一种骨髓间充质干细胞特异性启动元件在干细胞中的应用的制作方法

本发明属于生物技术领域，涉及动物骨髓间充质干细胞特异性启动元件及其构建的标记载体和相应的转基因干细胞中的应用。

背景技术：

干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞群体。胚胎干细胞(es细胞或escs)是由早期胚胎内细胞团(icm)或原始生殖细胞(pgcs)分离而来的多能性干细胞。由于胚胎干细胞的独特生物学特性，使胚胎干细胞在细胞替代治疗、组织器官修复与重建、基因治疗以及发育生物学模型、新药开发和毒理实验等，几乎所有的生命科学和生物医药领域均具有重要的意义。近年来，科学家从多种来源和采用外源基因转染等方法也获得了类似胚胎干细胞的多能性干细胞。可以将所用具有es细胞特性的细胞通称为多能性干细胞。

近年来，干细胞疗法逐渐成为研究的热点，试图通过干细胞移植来修复病变的组织。利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内，使之表达目的基因产物，从而使疾病得到治疗，这种方法称为基因疗法(genetherapy)。基因疗法是治疗某些代谢疾病和遗传疾病的一种重要手段。其中载体和受体细胞(靶细胞)是决定基因治疗效果的关键因素。用于基因治疗的载体有多种，其中病毒载体因其介导基因转染率高，靶向性好，已成为基因治疗中应用广泛基因运载工具。但是具有组织表达特异性或者具有细胞表达选择性的载体由于能够实现精准投递药物，因此，具有干细胞特异性表达的载体是研发的一个重点方向。

袁红花等在“神经干细胞特异性调控启动子研究”中初步证实基因启动子与内含子协同调控外源基因在蛋白阳性细胞内特异性表达,中蛋白是神经干细胞特异性蛋白,基因启动子与内含子一同样能协同调控外源基因在神经干细胞内特异性表达,这将为开展神经干细胞基因调控、药物在神经干细胞中的靶向定位等研究提供重要平台。

但是在骨髓间充质干细胞中目前还没有特异性表达的启动子的研究。

技术实现要素：

本发明的启动子的制备方法，具体步骤是：

(1)骨髓间充质干细胞膜表面蛋白和造血干细胞膜表面蛋白提取；

(2)双向电泳分析

(3)差异蛋白质谱分析以及相应启动子序列的克隆

(4)gfp荧光验证。

本发明的一个目的在于提供一种启动子，作为基因治疗的干细胞的特异性表达启动子，用于转基因药物的表达、储存和释放的载体，以提高靶向干细胞的成功率。

本发明的骨髓间充质干细胞特异性的mscp启动子，其至少包含seqidn0.1所示的核苷酸序列。

所述启动子的dna序列如以下1)或2)或3)所示：

1)其dna序列为seqidno.1所示核苷酸序列；

2)在严格条件下与1)限定的dna序列能够杂交且能促进目的基因转录和翻译的dna序列；

3)与1)或2)限定的dna序列具有90％以上同源性，且能促进目的基因转录和翻译的dna序列。

在本发明的另一方面，还涉及含有上述mscp启动子基因或者是载体。

在本发明的另一方面，本发明还涉及上述mscp启动子在制备转基因干细胞中的应用，优选的，在制备骨髓间充质干细胞中的应用。

本发明获得的mscp启动子，能够在骨髓间充质干细胞的膜表面进行表达，同时能介导外源基因稳定高效的表达。而在其他细胞中低表达，具有较好的细胞器表达特异性，能介导外源基因精准的表达。因此本发明即获得了一个能介导外源基因在骨髓间充质干细胞中精准、高效和稳定表达的启动子，为今后相关研究奠定基础。

附图说明

图1为差异蛋白比较图。

图2为启动子表达活性相对比较图。

具体实施方式

实施例1启动子序列的获得

1.细胞培养

将细胞骨髓间充质干细胞细胞msc(huxma-01001，赛业(苏州)生物科技有限公司)和造血干细胞细胞hsc(ey-x1044，上海一研生物科技有限公司)以2x10⁵ml-1浓度接种于含或不含药物的新鲜rpmi1640完全培养液内含10％小牛血清，100u/ml青霉素，100u/ml链霉素中，在37℃、饱和湿度、含5％co2培养箱中进行培养，隔日换液以保证细胞浓度在2x10⁵-5x10⁵/ml。

2.细胞膜蛋白的提取

1)将骨髓间充质干细胞细胞msc和造血干细胞细胞hsc用预冷的1xpbs(ph8.5)洗涤3遍。

2)重悬细胞于4mg/ml的1xpbs配制的ph8.5的ezlink-sulfo-nhs-ss-biotin标记缓冲液中，4℃振荡标记30min。

3)1000g离心5min，弃上清，以1ml的1xpbs配制的10mm的ph8.5的甘氨酸重悬细胞，中和过量的ezlink-sulfo-nhs-ss-biotin标记缓冲液，4℃振荡5min。

4)离心弃上清，1xpbs(ph8.5)洗涤细胞沉淀，重复3遍。

5)收集细胞，加5ml细胞裂解缓冲液重悬细胞，用玻璃匀浆器匀浆30次以上，冰上孵育1h，期间每隔5min振荡一次。

6)12000g离心10min，收集上清，弃沉淀。

7)上清中加入1ml交联streptavidin-latex纯化基质，剧烈振荡均匀，4℃振荡标记1h。

8)12000g离心10min，弃上清，latex交联蛋白沉淀用1ml细胞裂解缓冲液重悬洗涤2次。

9)12000g离心10min，弃上清，latex交联蛋白沉淀用1m1,0.1m的nahc03溶液重悬洗涤2次。

10)12000g离心10min，弃上清，latex交联蛋白沉淀用1m1,1m的kcl溶液重悬洗涤2次，去除胞浆蛋白。

11)12000g离心10min，弃上清，latex交联蛋白沉淀用100μl洗脱缓冲液重悬，60℃洗脱15min。

12)12000g离心10min，收集上清，即为骨髓间充质干细胞膜表面蛋白和造血干细胞膜表面蛋白。

3差异膜蛋白的筛选分析及序列鉴定

将上述提取得到的膜表面蛋白采用双向电泳进行蛋白差异检测，采用考马斯亮蓝染液(0.2％考马斯亮蓝8250,0.05％考马斯亮蓝6250,10％乙酸，45％甲醇)染色3h，染色过程中，胶在摇床上轻摇，用脱色液(10％乙酸，20％乙醇)反复脱色直至背景清晰。染色后的双向电泳凝胶用凝胶图象扫描仪(imagescanner)透射扫描。数字化图像文件采用amershampharmacia公司的二维电泳处理软件(imagemastertm2delite3.0)分析，获得每个蛋白点的分子量、等电点及相对含量。选择蛋白表达量最高，差异最显著的差异点，切出蛋白点后进行脱色、胶内胰酶酶切(in-geldigestion)和肽段提取，然后用maldi-tof-ms进行肽质量指纹谱(pmf)分析。获得了相应的蛋白的氨基酸序列，具体见图1所示。获得了具有特异性差异表达的一个差异极其大的一个靶标蛋白。

4.启动子序列的获得

根据氨基酸序列，获得相应的核苷酸序列，在ncbi中进行比对，获得了相应的基因区域，根据全基因组序列，进行相应的启动子区域分析，将可能的启动子区域进行分段合成，进行启动子活性验证，最终筛选得了该蛋白的启动子序列，其序列如seqidno：1所示，命名为mscp。seqidno：1所示：

tttatttctttatcctagaccattagttttgcagtactcatgagcctctttcaactccctcgagagtgtcatggcatcctctaaaggtaacttgtggggcatgcaaatctctctgccttgacatctttcacccctacaggtagggtttgatgctgtacctttgcactacttggtggcatatctttctcctcaccaccaccctcccacccccggcaccccactgctggcttcaactccaaaacttagagcatggttgggtgtccatcaccttctctttttgcaggaactataaaatacatagataagtgtataatctgtacaactaatgcccatttcatcactggcatttacaaaaatgaagaaatgaaaatgctgtaaataaaattaaaatctctttgac

通过分析，发现该启动子具有如下的启动子相关的元件。也就是这些元件提供了该启动子的核心启动功能。

实施例2启动子功能验证

1.启动子的扩增

以上游引物f：sacⅰ-tttatttctttatcctagac和下游引物hindⅲ-gtcaaagagatttaatttta以骨髓间充质干细胞的dna为模板进行扩增，按常规pcr体系，扩增条件如下：pcr体系见表1，pcr程序为94℃预变性10分钟，94℃变性1分钟，60℃退火1分钟，延伸2分钟，共进行35个循环。得到启动子序列，采用试剂盒进行纯化。使用sacⅰ和hindⅲ,37℃分别双酶切质粒启动子序列和pegfp-17g/l的tae琼脂糖凝胶电泳双酶切产物,dna回收试剂盒切胶回收启动子片段，使用dna回收试剂盒直接纯化回收pegfp-1酶切后的骨架载体。将上述两种回收产物按启动子片段(mol)∶pegfp-1(mol)为3∶1的比例,按连接试剂盒操作说明操作,16℃连接过夜。取连接反应液10μl转化至感受态细胞jm109,用soc培养液37℃恒温箱培养1h后,涂布于含50mg/l卡那霉素的lb平板,37℃过夜培养。挑取单菌落,于含50mg/l卡那霉素的lb培养液中,37℃恒温振荡培养过夜,用质粒抽提试剂盒抽提质粒,经过pcr鉴定，获得载体pegfp-mscp。

2.细胞转染及转染细胞中egfp表达的观察在

将骨髓间充质干细胞细胞msc、造血干细胞细胞hsc、肿瘤细胞95d进行培养，24孔板中接种对数生长期细胞2×10⁵个/孔,用不含抗生素但含15％小牛血清的dmem培养液培养24h,至细胞铺满孔底95％时,用不含血清和抗生素的dmem培养液洗2次。按每孔0.8μg质粒/2μl脂质体,用无血清无抗生素的dmem培养液分别稀释脂质体和所要转染的质粒pegfp-mscp至50μl,室温下静置5min。将稀释后的脂质体和质粒混合并轻柔混匀,室温下静置20min。加入脂质体-dna混合物100μl/孔,轻轻混匀。培养6h后每孔中加入等体积的含30％小牛血清的无抗生素dmem培养液。24h后,于倒置荧光显微镜下观察各细胞中egfp的表达情况。pegfp-mscp为实验组,pegfp-1为阴性对照组,pegfp-cmv为阳性对照组。

3.mscp启动子调控的egfp表达效果

荧光显微镜下,可以观察到在转染pegfp-mscp质粒的肿瘤细胞系95d、造血干细胞细胞中egfp基本不表达或者表达非常微弱。pegfp-cmv在的肿瘤细胞系95d、造血干细胞细胞中egfp表达很强。在转染pegfp-mscp质粒的骨髓间充质干细胞中egfp表达非常强，并且也可以发现，在细胞中主要在细胞表面进行高强度表达，具有一定的细胞器表达选择性。pegfp-cmv在转染骨髓间充质干细胞中egfp表达很强。以pegfp-cmv在转染骨髓间充质干细胞的中的表达量作为参照量，计算pegfp-mscp质粒在不同细胞中表达的相对的的表达量的数据参见图2所示。本发明提供的mscp启动子在骨髓间充质干细胞中具有较好的特异性并且启动子活性也较高。

从以上结果可以看出，本发明的启动子具有较好的细胞选择特性，为后续的细胞模型或者细胞治疗打下坚实的基础。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110>宜春莲泽生物科技发展有限公司

<120>一种骨髓间充质干细胞特异性启动元件在干细胞中的应用

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

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<212>dna

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