一种杏鲍菇组成型启动子及其应用的制作方法

本发明属于启动子领域，特别涉及一种杏鲍菇组成型启动子及其应用。

背景技术：

杏鲍菇是一种重要的食用和药用蘑菇，近年来我国杏鲍菇的工厂化栽培发展非常迅速。利用杏鲍菇中基因组中的组成型基因的启动子来驱动外源功能基因表达，是快速改良杏鲍菇品种的重要方法。

甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，gpd)是糖酵解途径中的关键酶之一，催化nadh依赖性的二羟丙酮磷酸转化为甘油-3磷酸。由于功能保守，gpd基因在人类、动物、植物和真菌中广泛存在。不同物种的gpd基因家族可能包含一到几个成员。序列比较显示不同物种的gpd蛋白高度保守并且含有nad+结合结构域，c末端催化结构域和一些保守氨基酸残基。

gpd在很多不同的物种中都是高表达的基因。例如，gpdmrna占酿酒酵母中总poly(a)+rna的2-5％。由于gpd的高表达，gpd基因的启动子经常被用于遗传转化载体中驱动担子菌中的异源基因表达。但是，在含有多个gpd拷贝的物种中，从正确的gpd拷贝中选择启动子至关重要，否则启动子可能在某些发育阶段或环境条件中不起作用，甚至可能完全不起作用。因此，需要分析杏鲍菇的gpd基因家族不同成员的表达情况，并开发出一种新的高效启动子。

技术实现要素：

本发明所要解决的技术问题是提供一种杏鲍菇组成型启动子及其应用，该启动子可以高效地驱动外源基因在杏鲍菇中表达。

本发明提供了一种杏鲍菇组成型启动子，所述启动子序列的核苷酸序列如seqno.1所示。

本发明还提供了一种用于体外扩增所述的启动子的引物，其序列如seqno.2-3所示。

本发明还提供了一种启动子在杏鲍菇中过量表达外源基因中的应用。

通过blast分析，从杏鲍菇基因组中找到了两个gpd基因，它们的蛋白序列一致性高达95.8％，将其分别命名为pegpd1和pegpd2。将它们的蛋白序列与其他已发表的担子菌gpd蛋白序列进行比较发现，杏鲍菇gpd与平菇gpd的相似性最高，达到99％，与凤尾菇、真姬菇、香菇和双孢菇的gpd相似性分别为92.5、81.1、79.5和66.8。基于gpd氨基酸序列构建的进化树显示，gpd之间的关系较好地反映了编码这些蛋白质的物种之间的进化关系(图1)。

为了揭示pegpd1和pegpd2的表达模式，从杏鲍菇转录组测序数据中研究了这两个基因的表达情况。尽管pegpd1在氨基酸水平上与pegpd2非常相似，但在编码序列的1011个核苷酸中它们之间存在145个snp(单核苷酸多态性)。使用这些snp，可以区分转录组数据中的pegpd1和pegpd2的读数。分析表明，pegpd1在杏鲍菇的不同发育阶段都为组成型高表达，包括菌丝体期、原基发生期和两个子实体期。pegpd2的表达水平在所有发育阶段都远低于pegpd1(图2)。

本发明还进一步研究了pegpd1起始密码子上游的一千个核苷酸的启动子区域的保守元件。分析结果显示转录起始点位于起始密码子atg上游61个核苷酸处。三个caat盒位于转录起始点上游-380nt，-342nt和-248nt处。tata盒位于转录起始点-29nt处(图3)。结合转录分析和序列分析的结果，发现pegpd1在所有发育阶段都是组成型和高表达的。因此，pegpd1的启动子可用于驱动外源基因在杏鲍菇中表达。

有益效果

本发明可以高效地驱动外源基因在杏鲍菇中表达，为通过遗传方法改良符合生产需求和消费者喜爱的杏鲍菇新品种奠定基础，具有良好的市场应用前景。

附图说明

图1为杏鲍菇gpd蛋白序列与其他已发表的担子菌gpd蛋白序列的进化树分析；

图2为pegpd1和pegpd2的表达模式分析；

图3为pegpd1的启动子区域保守原件分析；

图4为利用pegpd1启动子驱动外源基因cas9表达的pts-gas9质粒示意图；

图5为质粒pts-gas9转化杏鲍菇后的转化子1810的cas9表达检测图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

实施例1

一、杏鲍菇基因组编码的pegpd1启动子的获得：

(1)提取杏鲍菇单核菌丝全基因组dna，检测dna质量和浓度；

(2)利用基因组dna为模板，利用引物gpd1pf：gatatcgcttcatacccatc和gpd1pr：ggctaacgatgagcgtgact进行pcr扩增，得到以下pegpd1启动子序列，如seqno.1所示。

二、构建pegpd1启动子驱动外源基因cas9表达的pts-gas9质粒：

(1)根据杏鲍菇基因组和转录组测序的结果，统计了杏鲍菇的密码子偏好性，并以此为依据，将公开发表的cas9基因序列进行密码子优化。优化后的cas9基因序列由基因合成公司进行全基因合成，并连接到通用载体上。

(2)如图4所示，以杏鲍菇基因组序列作为模板，通过pcr扩增得到pegpd的启动子序列和终止子序列，并将其与合成的cas9基因进行连接。然后，将构建好的cas9基因表达框连接到含有萎锈灵抗性筛选基因的表达载体上，获得了pegpd1启动子驱动外源基因cas9表达的pts-gas9质粒。

三、通过peg介导的方法将pts-cas9质粒转化杏鲍菇：

(1)通过peg介导的方法将pts-cas9质粒对杏鲍菇单核菌丝的原生质体进行了遗传转化，然后通过在筛选培养基中添加真菌杀菌剂萎锈灵进行转化子筛选；

(2)通过pcr方法对筛选后得到的转化子进行了cas9基因的完整性检测，从中获得了一个包含pegpd1启动子—cas9基因—终止子完整序列的转化子1810。

四、质粒pts-gas9转化后的杏鲍菇转化子1810的cas9表达检测：

(1)分别提取杏鲍菇转化背景材料单核菌丝dx8以及转化子1810的基因组dna和总rna；

(2)利用dna酶去除总rna中的dna，并利用反转录试剂盒对获得的总rna进行反转录得到cdna

(3)以基因组dna和cdna为模板扩增cas9基因片段，以杏鲍菇基因组中的actin基因作为参考基因，actin基因的pcr引物设计跨越了一个50bp的内含子，从而可以确认cdna中无基因组dna的污染。从图5中可以看到，转化背景材料dx8的基因组dna和cdna中都不能扩增出ca9基因片段，而转化子1810的基因组dna和cdna中能扩增出cas9基因片段，说明pegpd1的启动子可以高效驱动外源基因cas9在杏鲍菇中表达。

sequencelisting

<110>上海市农业科学院

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<130>一种杏鲍菇组成型启动子及其应用

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