所述羰基还原酶dmcr的重组表达载体或上述技术方案所述羰基还原酶dmcr的重组细胞在制备(r)-1,3-丁二醇中的应用。

优选的，所述制备(r)-1,3-丁二醇的过程中，羰基还原酶dmcr催化4-羟基-2-丁酮生成(r)-1,3-丁二醇的反应。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

本发明提供了一种羰基还原酶dmcr，所述羰基还原酶dmcr的氨基酸序列如seqidno.1所示。本发明提供了一种新的羰基还原酶dmcr，该羰基还原酶dmcr的最适反应温度为ph为7.5，最适反应温度为35℃，酶活力最高可达到4.5u/ml。能够催化4-羟基-2-丁酮生成(r)-1,3-丁二醇，并且转化率可达到96％以上。

本发明所述羰基还原酶dmcr的编码基因如seqidno.2所示，该编码基因是针对大肠杆菌进行密码子优化后的产物，可有效提高羰基还原酶dmcr在大肠杆菌中的表达量。

附图说明

图1为考马斯亮蓝染色后观察结果；

其中，m为低分子量标准蛋白质；1未诱导超声破碎的上清液；2为诱导后上清粗酶液；

图2为实施例2中不同ph值条件下的羰基还原酶dmcr的酶活性；

图3为实施例2中不同温度条件下的羰基还原酶dmcr的酶活性；

图4a为实施例3中对照组反应后的色谱图；

图4b为实施例3中试验组反应12h后的色谱图；

图4c为实施例3中试验组反应48h后的色谱图。

具体实施方式

本发明提供了一种羰基还原酶dmcr，所述羰基还原酶dmcr的氨基酸序列如seqidno.1所示，共350个氨基酸。本发明将马钱子脱硫弧菌(desulfonatronovibriomagnus)的羰基还原酶进行密码子优化后，得到如seqidno.1所示氨基酸序列的羰基还原酶dmcr。

本发明提供的羰基还原酶dmcr的酶活力为4.5u/ml。在本发明中，所述羰基还原酶dmcr的最适反应ph值为7.5，在ph4.5～8.5的范围内本发明所述羰基还原酶dmcr的酶活性能在58％以上。在本发明中，本发明所述羰基还原酶dmcr的最适温度为35℃。

本发明所述羰基还原酶dmcr可以通过生物合成也可以通过人工合成，本发明对此不做特殊限定。

本发明还提供了一种编码上述技术方案所述羰基还原酶dmcr的基因，所述基因的核苷酸序列如seqidno.2所示，共1053个碱基。本发明所述编码羰基还原酶dmcr的基因是根据大肠杆菌进行了密码子优化后得到的，本发明利用基因合成的方式优化了来源于马钱子脱硫弧菌(desulfonatronovibriomagnus)的羰基还原酶的密码子，优化的内容包括稀有密码子优化、gc含量调整、修改序列不被需要的结构单元，优化后的dmcr编码基因在e.colibl21中表达提升了dmcr蛋白表达量。

本发明还提供了一种羰基还原酶dmcr的重组表达载体，所述重组表达载体包括上述技术方案所述的基因。在本发明中，所述重组表达载体是将上述技术方案所述的基因插入表达载体的多克隆位点得到的；本发明优选的，所述表达载体包括但不限于pet-28a(+)。

在本发明的具体实施例中，选用pet-28a(+)作为表达载体，将上述技术方案所述编码羰基还原酶dmcr的基因插入到pet-28a(+)的多克隆位点，得到重组表达载体。本发明优选的，在构建所述重组表达载体时，所述基因通过羰基还原酶dmcr的基因的引物对扩增得到，所述引物对优选的包括如seqidno.3和seqidno.4所示的核苷酸序列：

dmcr-f(seqidno.3)：cgggatccatgaaagcgtttgttgttcacagta(bamhⅰ)；

dmcr-r(seqidno.4)：tcagctgaatgttaccaggggttaagcttgg(hindiii)。

本发明在设计羰基还原酶dmcr的编码基因的引物对时，优选的在引物中引入bamhi和bamhiii酶切位点，以便重组表达载体的构建。

本发明还提供了一种羟基还原酶dmcr的重组表达细胞，包括上述技术方案所述的重组表达载体。本发明所述重组表达细胞为异源重组表达，本发明优选的采用大肠杆菌作为重组表达载体的宿主细胞，进而使得针对大肠杆菌做出密码子优化的dmcr编码基因易于表达。本发明将所述重组表达载体导入到大肠杆菌中，即得羰基还原酶dmcr的重组细胞。

本发明所述羰基还原酶dmcr的重组表达载体以及重组表达细胞可用于制备本发明所述羰基还原酶dmcr。

本发明还提供了前述技术方案所述羰基还原酶dmcr、前述技术方案所述编码羰基还原酶的基因、前述技术方案所述羰基还原酶dmcr的重组表达载体或上述技术方案所述羰基还原酶dmcr的重组细胞在制备(r)-1,3-丁二醇中的应用。利用本发明所述羰基还原酶dmcr制备(r)-1,3-丁二醇的转化率可达到96％以上，纯度为99％，产率96.3％。

具体的，本发明所述制备(r)-1,3-丁二醇的过程中，羰基还原酶dmcr催化4-羟基-2-丁酮生成(r)-1,3-丁二醇的反应。

在本发明中，所述制备(r)-1,3-丁二醇的过程中，反应体系每ml中包括ph＝7、45～60mm的磷酸盐缓冲液，100～300mm4-羟基-2-丁酮作(底物)，2～5mmnadh，0.05～0.2g羰基还原酶dmcr或羰基还原酶dmcr的重组表达载体以及0.5～2mm氯化锌。

在本发明中，所述制备过程中，反应温度优选为28～35℃，更优选为30℃。在本发明中，所述制备过程中优选的伴随搅拌；更优选的，所述搅拌速率为120～240rpm，进一步优选为180rpm。

下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1dmcr基因的获得与表达

根据seqidno.2所示的基因进行人工合成，得到编码羰基还原酶dmcr的基因。

以上述得到的编码羰基还原酶dmcr的基因为模板，dmcr-f和dmcr-r为引物，使用primestarhsdna聚合酶进行扩增。

dmcr-f(seqidno.3)：cgggatccatgaaagcgtttgttgttcacagta(bamhⅰ)；

dmcr-r(seqidno.4)：tcagctgaatgttaccaggggttaagcttgg(hindiii)。

pcr反应体系如下：dna模板，约50ng；上下游引物(10μm)，各1μl；5×pcrbuffer，10μl；dntpmix(各2.5mm)，4μl；primestarhsdnapolymerase，0.5μl，加水至总体积50μl。

pcr条件为：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min20s，30个循环；72℃10min。

琼脂糖凝胶试剂盒回收pcr扩增产物，经bamhⅰ和hindiii双酶切后，连接至pet-28a(+)载体，转化e.colibl21(de3)，在含卡那霉素(50μg/ml)的lb平板筛选阳性转化子并测序验证。扩增产物的核苷酸序列如序列表中seqidno.2所示，其可编码序列表中seqidno.1所示氨基酸序列组成的蛋白质。

将验证正确的阳性转化子于20ml含卡那霉素(50μg/ml)的lb培养基中培养。37℃振荡培养至od600达到0.6～0.8时，加入iptg至终浓度0.1mm，18℃诱导培养过夜。按上述条件诱导后，离心收集菌体，重悬于适量k2hpo4/kh2po4缓冲液(50mmol/l，ph7.0)，进行超声破碎。离心收集上清，即为羰基还原酶dmcr的粗酶液。

收集超声破碎的上清液(粗酶液)经sds-page(5％浓缩胶，12％分离胶)分离，考马斯亮蓝染色后观察结果。结果如图1所示。

图1表明，羰基还原酶dmcr在上述诱导条件下有良好可溶表达，分子量大小约40kda，与预测相符。

实施例2、羰基还原酶dmcr的酶学性质检测

一、羰基还原酶酶活性测定

羰基还原酶dmcr催化的反应消耗nadh，生成nad+，导致340nm处吸光值的变化。故羰基还原酶酶活性测定方法如下：

200μl反应体系中含有50mm，ph7.0的k2hpo4/kh2po4缓冲液，终浓度100mm的4-羟基-2-丁酮，终浓度3mm的nadh及10μl实施例1制备的羰基还原酶dmcr的粗酶液。在340nm下测定其吸光值的变化。

酶活性定义为：在上述条件下，每分钟催化生成1μmol的nad(h)的酶量定义为1个酶活性单位。

酶活性的计算公式为：酶活性(u/ml)＝ew×0.2×103/(6.22×0.5×10)

其中，ew：1min内340nm处最终吸光度值与初始吸光度值的差值；

0.2：反应液的体积；

6.22：摩尔消光系数；

0.5：光程距离；

10：粗酶液体积。

检测结果显示，本发明提供羰基还原酶dmcr酶活性为4.5u/ml。

二、羰基还原酶的最适ph

将上述酶活性测定中的缓冲液换成如下不同ph值的4种不同缓冲液：柠檬酸/柠檬酸钠(ph3.0～6.5)、磷酸氢二钾/磷酸二氢钾(ph6.0～8.0)、tris-hcl(ph7.5～9.0)和甘氨酸/氢氧化钠(ph8.5～10.5)，分别测定羰基还原酶dmcr的酶活性，酶活性测定方法同上，以酶活性最高点作为100％，确定其活力达最高时的缓冲液ph值。结果如图2所示。

由图2表明，羰基还原酶dmcr的最适ph为7.5，在ph为4.5～8.5的范围内，羰基还原酶dmcr的酶活性能够达到58％以上。

三、羰基还原酶的最适温度

酶活性最适温度的测定：将酶活性反应体系中的缓冲液换成其最适ph的缓冲液，然后分别在20、25、30、35、40、45、50、55℃下按照上述方法测定羰基还原酶dmcr的酶活性，酶活性测定方法同上，以酶活性最高点作为100％，确定其活力达最高时的反应温度。结果如图3所示。

图3表明，羰基还原酶dmcr的最适温度为35℃。

实施例3、生物催化生产(r)-1,3-丁二醇体系的建立

一、反应的建立

构建(r)-1,3-丁二醇反应体系如下：1ml反应体系(50mm，ph7.0，k2hpo4/kh2po4)中，含有：4-羟基-2-丁酮(底物)0.5g/l，nadh3mm，dmcr菌体湿重0.1g，氯化锌1mm。30℃，180rpm进行反应。

二、反应的检测

分别设置对照组和试验组，对照组按照步骤一进行反应，对照组为空载体菌株，反应48h。

反应48h时停止反应，加入等体积乙酸乙酯萃取，涡旋振荡3min，取上层有机相过有机膜，将上述处理的反应液利用气相色谱进行分离鉴定。液相条件如下：柱子：毛细血管柱；载气：氮气；流速：1.5ml/min；进样口温度：200℃；升温程序：100℃1min；以20℃/min升温至130℃，保持2min；检测器温度：280℃。液相检测结果如图4所示。

图4中，图4a为对照组的检测色谱图，有明显底物4-羟基-2-丁酮峰图，其保留时间为2min左右；图4b为试验组反应12h后的检测色谱图，产物(r)-1,3-丁二醇的保留时间为2.2min左右，而在2min位置仍有底物4-羟基-2-丁酮残留；图4c为试验组反应48h后的检测色谱图，此时在2min位置已基本无底物峰，而在2.2min位置有明显(r)-1,3-丁二醇产物峰，说明4-羟基-2-丁酮已基本完全转化成(r)-1,3-丁二醇，此时转化率达96％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>河北省科学院生物研究所

<120>一种羰基还原酶dmcr及其编码基因、重组表达载体、重组表达细胞及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>350

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

metlysalaphevalvalhisserileglylysvalglyilemetglu

151015

lysprovalprogluproglyproasnaspvalilevallysthrthr

202530

asnalaleuilecysthrseraspvalhisthrvalalaglyalaile

354045

glyglulysseraspleuthrleuglyhisgluglyalaglythrval

505560

tyrlysileglyseralavallysglyphelysgluglygluargval

65707580

leuvalasnalailethrprocysphelyscyshisasncysglnarg

859095

glytyrthrserglncysglyglnalaleuglyglytrplyspheala

100105110

asnilelysaspglycysphealaglutyrphehisvalasnaspala

115120125

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130135140

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145150155160

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165170175

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180185190

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195200205

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210215220

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225230235240

alaleuglyalaglnilethrphegluasncysilelysvalthrlys

245250255

proglyglythrileserasnileglytyrhisglygluglyasptyr

260265270

ilelysileproargalaglutrpglyvalglymetserasplysthr

275280285

ileargthrglyleucysproglyglysergluargmetserargleu

290295300

leuargleuilegluasnglyargileaspprothrlysleuthrthr

305310315320

hisargpheserpheaspgluileglulysglyphehismetmetala

325330335

asnlysgluaspglyvalilelysproleuvalthrpheser

340345350

<210>2

<211>1050

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

atgaaagcctttgttgtgcatagtattggtaaagttggtattatggaaaaaccggttccg60

gaaccgggtccgaatgatgtgattgttaaaaccaccaatgccctgatttgtaccagcgat120

gttcataccgttgccggtgccattggtgaaaaaagcgatctgaccctgggtcatgaaggt180

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ctggttaatgcgattaccccgtgttttaaatgtcataattgtcagcgcggttataccagc300

cagtgtggtcaggcgctgggcggttggaaatttgccaatattaaagatggttgttttgcc360

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gcacgtcaggaactggccaaattttatggcgcagatgtgattgttgattttaccaaagtg660

gatgccgttgaagaaattatgaaactgaccgatggtcagggtgtggatgccgccattgaa720

gcgctgggtgcacagattacctttgaaaattgtattaaagtgaccaaaccgggcggcacc780

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atgagccgtctgctgcgtctgattgaaaatggtcgtattgatccgaccaaactgaccacc960

catcgttttagctttgatgaaattgaaaaaggttttcatatgatggctaataaagaagat1020

ggtgtgattaaaccgctggtgacctttagc1050

<210>3

<211>33

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

cgggatccatgaaagcgtttgttgttcacagta33

<210>4

<211>31

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

tcagctgaatgttaccaggggttaagcttgg31