小麦生长势相关SNP及其作为靶点在鉴定小麦生长势性状中的应用的制作方法

本发明涉及一种小麦生长势相关snp及其作为靶点在鉴定小麦生长势性状中的应用。

背景技术：

人口数量膨胀与极端气候加剧，传统育种周期繁杂冗长，粮食生产与需求失调，使得作物育种工作面临巨大压力。作物育种是一个概率过程,不同育种环境下可供选择品系越多,选育出优势基因型几率越大。如何快速、精准动态获取不同环境下大型育种群体表型参数，并与基因型、环境因子参数进行关联分析,选育特定育种目标基因型己成为现代育种和表型组学的迫切需求。

过去20年，分子表达谱技术和传统基因测序技术极大推动植物基因组学发展，高通量基因测序、分子标记辅助育种和基因组选择技术应用进一步加速育种进程。随着数据采集平台、传感器及数据处理和分析方法发展，髙通量表型测定技术不断被引入作物育种研究领域。利用无人机平台搭载多种传感器获取高分辨率田间作物图像数据,结合数字图像处理技术提取作物表型信息和表型数据分析方法,被广泛应用于获取各种表型参数，包括预测作物地上部产量和衰老速率、植被归一化指数、冠层温度、植株密度等。高通量田间作物表型测定相关性状，更接近育种实践，利于评估基因型、环境因子及其相互作用对表型影响，有效提高育种效率并辅助缩短育种进程。

小麦强生长势利于提高生育前期生物量积累、叶面积、根系形态对水资源、养分的利用效率，促进植株后期发育并提高产量。苗期群体植株高度是鉴定小麦生长势的重要性状，影响株型、种植密度、收获指数和抗倒伏系数，最终决定籽粒产量形成。小麦株高受品种、基因型、环境等多因素协同调控，是多基因控制的复杂数量性状，主要受加性、上位性及环境互作效应调控。迄今为止，在大田试验和室内试验中利用手持型仪器对根系、叶面积、生物量、株高等方面已开展较多研究。其中，通过突变体结合分子生物学手段已发现25个矮秆基因(rht)。小麦中大多数矮秆基因已经被发掘并开发出与之紧密连锁的分子标记应用于标记辅助选择育种中,其中rht-b1、rht-d1及rht8矮秆基因在世界范围内应用最为广泛。位于4b和6d染色体上的rht-b1和rht-d1基因都属于赤霉素不敏感基因,对小麦茎节伸长有重要影响；rht8位于2d染色体上,属于油菜素类固醇不敏感基因；携带rht8矮秆位点的导入系比对照株系生长势矮化,穗长变短,小穗数无变化,从而产生密穗型表型。借助高通量表型测定技术对于小麦生育早期与生长势基因相关的位点较为罕见，开发育种可用的标记更是少之又少。因此，发掘新的遗传效应值稳定表达且紧密连锁的数量性状位点,对分子标记辅助选育优良的小麦品种具有重要意义。

中麦895是中国农业科学院作物科学研究所、中国农业科学院棉花研究所以周麦16为母本、荔垦4号为父本杂交选育而成的半冬性多穗型中晚熟品种。在2013-2015年品种比较试验和大田示范中表现出高产广适、灌浆后期耐高温等特点。扬麦16是长江中下游麦区种植面积最大的品种，具有灌浆速度快、粒重高等特点。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种小麦生长势相关snp及其作为靶点在鉴定小麦生长势性状中的应用。

本发明提供了特异引物组，由引物a、引物b和引物c组成；

引物a为如下(a1)或(a2)：

(a1)序列表的序列1所示的单链dna分子；

(a2)将序列1经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列1具有相同功能的dna分子；

引物b为如下(b1)或(b2)：

(b1)序列表的序列2所示的单链dna分子；

(b2)将序列2经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列2具有相同功能的dna分子；

引物c为如下(c1)或(c2)：

(c1)序列表的序列3所示的单链dna分子；

(c2)将序列3经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且与序列3具有相同功能的dna分子。

本发明还保护所述引物组的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)或(d6)或(d7)或(d8)或(d9)或(d10)或(d11)或(d12)或(d13)或(d14)：

(d1)鉴定小麦基于特异snp的基因型；

(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的生长势性状；

(d3)鉴定或辅助鉴定小麦的株高性状；

(d4)筛选或选育具有低生长势的小麦单株或株系或品系或品种；

(d5)筛选或选育具有高生长势的小麦单株或株系或品系或品种；

(d6)筛选或选育株高较低的小麦单株或株系或品系或品种；

(d7)筛选或选育株高较高的小麦单株或株系或品系或品种；

(d8)制备用于鉴定小麦基于特异snp的基因型的产品；

(d9)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的生长势性状的产品；

(d10)制备用于鉴定或辅助鉴定小麦的株高性状的产品；

(d11)制备用于筛选或选育具有低生长势的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

(d12)制备用于筛选或选育具有高生长势的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

(d13)制备用于筛选或选育株高较低的小麦单株或株系或品系或品种的产品；

(d14)制备用于筛选或选育株高较高的小麦单株或株系或品系或品种的产品。

本发明还保护一种试剂盒，包括所述特异引物组。

所述试剂盒还包括特异引物组。所述特异探针组由荧光探针a、淬灭探针a、荧光探针b和淬灭探针b组成；荧光探针a如序列表的序列6所示，5’末端连接荧光基团；荧光探针b如序列表的序列7所示，5’末端连接荧光基团；荧光探针a和荧光探针b中的荧光基团不同；淬灭探针a如序列表的序列8所示，3’末端连接淬灭基团；淬灭探针b如序列表的序列9所示，3’末端连接淬灭基团。荧光探针a具体连接fam荧光基团。荧光探针b具体连接hex荧光基团。淬灭探针a具体连接淬灭基团bhq。淬灭探针b具体连接淬灭基团bhq。

所述试剂盒还包括kasp2×mastermix。

本发明还保护所述试剂盒的应用，为如下(d1)或(d2)或(d3)或(d4)或(d5)或(d6)或(d7)：

(d1)鉴定小麦基于特异snp的基因型；

(d2)鉴定或辅助鉴定小麦的生长势性状；

(d3)鉴定或辅助鉴定小麦的株高性状；

(d4)筛选或选育具有低生长势的小麦单株或株系或品系或品种；

(d5)筛选或选育具有高生长势的小麦单株或株系或品系或品种；

(d6)筛选或选育株高较低的小麦单株或株系或品系或品种；

(d7)筛选或选育株高较高的小麦单株或株系或品系或品种。

本发明还保护一种鉴定待测小麦的生长势性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异snp的基因型；aa基因型小麦的生长势高于gg基因型小麦。aa基因型小麦的生长势高于gg基因型小麦和ag基因型小麦。

本发明还保护一种鉴定待测小麦的株高性状的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异snp的基因型；aa基因型小麦的株高高于gg基因型小麦。aa基因型小麦的株高高于gg基因型小麦和ag基因型小麦。

本发明还保护一种小麦育种的方法，包括如下步骤：检测待测小麦基于特异snp的基因型；选择aa基因型小麦进行育种。所述育种的目的为获得高生长势的品种。所述育种的目的为获得高株高的品种。

以上任一所述特异snp为如下(e1)或(e2)：

(e1)位于小麦基因组中的序列表的序列4所示dna分子的第36位核苷酸；

(e2)位于小麦基因组中的序列表的序列5所示dna分子的第21位核苷酸。

以上任一所述方法中，检测待测小麦基于特异snp的基因型的步骤如下：

(1)以待测小麦的基因组dna为模板，采用所述特异引物组进行kasp；

(2)完成步骤(1)后，进行荧光扫描，确定待测小麦基于特异snp的基因型。

所述方法中，kasp的反应体系中，引物f1和引物f2的浓度均为0.134μm，引物r的浓度为0.336μm。

所述方法中，kasp的反应体系(5.2μl)：20ng/μl模板dna3.0μl，2×kaspreactionmix2.0μl，引物混合试剂0.1μl，ddh2o0.1μl。

所述方法中，kasp在ptc-200pcr扩增仪上进行。

所述方法中，kasp的反应程序：

94℃预变性15min；

94℃变性30s，退火60s(第1个循环退火温度为61℃，每个循环退火温度下降0.6℃)，72℃延伸30s，11个循环；

94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min。

所述方法中，确定待测小麦基于特异snp的基因型的方法为：采用klustercaller软件对酶标仪扫描数据进行分析，显示为蓝色的样本的基因型为aa纯合型，显示为红色的样本的基因型为gg纯合型。

所述方法中，确定待测小麦基于特异snp的基因型的方法为：采用klustercaller软件对酶标仪扫描数据进行分析，显示为蓝色的样本的基因型为aa纯合型，显示为红色的样本的基因型为gg纯合型，显示为绿色的样本的基因型为ag杂合型。

本发明还保护一种特异dna分子，如序列表的序列4或序列表的序列5所示。

本发明还保护所述特异dna分子在鉴定或辅助鉴定小麦的生长势性状中的应用。

本发明还保护所述特异dna分子在鉴定或辅助鉴定小麦的株高性状中的应用。

以上任一所述株高为成株株高。

所述待测小麦为阿夫、ca1055、ca1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、川麦52、绵阳26、宁麦9号、镇麦6号、中麦895或扬麦16。

本发明公开了与小麦生长势相关的kasp标记及其应用。利用本发明的kasp标记专用引物可用于鉴定待测小麦基于特异snp的基因型为aa、gg还是ag，并根据待测小麦的基因型即可辅助鉴定其生长势：aa基因型的待测小麦的生长势大于ag或gg基因型的待测小麦，进而可用于生长势优良的小麦品种，为选育高产稳产品质优良的小麦品种奠定理论基础且提供分子辅助选择手段。

附图说明

图1为snp标记与qph.caas-6ds基因的连锁图。

图2为检测不同品种小麦snp位点的基因型的结果图。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。扬麦16：中国农业发展集团有限公司，品种权号：cna20030436.4。麦895：河南新大农业发展有限公司，国审麦2012010。序列表的序列4中，r代表a或g。序列表的序列5中，r代表a或g。

实施例1、与小麦生长势性状相关的kasp标记专用引物的获得

一、生长势性状调查及snp标记分析

选用扬麦16、中麦895以及扬麦16和中麦895的dh群体(包括亲本共200个家系)作为实验材料。

1、生长势表型获得

在田间环境下,采用无人机近感平台获取高分辨率的实验小区的航拍图像。用pix4dmapper软件(pix4d，switzerland)对航拍图像进行处理和三维重建,生成整个实验地的正射拼接图像和dsm进行地理位置并校正。这些三维的重建输出结果都带有水平位置(经纬度)信息,其中正射拼接图像和dsm分别携带有每个重建点的颜色和高程信息。按实验区布置,将整个实验地dsm分割为单个小区。基于各小区dsm,利用现有的两种主流方法(点云法和参照地面法)估算各小区生长势。

株高(h)的定义为植株的上边界(upperboundary,u)和地面高程(groundlevel,g)间的最短距离，即h＝u-g。

2、snp标记分析

利用illuminasnp基因分型平台对扬麦16/中麦895的dh群体进行660ksnp芯片分型，包括bs、bobwhite、cap、d_contig等，共计630518个。博奥生物有限公司：capitalbiocorporation,beijing,china；http://bioservices.capitalbio.com。主要步骤：1)将待测小麦的基因组dna进行全基因组扩增，得到扩增产物；2)扩增产物用随机内切酶酶切断化，得到dna片段；3)将dna片段与芯片进行杂交，芯片的微珠上连接有50-mers长度特异性捕获探针，dna片段与探针互补结合；4)清洗去除未杂交上的或错配杂交上的dna片段；5)二硝基酚(dinitrophenol)和生物素(biotin)标记的核苷酸底物(a/t和c/g)在捕获探针上进行单碱基延伸，只有与gdna发生互补结合的探针才能得到延伸；通过染色，a/t和c/g将分别标记不同的荧光染料；6)芯片扫描，并利用软件根据两种荧光判读并输出分型结果。

626276个snp标记在扬麦16/中麦895的dh群体内存在差异。

二、关联基因定位和连锁标记ax-109983482的发现

利用sas9.2软件(sasinstitute.2000)进行基本统计量、多重比较分析，并结合sas的glmselect程序对snp数据和株高性状进行逐步回归，根据p值(p<0.01)判断关联位点。定位出ax-109983482与位点qph.caas-6ds关联(p<0.001)。

小麦基因组中特异snp及其周边序列如序列表的序列4所示，其中第36位为特异snp位点，为a/g多态。特异snp位点又称为ax-109983482位点。

三、ax-109983482位点的等位基因特异标记鉴定

分别提取12个扬麦16/中麦895的dh群体的全基因组dna。以各个基因组dna为模板检测小麦基于ax-109983482位点的基因型，结果见表1。结果表明：基于ax-109983482位点的基因型为aa时，小麦品种具有较高生长势，说明ax-109983482位点能够有效鉴定小麦品种生长势。

表1ax-109983482标记等位变异在扬麦16/中麦895dh群体中的分离

根据wheatdartmapsversion1.2(http://www.triticarte.com.au)和allen等公布的小麦分子标记图谱，将标记ax-109983482整合到小麦遗传图谱上，结果如图1所示。确定qph.caas-6ds在染色体6d上的18.66mb位置。

四、kasp标记专用引物的开发

针对ax-109983482位点kasp标记专用引物，即特异引物组，由2条上游引物(引物f1和引物f2)和1条下游引物(引物r)组成。特异引物组在小麦基因组中的靶序列如序列表的序列5所示。

引物f1(序列1)：5’-gaaggtgaccaagttcatgctggaagattatcggagctggca-3’；

引物f2(序列2)：5’-gaaggtcggagtcaacggattggaagattatcggagctggcg-3’；

引物r：(序列3)：5’-cccaccgaactaaacaccca-3’。

引物f1与引物r组合可以扩增ax-109983482位点基因型为aa的片段，引物f2与引物r组合可以扩增ax-109983482位点基因型为gg的片段。引物f1中的下划线标注的序列命名为fam荧光序列，引物f2中的中的下划线标注的序列命名为hex荧光序列。

实施例2、snp的应用

测试组供试小麦：阿夫、ca1055、ca1133、轮选987、京冬8号、秦农731、皖麦52、济宁16、济麦21、鲁麦15、洛麦21、川麦52、绵阳26、宁麦9号、镇麦6号。对照组供试小麦：中麦895和扬麦16。

一、检测小麦的生长势表型

获得各个供试小麦的成株株高。

小麦生长势测定于2018年在中国农业科学院东圃农场进行。在田间环境下，采用无人机近感平台获取高分辨率的实验小区的航拍图像。用pix4dmapper软件(pix4d，switzerland)对航拍图像进行处理和三维重建,生成整个实验地的正射拼接图像和dsm进行地理位置并校正。这些三维的重建输出结果都带有水平位置(经纬度)信息,其中正射拼接图像和dsm分别携带有每个重建点的颜色和高程信息。按实验区布置,将整个实验地dsm分割为单个小区。基于各小区dsm,利用参照地面法估算各小区生长势。株高(h)的定义为植株的上边界(upperboundary,u)和地面高程(groundlevel,g)间的最短距离，即h＝u-g。

二、检测不同品种小麦snp位点的基因型

检测各个供试小麦基于特异snp的基因型。

提取供试小麦的基因组dna，以基因组dna为模板，采用实施例1的步骤四中的kasp标记专用引物进行kasp。其中，携带荧光序列fam的扩增产物经荧光照射显示蓝色，而携带荧光序列hex的扩增产物经荧光照射显示红色。

反应体系(总体积为5.2μl)：20ng/μl模板dna3.0μl，2×kaspreactionmix2.0μl，引物混合试剂(assaymix)0.1μl，ddh2o0.1μl。2×kaspreactionmix，又称为kasp2×mastermix，为lgc公司产品(货号kbs-1016-002)。2×kaspreactionmix包括荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真的taq酶，dntp等。荧光探针a的序列为5′-gaaggtgaccaagttcatgct-3′，5′末端连接1个荧光基团fam；荧光探针b的序列为5′-gaaggtcggagtcaacggatt-3′，5′末端连接1个荧光基团hex；淬灭探针a的序列为5′-agcatgaacttggtcaccttc-3′，3′末端连接淬灭基团bhq；淬灭探针b的序列为5′-aatccgttgactccgaccttc-3′，3′末端连接淬灭基团bhq。引物混合试剂提供的有效成分为引物f1、引物f2和引物r。反应体系中，引物f1和引物f2的浓度均为0.134μm，引物r的浓度为0.336μm。

反应在ptc-200pcr扩增仪上进行，采用touchdownpcr扩增程序。反应程序为：94℃预变性15min；94℃变性30s，退火60s(第1个循环退火温度为61℃，每个循环退火温度下降0.6℃)，72℃延伸30s，11个循环；94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸30s，26个循环；72℃延伸5min；10℃保存。

将反应产物在pherastar^plus荧光酶标仪上用荧光照射进行基因分型，然后在klustercaller^tm软件读取分型后的数据，仅显示蓝色图像则说明ax-109983482位点的基因型为aa；仅显示红色图像则说明ax-109983482位点的基因型为gg；显示绿色图像则说明ax-109983482位点的基因型为ag。

部分结果见图2。

三、基因型与性状的关系

步骤二得到各个小麦的基因型及其步骤一得到的各个小麦的株高性状(生长势)见表2。

表2小麦品种的snp位点的基因型和生长势结果

以上结果表明：阿夫、京冬8号、鲁麦15、洛麦21、川麦52、绵阳26、宁麦9号、镇麦6号和扬麦16在snp位点的基因型均为aa，且这些小麦均具有较高的生长势。从上述结果中还可看出，snp位点的基因型为aa的小麦的生长势高于基因型为gg的小麦。上述结果表明，上述snp位点可以快速、准确地鉴定小麦品种是否具有较高的生长势。

可以建立以下方法：a小麦(ax-109983482位点基因型为a的纯合体，基因型为aa)的生长势大于b小麦(基因型为gg或基因型为ag)。

可以建立以下方法：a小麦(ax-109983482位点基因型为a的纯合体，基因型为aa)的株高大于b小麦(基因型为gg或基因型为ag)。

sequencelisting

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>小麦生长势相关snp及其作为靶点在鉴定小麦生长势性状中的应用

<130>gncyx190139

<160>9

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>42

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>1

gaaggtgaccaagttcatgctggaagattatcggagctggca42

<210>2

<211>42

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>2

gaaggtcggagtcaacggattggaagattatcggagctggcg42

<210>3

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>3

cccaccgaactaaacaccca20

<210>4

<211>71

<212>dna

<213>triticumaestivuml

<400>4

tctagacatccctcgggaagattatcggagctggcrgtttccaacacccctaagaaaaat60

tagggaaaacc71

<210>5

<211>80

<212>dna

<213>triticumaestivuml

<400>5

ggaagattatcggagctggcrgtttccaacacccctaagaaaaattagggaaaaccattc60

tgggtgtttagttcggtggg80

<210>6

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>6

gaaggtgaccaagttcatgct21

<210>7

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>7

gaaggtcggagtcaacggatt21

<210>8

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>8

agcatgaacttggtcaccttc21

<210>9

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<400>9

aatccgttgactccgaccttc21