一种人工合成抗草甘膦的突变基因及其表达载体与应用的制作方法

本发明涉及植物分子生物学和基因工程领域，具体涉及一种人工合成抗草甘膦的突变基因及其表达载体与应用。

背景技术：

杂草是耕地面临的主要难题，除草剂的广泛使用，使得杂草控制变得容易。草甘膦(glyphosate)是孟山都公司1971年开发生产的一种非选择性的、有机磷类茎叶处理除草剂。具有理化性质稳定、高效、低毒、低残留、易被微生物分解，不破坏土壤环境等优点，已经被全世界的农民广泛应用于在作物种植之前。然而草甘膦作为一种非选择性除草剂，对农作物同样有着杀死作用，这就限制了其使用范围和使用时间，为克服这一问题，培育耐受广谱除草剂草甘膦的作物能解决这一问题，这样不仅能免除田间锄草作业，减免农业劳动强度、节省农业生产费用，还能促进草甘膦工业的发展，更能加强水分保持，减少土壤碳的损失以及二氧化碳的排放，避免因大量使用农药造成的环境污染。

随着转基因工程的快速发展以及抗除草剂基因的获得，抗除草剂转基因作物的转化事件数量明显增加。就玉米而言，根据国际农业生物技术应用服务组织(internationalagriculturalbiotechnologyapplicationserviceorganization,isaaa)统计，目前全球共有229个转化事件，其中有201个抗除草剂转化事件，约占总转化事件总数的87.77％，单一抗草甘膦的转化事件主要是孟山都公司的ga21、mon87427和nk603、美国斯泰恩种子农场股份有限公司的hcem485、genectives.a的涉及抗草甘膦基因有7种，分别是来源于根癌农杆菌株cp4的5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(cp4-5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthetase)基因(cp4epsps)；来源于地衣芽胞杆菌(bacilluslicheniformis)的草甘膦n-乙酰转移酶(glyphosaten-acetyltransferaseenzyme)基因(gat4601)；来源于地衣芽胞杆菌的草甘膦n-乙酰转移酶基因(gat4621)；来源于苍白杆菌(ochrobactrumanthropistrainlbaa)的草甘膦氧化酶(glyphosateoxidase)基因(goxv247)；来源于土壤球形节杆菌(arthrobacterglobiformis)的改良epsp合成酶(epsps或epspsace5)蛋白(modified5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthaseproteinorepspsace5protein)基因(epspsgrg23ace5)；来源于玉米(zeamays)的epsps修饰合成酶(modified5-enolpyruvylshikimate-3-phosphatesynthase)基因(mepsps)和双突变型epsps修饰合成酶(2mepsps)基因。

我国在抗草甘膦基因克隆开发上取得较大进展，至2012年抗草甘膦基因的专利申请累计达到38件，其中13件已获得国家专利授权。与此同时我国抗草甘膦转玉米遗传转化研究近年来有了一定发展。但目前尚无转抗草甘膦基因作物进入商品化阶段的报道。目前在植物转基因育种中所应用的epsps基因，大多来自原核生物，由于原核生物基因自身的特点，导致原核生物来源的epsps基因在植物体内表达水平偏低，利用宿主的密码子偏好性对外源基因进行改造可以有效提高外源基因表达水平。

1987年，smart等将epsp合酶定位于植物的叶绿体内膜上。信号肽对epsp合酶前体正确定位到细胞叶绿体起到重要作用，因微生物epsp合酶无信号肽，如果将微生物来源的epsps基因转入植物必须在该基因的n端添加叶绿体信号肽基因才能实现基因的正确定位。人们先后从拟南芥、牵牛花、番茄、烟草、胡萝卜和水稻等植物中克隆出了epsps编码基因，分析显示植物epsps的成熟酶的序列相似性很高，而叶绿体信号肽序列的相似性却较低。例如，拟南芥与矮牵牛的酶序列的同源性高达84％而信号肽的同源性仅为23％。信号肽的序列差异大，可能是由于在信号肽和叶绿体膜上的受体相互识别的过程中，起作用的是信号肽的高级结构而非一级结构。不同来源的信号肽对epsps蛋白在不同转化受体中行使功能的效率存在差异。因此，选择适宜转化受体的信号肽对提高epsps的表达量并行使功能具有重要作用。

技术实现要素：

为了寻找高草甘膦抗性基因，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种dna片段，为如下1)-7)中任一种所示的核酸分子：

1)其编码序列包括序列表中序列3；

2)其编码序列包括序列表中序列4；

3)其编码序列包括序列表中序列4第427-1746位；

4)其编码序列包括序列表中序列5；

5)其编码序列包括序列表中序列5第1416-3161位；

6)在严格条件下与1)-5)中任一限定的dna分子杂交且编码相同蛋白的dna分子；

7)与1)-5)中任一限定的dna分子具有80％以上或90％以上的同源性且编码相同蛋白的dna分子。

本发明另一个目的是提供下述1)-4)中的任一种生物材料。

本发明提供的生物材料：

1)含有上述dna片段的表达盒；

2)含有上述dna片段的重组载体；

3)含有上述dna片段的重组菌；

4)含有上述dna片段的转基因细胞系。

上述dna片段或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在提高植物草甘膦抗性中的应用也是本发明保护的范围。

上述dna片段或上述的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系在培育抗草甘膦植物中的应用也是本发明保护的范围。

本发明第3个目的是提供一种制备草甘膦抗性高植物的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将上述dna片段导入目的植物中，得到转基因植物，所述转基因植物的草甘膦抗性高于所述目的植物。

上述方法中，所述dna片段通过上述的重组载体导入目的植物中。

上述方法中，所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物。

所述双子叶植物可为茄目植物。所述茄目植物可为茄科植物。所述茄科植物可为夜香树族植物。所述夜香树族植物可为烟草属植物。所述烟草属植物所述植物具体可为烟草，例如烟草w38(nicotianatobacumcv.wisconsin38)。

所述单子叶植物可为禾本目植物。所述禾本目植物可为禾本科植物。所述禾本科植物可为玉蜀黍族植物。所述玉蜀黍族植物可为玉蜀黍属植物。所述玉蜀黍属植物所述植物具体可为玉米，例如玉米杂交系hi-ii。

本发明的抗草甘膦融合基因ca-mg1-epsps在植物细胞中高效稳定的表达，将抗草甘膦融合基因ca-mg1-epsps导入烟草和玉米后，都可以得到稳定遗传的ca-mg1-epsps转化体，提高植物的草甘膦抗性。此外，该基因也可以转化大豆、棉花、水稻、蔬菜等农作物，使其具备相应的抗草甘膦活性，从而适用与少耕与免耕体系，加强了水分保持，大大减少了土壤流失，具有重要的经济价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为植物表达载体ptf101.1-ca-mg1-epsps质粒图谱。

图2为t0代转ca-mg1-epsps烟草的pcr检测结果。

图3为t0代转ca-mg1-epsps玉米的pcr检测结果。

图4为转ca-mg1-epsps玉米的功能验证。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

ptf101.1质粒记载在如下参考文献中：margiem.paz,huixiashou,kanwang,etal.assessmentofconditionsaffectingagrobacterium-mediatedsoybeantransformationusingthecotyledonarynodeexplants.euphytica，2004(136):167-179.；公众可以从重庆市农业科学院获得。

农杆菌eha101：北京华越洋生物科技有限公司，产品号：wxr15-100s。

烟草w38(nicotianatobacumcv.wisconsin38)：参考文献：眭顺照,李琳莉,祝钦泷等.蜡梅凝集素基因克隆及其对蚜虫、蛞蝓抗性分析.中国农业科学,2011(2)：358-368).；公众可以从重庆市农业科学院获得。

玉米杂交系hi-ii:参考文献：bronwynr.frame,kanwang，etal.agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofmaizeembryosusingastandardbinaryvectorsystem,plantphysiol,2002(129):13-22；公众可以从重庆市农业科学院获得。

农达(41％草甘膦异丙胺盐水剂)：购自中化作物保护品有限公司。

烟草共培养基(ph5.8)：含有0.1mg/lnaa的ms固体培养基。

烟草分化培养基(ph5.8)：含有2mg/l的6-ba、0.1mg/l的naa、57mg/l草甘膦和400mg/l头孢霉素的ms固体培养基。

烟草生根培养基(ph5.8)：1/2ms固体培养基。

实施例1、ca-mg1-epsps基因的改造合成

一、epsps基因的来源与改造

根据玉米基因组特点及密码子偏好性，对g1174-a(序列1)的密码子及编码框进行了改造，改造后的突变基因核苷酸序列(序列3)与原始的epsps同源性为95.45％，而g的含量由原来的27.9％变为29.2％；c的含量也由原来的41.7％变为44.8％；t的含量由原来的16.5％变为13.0％，a的含量由原来的13.9％变为13.0％。

二、融合蛋白ca-mg1-epsps及其编码基因

将来源于拟南芥的叶绿体转运肽ctp2、编码叶绿体信号肽ahas添加在突变基因的5’端，命名为融合基因ca-mg1-epsps，该基因的核苷酸序列为序列4，其中序列4第1-228位为叶绿体转运肽ctp2编码基因，第229-426位为叶绿体信号肽ahas编码基因，第427-1746位为突变基因epsps。该基因的蛋白序列为序列2，其中第1-76位为叶绿体转运肽,第77-142位为叶绿体信号肽，第143-581位为mg1-epsps基因编码的蛋白。

实施例2、ca-mg1-epsps基因的功能验证

一、转ca-mg1-epsps基因烟草

1、植物表达载体的构建(序列4是融合基因ca-mg1-epsps的核苷酸序列，序列5是包括第1-1415位水稻肌动蛋白1启动子、转录起始位点、内含子1p-ract1/ract1intron、第1416-3161位ca-mg1-epsps基因和第3162-3435位nos终止子)

重组载体ptf101.1-ca-mg1-epsps-bar为将序列表的序列5所示的片段插入植物表达载体ptf101.1的smai酶切位点中，得到的真核重组表达载体(图1)。

2、重组农杆菌的制备

将上述构建的重组载体ptf101.1-ca-mg1-epsps-bar通过冻融法(参考文献：holstersm,dewaeled,depickera.transfectionandtransformationofagrobacteriumtumefaciens.molgengenet,1978,183:181-187)转入农杆菌eha101，得到重组农杆菌。

对重组农杆菌用由引物f(5’-cggcgacatcaagtcccacg-3’)和引物r(5’-ggcgaagaactgcgggtagga-3’)组成的引物对进行pcr鉴定，若得到目的条带大小为688bp，则为阳性重组菌。

将上述阳性重组菌命名为农杆菌eha101/ptf101.1-ca-mg1-epsps-bar。

重组载体ptf101.1-g1174-a为将序列表的序列1所示的片段g1174-a插入植物表达载体ptf101.1的smai酶切位点中，得到的真核重组表达载体。

将重组载体ptf101.1-g1174-a导入农杆菌eha101，得到农杆菌eha101/ptf101.1-g1174-a。

3、转ca-mg1-epsps烟草的获得

1)、选取生长旺盛的烟草w38(nicotianatobacumcv.wisconsin38，也可称为野生型烟草)的无菌苗(转接后10-15天)叶片，用锋利手术刀片切成1cm²小片，弃去中脉。

2)、将上述2制备的重组菌eha101/ptf101.1-ca-mg1-epsps-bar接种于yeb液体培养基中，28℃、200rpm培养至菌液od600nm＝0.6-0.8，得到菌液。

3)、将步骤1)处理后的烟草叶片浸泡于步骤2制备的菌液中，确保叶片切伤边缘完全与菌液接触，浸泡5min。

4)、完成步骤3)后，倾去菌液，将叶片转移到灭菌吸水纸上吸去多余菌液。

5)、完成步骤4)后，将叶片转移到共培养基中，叶片背面朝上25℃、暗培养2-3天。

6)、完成步骤5)后，将叶片转接到分化培养基上，25℃光照培养至分化出小芽，待分化出的小芽长至2-3cm，将其切下转接到生根培养基上(为确保得到的植株属于不同的转化株系，每个外植体只取一个不定芽)，25℃光照培养至生根成苗。

7)、完成步骤6)后，将生根苗转入温室中，晚上揭去封口膜，白天封上，炼苗2-3天后，将苗取出，在水中洗去附着于根上的培养基，小心栽入预备好的花盆中，置于阴凉处3-5天即可成活，获得t0代转ca-mg1-epsps烟草。

采用植物表达载体ptf101.1导入野生型烟草，得到t0代转空载体烟草。

采用农杆菌eha101/ptf101.1-g1174-a替代农杆菌eha101/ptf101.1-ca-mg1-epsps，按照步骤1-7进行操作，得到t0代转g1174-a烟草植株。

4、转ca-mg1-epsps基因烟草的分子鉴定

对步骤3获得的t0代转ca-mg1-epsps烟草和t0代转空载体烟草进行pcr检测，以转基因烟草苗的基因组dna为模板，pcr检测使用由引物f(5’-cggcgacatcaagtcccacg-3’)和引物r(5’-ggcgaagaactgcgggtagga-3’)组成的引物对。同时以未转化的烟草w38(nicotianatobacumcv.wisconsin38)作为阴性对照。

结果如图2所示，m：dl2000dnamarker；1-13：t0代转ca-mg1-epsps烟草；ck1：ptf101.1-ca-mg1-epsps-bar质粒；ck2：未转基因烟草w38；ck3：ddh2o；可以看出，t0代转ca-mg1-epsps烟草的不同株系均扩增得到了长度约为688bp的目的片段；而未转化烟草未扩增出目的片段。

二、转ca-mg1-epsps烟草的功能验证

待测植株：t0代转ca-mg1-epsps基因烟草植株、t0代转g1174-a基因烟草植株、未转化烟草w38(nicotianatobacumcv.wisconsin38)、t0代转空载体烟草；每种烟草植株各选取100株进行实验。

用含有41％(质量百分比)草甘膦异丙胺盐水剂的农达(中化作物保护品有限公司)按800ml/亩的量对待测植株叶片进行喷施，于施药1周、2周及4周后观察植株生长状态及叶片形态。实验重复三次。

从表1可以看出，转ca-mg1-epsps烟草无明显药害症状，受害率为0％，与转g1174-a烟草相比，表现出更好的草甘膦耐受能力。而未转化烟草及转化空载体烟草全部枯萎死亡，受害率为100％，结果表明t0代转ca-mg1-epsps烟草可以更好的耐受推荐剂量的4倍草甘膦。

表1转ca-mg1-epsps基因烟草草甘膦耐受能力试验

实施例4、ca-mg1-epsps基因的功能验证

一、转ca-mg1-epsps基因玉米

1、植物表达载体的构建

重组载体ptf101.1-ca-mg1-epsps-bar为将序列表的序列5所示的片段插入植物表达载体ptf101.1的smai酶切位点中，得到的真核重组表达载体。

2、重组农杆菌的制备

将上述构建的重组载体ptf101.1-ca-mg1-epsps-bar通过冻融法(参考文献：holstersm,dewaeled,depickera.transfectionandtransformationofagrobacteriumtumefaciens.molgengenet,1978,183:181-187)转入农杆菌eha101，得到重组农杆菌。

对重组农杆菌用由引物f(5’-cggcgacatcaagtcccacg-3’)和引物r(5’-ggcgaagaactgcgggtagga-3’)组成的引物对进行pcr鉴定，若得到目的条带大小为688bp，则为阳性重组菌。

将上述阳性重组菌命名为农杆菌eha101/ptf101.1-ca-mg1-epsps-bar。

重组载体ptf101.1-g1174-a为将序列表的序列1所示的片段g1174-a插入植物表达载体ptf101.1的smai酶切位点中，得到的真核重组表达载体。

将重组载体ptf101.1-g1174-a导入农杆菌eha101，得到农杆菌eha101/ptf101.1-g1174-a。

3、转ca-mg1-epsps基因玉米的获得

将2制备的的农杆菌eha101/ptf101.1-ca-mg1-epsps-bar采用农杆菌介导玉米幼胚转化方法(参考文献：杨小艳，转cry1ab-ma基因抗虫玉米植株的获得及其后代分析，分子植物育种，2015,13(9):1-6)转化受体玉米材料hi-ii(以下称为野生型玉米)的幼胚，共培养3天后依次转移到恢复培养基、筛选培养基、分化筛选培养基上，然后生根移栽获得t0代转ca-mg1-epsps基因玉米植株。

4、转基因玉米植株的分子鉴定

对步骤3获得的t0代转ca-mg1-epsps基因玉米进行pcr检测，以7-8叶期的玉米苗基因组dna为模板，pcr检测使用由引物f(5’-cggcgacatcaagtcccacg-3’)和引物r(5’-ggcgaagaactgcgggtagga-3’)组成的引物对。同时以未转化玉米材料hi-ii作为阴性对照。

结果如图3所示；m：dl2000dnamarker；1-10：t0代转ca-mg1-epsps基因玉米植株；ck1：ptf101.1-ca-mg1-epsps-bar质粒；ck2：未转基因玉米；ck3：ddh2o；结果表明，t0代转ca-mg1-epsps基因玉米的不同株系均扩增得到了长度约为688bp的目的片段；而未转化玉米材料未扩增出目的片段。

采用植物表达载体ptf101.1导入野生型玉米，得到t0代转空载体玉米。

采用农杆菌eha101/ptf101.1-g1174-a替代农杆菌eha101/ptf101.1-ca-mg1-epsps，采用农杆菌介导玉米幼胚转化方法，得到t0代转g1174-a烟草植株。

二、转ca-mg1-epsps基因玉米的功能验证

待测植株：t0代转ca-mg1-epsps基因玉米植株、t0代转g1174-a基因玉米植株、t0代转空载体玉米、玉米材料hi-ii。每种玉米植株各选取100株进行实验。

用含有41％(质量百分比)草甘膦异丙胺盐水剂的农达(中化作物保护品有限公司)，按800ml/亩的量对待测植株叶片进行喷施，于施药1周、2周、4周后观察植株生长状态及叶片形态。实验重复三次。

结果如表2和图4所示，转ca-mg1-epsps基因玉米(图4右)均能正常生长，无明显药害症状，受害率为0％，而转入g1174-a基因玉米大多数植株均能正常生长，喷药4周后受害率为11％，受害植株叶片出现黄化，生长受抑制。转入ptf101.1空载体的转基因玉米植株(图4左)和非转基因玉米的生长明显受抑制，叶片发黄枯萎，植株全部死亡。

结果表明t0代转ca-mg1-epsps玉米拥有足够的草甘膦抗性，能抗田间推荐浓度的4倍剂量。基因ca-mg1-epsps更容易获得有效的转化事件，这主要取决于优化后的ca-mg1-epsps基因密码子特征更适合在玉米中的表达。

表2转ca-mg1-epsps基因玉米草甘膦耐受能力试验

sequencelisting

<110>重庆市农业科学院中国农业科学院作物科学研究所

<120>一种人工合成抗草甘膦的突变基因及其表达载体与应用

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1320

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

agatccgacgccctgcccgccaccttcgacgtgatcgtgcatccagctcgcgaactccgc60

ggcgagcttcgcgctcagccatccaagaactacaccactcgctacctcctcgccgctgcc120

ctcgctgagggcgagacccgcgtggtgggcgtggctacctctgaggacgccgaggccatg180

ctccgctgcctccgcgactggggcgctggcgtggagcttgtgggcgatgacgccgtgatc240

cgcggtttcggcgctcgcccacaggccggtgtgaccctcaacccaggcaacgctggcgcg300

gtggcccgcctcctcatggccgtggccgctctcacctctggcaccactttcgtgaccgac360

tacccggactccctcggcaagcgccctcagggcgacctccttgaggccctcgaacgcctc420

ggtgcctgggtgtcctccaacgacggtcgcctcccgatctccgtgtccggcccagtgcgc480

ggtggcaccgtggaggtgtccgccgagcgctcctcccagtacgcctccgccctcatgttc540

ctcggccctctcctcccggacggactcgaactccgcctcaccggcgacatcaagtcccac600

gctccgctccgccagacactcgacaccctctctgacttcggcgtgcgcgccactgcctcc660

gacgacctccgccgcatctccatcccgggtggccagaagtaccgcccaggccgcgtgctc720

gtgccgggcgactacccgggctccgctgccatcctcaccgccgctgccctcctcccaggc780

gaggtgcgcctctctaacctccgcgagcacgacctccagggcgagaaggaggccgtgaac840

gtgctccgcgagatgggcgctgacatcgtgcgcgagggcgataccctcaccgtgcgcggt900

ggccgccctctccacgccgtgactcgcgacggcgattccttcaccgacgccgtgcaagcc960

ctcaccgccgctgctgccttcgccgagggcgacaccacctgggagaacgtggccactctc1020

cgcctcaaggagtgcgaccgcatctctgacacccgcgctgagcttgagcgcctcggcctc1080

cgcgcacgcgagaccgccgactctctctccgtgactggctctgctcacctcgctggtggc1140

atcaccgccgacggccacggcgaccaccgcatgatcatgctcctcaccctcctcggcctc1200

cgcgcagacgctccactccgcatcaccggcgcacaccacatccgcaagtcctaccctcag1260

ttcttcgctcacctcgaagccctcggcgctcgcttcgagtacgctgaggccaccgcctag1320

<210>2

<211>581

<212>prt

<213>artificialsequence

<400>2

metalaglnvalserargilecysasnglyvalglnasnproserleu

151015

ileserasnleuserlysserserglnarglysserproleuserval

202530

serleulysthrglnglnhisproargalatyrproileserserser

354045

trpglyleulyslysserglymetthrleuileglysergluleuarg

505560

proleulysvalmetserservalserthralacysmetalathrala

65707580

alaalaalaserthralaleuthrglyalathrthralaalaprolys

859095

alaargargargalahisleuleualathrargargalaleualaala

100105110

proileargcysseralaalaserproalametprometalapropro

115120125

alathrproleuargprotrpglyprothraspproarglysargser

130135140

aspalaleuproalathrpheaspvalilevalhisproalaargglu

145150155160

leuargglygluleuargalaglnproserlysasntyrthrthrarg

165170175

tyrleuleualaalaalaleualagluglygluthrargvalvalgly

180185190

valalathrsergluaspalaglualametleuargcysleuargasp

195200205

trpglyalaglyvalgluleuvalglyaspaspalavalilearggly

210215220

pheglyalaargproglnalaglyvalthrleuasnproglyasnala

225230235240

glyalavalalaargleuleumetalavalalaalaleuthrsergly

245250255

thrthrphevalthrasptyrproaspserleuglylysargprogln

260265270

glyaspleuleuglualaleugluargleuglyalatrpvalserser

275280285

asnaspglyargleuproileservalserglyprovalargglygly

290295300

thrvalgluvalseralagluargserserglntyralaseralaleu

305310315320

metpheleuglyproleuleuproaspglyleugluleuargleuthr

325330335

glyaspilelysserhisalaproleuargglnthrleuaspthrleu

340345350

serasppheglyvalargalathralaseraspaspleuargargile

355360365

serileproglyglyglnlystyrargproglyargvalleuvalpro

370375380

glyasptyrproglyseralaalaileleuthralaalaalaleuleu

385390395400

proglygluvalargleuserasnleuarggluhisaspleuglngly

405410415

glulysglualavalasnvalleuargglumetglyalaaspileval

420425430

arggluglyaspthrleuthrvalargglyglyargproleuhisala

435440445

valthrargaspglyaspserphethraspalavalglnalaleuthr

450455460

alaalaalaalaphealagluglyaspthrthrtrpgluasnvalala

465470475480

thrleuargleulysglucysaspargileseraspthrargalaglu

485490495

leugluargleuglyleuargalaarggluthralaaspserleuser

500505510

valthrglyseralahisleualaglyglyilethralaaspglyhis

515520525

glyasphisargmetilemetleuleuthrleuleuglyleuargala

530535540

aspalaproleuargilethrglyalahishisilearglyssertyr

545550555560

proglnphephealahisleuglualaleuglyalaargpheglutyr

565570575

alaglualathrala

580

<210>3

<211>1320

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

aggtccgacgccctgcccgccaccttcgacgtgatcgtgcacccagcgcgcgagctccgc60

ggcgagctccgcgctcagccgtccaagaactacaccacccgctacctcctcgccgccgcc120

ctcgccgagggcgagacccgcgtggtgggcgtggctacctccgaggacgccgaggccatg180

ctccgctgcctccgcgactggggcgccggcgtggagctggtgggcgatgacgccgtgatc240

cgcggtttcggcgctcgcccacaggccggcgtgaccctcaacccaggcaacgccggcgcg300

gtggcccgcctcctcatggccgtggccgccctcacctccggcaccaccttcgtgaccgac360

tacccggactccctcggcaagcgcccgcagggcgacctcctggaggccctcgagcgcctc420

ggcgcctgggtgtcctccaacgacggccgcctcccgatctccgtgtccggcccagtgcgc480

ggcggcaccgtggaggtgtccgccgagcgctcctcccagtacgcctccgccctcatgttc540

ctcggccctctcctcccggacggactcgagctccgcctcaccggcgacatcaagtcccac600

gccccgctccgccagacgctcgacaccctctccgacttcggcgtgcgcgccaccgcctcc660

gacgacctccgccgcatctccatcccgggcggccagaagtaccgcccaggccgcgtgctc720

gtgccgggcgactacccgggctccgccgccatcctcaccgccgccgccctcctcccgggc780

gaggtgcgcctctccaacctccgcgagcacgacctccagggcgagaaggaggccgtgaac840

gtgctccgcgagatgggcgctgacatcgtgcgcgagggcgacaccctcaccgtgcgcggc900

ggccgcccgctccacgccgtgacccgcgacggcgactccttcaccgacgccgtgcaggcc960

ctcaccgccgccgccgccttcgccgagggcgacaccacctgggagaacgtggccaccctc1020

cgcctcaaggagtgcgaccgcatctccgacacccgcgccgagctggagcgcctcggcctc1080

cgcgcacgcgagaccgccgactccctctccgtgaccggctccgctcacctcgccggcggc1140

atcaccgccgacggccacggcgaccaccgcatgatcatgctcctcaccctcctcggcctc1200

cgcgccgacgccccactccgcatcaccggcgcgcaccacatccgcaagtcctacccgcag1260

ttcttcgcccacctcgaggccctcggcgcccgcttcgagtacgccgaggccaccgcctga1320

<210>4

<211>1746

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>4

atggcgcaagttagcagaatctgcaatggtgtgcagaacccatctcttatctccaatctc60

tcgaaatccagtcaacgcaaatctcccttatcggtttctctgaagacgcagcagcatcca120

cgagcttatccgatttcgtcgtcgtggggattgaagaagagtgggatgacgttaattggc180

tctgagcttcgtcctcttaaggtcatgtcttctgtttccacggcgtgcatggccaccgcc240

gccgccgcgtctaccgcgctcactggcgccactaccgctgcgcccaaggcgaggcgccgg300

gcgcacctcctggccacccgccgcgccctcgccgcgcccatcaggtgctcagcggcgtca360

cccgccatgccgatggctcccccggccaccccgctccggccgtggggccccaccgatccc420

cgcaagaggtccgacgccctgcccgccaccttcgacgtgatcgtgcacccagcgcgcgag480

ctccgcggcgagctccgcgctcagccgtccaagaactacaccacccgctacctcctcgcc540

gccgccctcgccgagggcgagacccgcgtggtgggcgtggctacctccgaggacgccgag600

gccatgctccgctgcctccgcgactggggcgccggcgtggagctggtgggcgatgacgcc660

gtgatccgcggtttcggcgctcgcccacaggccggcgtgaccctcaacccaggcaacgcc720

ggcgcggtggcccgcctcctcatggccgtggccgccctcacctccggcaccaccttcgtg780

accgactacccggactccctcggcaagcgcccgcagggcgacctcctggaggccctcgag840

cgcctcggcgcctgggtgtcctccaacgacggccgcctcccgatctccgtgtccggccca900

gtgcgcggcggcaccgtggaggtgtccgccgagcgctcctcccagtacgcctccgccctc960

atgttcctcggccctctcctcccggacggactcgagctccgcctcaccggcgacatcaag1020

tcccacgccccgctccgccagacgctcgacaccctctccgacttcggcgtgcgcgccacc1080

gcctccgacgacctccgccgcatctccatcccgggcggccagaagtaccgcccaggccgc1140

gtgctcgtgccgggcgactacccgggctccgccgccatcctcaccgccgccgccctcctc1200

ccgggcgaggtgcgcctctccaacctccgcgagcacgacctccagggcgagaaggaggcc1260

gtgaacgtgctccgcgagatgggcgctgacatcgtgcgcgagggcgacaccctcaccgtg1320

cgcggcggccgcccgctccacgccgtgacccgcgacggcgactccttcaccgacgccgtg1380

caggccctcaccgccgccgccgccttcgccgagggcgacaccacctgggagaacgtggcc1440

accctccgcctcaaggagtgcgaccgcatctccgacacccgcgccgagctggagcgcctc1500

ggcctccgcgcacgcgagaccgccgactccctctccgtgaccggctccgctcacctcgcc1560

ggcggcatcaccgccgacggccacggcgaccaccgcatgatcatgctcctcaccctcctc1620

ggcctccgcgccgacgccccactccgcatcaccggcgcgcaccacatccgcaagtcctac1680

ccgcagttcttcgcccacctcgaggccctcggcgcccgcttcgagtacgccgaggccacc1740

gcctga1746

<210>5

<211>3435

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>5

agcttactcgaggtcattcatatgcttgagaagagagtcgggatagtccaaaataaaaca60

aaggtaagattacctggtcaaaagtgaaaacatcagttaaaaggtggtataaagtaaaat120

atcggtaataaaaggtggcccaaagtgaaatttactcttttctactattataaaaattga180

ggatgtttttgtcggtactttgatacgtcatttttgtatgaattggtttttaagtttatt240

cgcttttggaaatgcatatctgtatttgagtcgggttttaagttcgtttgcttttgtaaa300

tacagagggatttgtataagaaatatctttagaaaaacccatatgctaatttgacataat360

ttttgagaaaaatatatattcaggcgaattctcacaatgaacaataataagattaaaata420

gctttcccccgttgcagcgcatgggtattttttctagtaaaaataaaagataaacttaga480

ctcaaaacatttacaaaaacaacccctaaagttcctaaagcccaaagtgctatccacgat540

ccatagcaagcccagcccaacccaacccaacccaacccaccccagtccagccaactggac600

aatagtctccacacccccccactatcaccgtgagttgtccgcacgcaccgcacgtctcgc660

agccaaaaaaaaaaagaaagaaaaaaaagaaaaagaaaaaacagcaggtgggtccgggtc720

gtgggggccggaaacgcgaggaggatcgcgagccagcgacgaggccggccctccctccgc780

ttccaaagaaacgccccccatcgccactatatacatacccccccctctcctcccatcccc840

ccaaccctaccaccaccaccaccaccacctccacctcctcccccctcgctgccggacgac900

gagctcctcccccctccccctccgccgccgccgcgccggtaaccaccccgcccctctcct960

ctttctttctccgtttttttttccgtctcggtctcgatctttggccttggtagtttgggt1020

gggcgagaggcggcttcgtgcgcgcccagatcggtgcgcgggaggggcgggatctcgcgg1080

ctggggctctcgccggcgtggatccggcccggatctcgcggggaatggggctctcggatg1140

tagatctgcgatccgccgttgttgggggagatgatggggggtttaaaatttccgccgtgc1200

taaacaagatcaggaagaggggaaaagggcactatggtttatatttttatatatttctgc1260

tgcttcgtcaggcttagatgtgctagatctttctttcttctttttgtgggtagaatttga1320

atccctcagcattgttcatcggtagtttttcttttcatgatttgtgacaaatgcagcctc1380

gtgcggagcttttttgtaggtagaagtgatcaaccatggcgcaagttagcagaatctgca1440

atggtgtgcagaacccatctcttatctccaatctctcgaaatccagtcaacgcaaatctc1500

ccttatcggtttctctgaagacgcagcagcatccacgagcttatccgatttcgtcgtcgt1560

ggggattgaagaagagtgggatgacgttaattggctctgagcttcgtcctcttaaggtca1620

tgtcttctgtttccacggcgtgcatggccaccgccgccgccgcgtctaccgcgctcactg1680

gcgccactaccgctgcgcccaaggcgaggcgccgggcgcacctcctggccacccgccgcg1740

ccctcgccgcgcccatcaggtgctcagcggcgtcacccgccatgccgatggctcccccgg1800

ccaccccgctccggccgtggggccccaccgatccccgcaagaggtccgacgccctgcccg1860

ccaccttcgacgtgatcgtgcacccagcgcgcgagctccgcggcgagctccgcgctcagc1920

cgtccaagaactacaccacccgctacctcctcgccgccgccctcgccgagggcgagaccc1980

gcgtggtgggcgtggctacctccgaggacgccgaggccatgctccgctgcctccgcgact2040

ggggcgccggcgtggagctggtgggcgatgacgccgtgatccgcggtttcggcgctcgcc2100

cacaggccggcgtgaccctcaacccaggcaacgccggcgcggtggcccgcctcctcatgg2160

ccgtggccgccctcacctccggcaccaccttcgtgaccgactacccggactccctcggca2220

agcgcccgcagggcgacctcctggaggccctcgagcgcctcggcgcctgggtgtcctcca2280

acgacggccgcctcccgatctccgtgtccggcccagtgcgcggcggcaccgtggaggtgt2340

ccgccgagcgctcctcccagtacgcctccgccctcatgttcctcggccctctcctcccgg2400

acggactcgagctccgcctcaccggcgacatcaagtcccacgccccgctccgccagacgc2460

tcgacaccctctccgacttcggcgtgcgcgccaccgcctccgacgacctccgccgcatct2520

ccatcccgggcggccagaagtaccgcccaggccgcgtgctcgtgccgggcgactacccgg2580

gctccgccgccatcctcaccgccgccgccctcctcccgggcgaggtgcgcctctccaacc2640

tccgcgagcacgacctccagggcgagaaggaggccgtgaacgtgctccgcgagatgggcg2700

ctgacatcgtgcgcgagggcgacaccctcaccgtgcgcggcggccgcccgctccacgccg2760

tgacccgcgacggcgactccttcaccgacgccgtgcaggccctcaccgccgccgccgcct2820

tcgccgagggcgacaccacctgggagaacgtggccaccctccgcctcaaggagtgcgacc2880

gcatctccgacacccgcgccgagctggagcgcctcggcctccgcgcacgcgagaccgccg2940

actccctctccgtgaccggctccgctcacctcgccggcggcatcaccgccgacggccacg3000

gcgaccaccgcatgatcatgctcctcaccctcctcggcctccgcgccgacgccccactcc3060

gcatcaccggcgcgcaccacatccgcaagtcctacccgcagttcttcgcccacctcgagg3120

ccctcggcgcccgcttcgagtacgccgaggccaccgcctgagagctcgaattcccgatcg3180

ttcaaacatttggcaataaagtttcttaagattgaatcctgttgccggtcttgcgatgat3240

tatcatataatttctgttgaattacgttaagcatgtaataattaacatgtaatgcatgac3300

gttatttatgagatgggtttttatgattagagtcccgcaattatacatttaatacgcgat3360

agaaaacaaaatatagcgcgcaaactaggataaattatcgcgcgcggtgtcatctatgtt3420

actagatcggggatt3435