本发明属于酶固定化技术领域，具体涉及一种羰基还原酶的固定化方法。
背景技术：
酶作为一种生物催化剂被广泛应用于多种行业，相较于化学法，其反应条件温和、高选择性、无污染等特点更为人们所青睐。但是，游离酶催化也有着许多缺陷，例如，酶的耐酸碱度低；对温度极为敏感；难与产品分离；造价昂贵，成本高。为了克服游离酶催化存在的缺陷，一种新方法被提了出来，那就是酶的固定化。
所谓的酶固定化技术，就是指在酶活损失较小的前提下，将酶用特定的固体或者不溶于水的材料束缚于一定的空间，用于催化、回收、重复利用的一项新技术。
酶固定化方法主要包括：包埋法、吸附法、交联法和共价法。包埋法：在不改变结构的情况下，把酶固定于半透性的凝胶内部微孔等材料中，形成块、管、膜等形状的固定化酶。吸附法：在酶与载体表面之间存在的分子间作用力、氢键力、离子键的作用下，将酶与载体结合。交联法：利用多功能试剂使酶与酶或酶与载体之间形成得的共价键进行固定，最常用的交联剂是戊二醛，虽然交联法相较于其他方法固定最为牢固，但由于交联过程较为激烈，对酶活影响最大。共价法：通过酶蛋白分子与载体表面上的反应基团之间形成共价键，使得酶固定于载体上。
与游离酶相比固定化酶具有以下优点：(1)固定化酶便于与产物分离，提高了产品纯度；(2)固定化酶可以多次催化，营造利润空间；(3)固定化酶结构韧性大，可以用于装柱等连续化、自动化生产；(4)可控制反应进程；(5)可用于多种酶的固定，进行多酶体系协同催化。
固定化酶技术，可以有效地减少酶催化剂的使用量，提高了产品的纯度，避免了繁琐的分离工作，另外此工艺接近零污染，有利于医药相关产业的清洁生产，进而促进绿色环保社会的建设。
技术实现要素：
本发明主要提供了一种羰基还原酶的固定化方法，羰基还原酶(cr)可以牢固地吸附于大孔树脂的表面及内部空间，有效地提高了酶的利用率，避免了繁琐的分离工作，易于工业化生产。其技术方案如下：
一种羰基还原酶的固定化方法，具体的为，将大孔树脂置于羰基还原酶溶液中进行吸附固定，所述大孔树脂依次经碱性溶液、乙醇、酸性溶液浸泡活化。
优选的，所述大孔树脂为大孔树脂d72。
优选的，所述羰基还原酶溶液为羰基还原酶稀释于磷酸缓冲液得到的溶液，其中羰基还原酶的质量分数为0.89-1.23％。
优选的，大孔树脂活化的具体步骤为：先将大孔树脂放置于碱性溶液中浸泡，用去离子水冲洗至中性，然后放置于乙醇中浸泡并用去离子水冲洗至中性，再放置于酸性溶液中浸泡并用去离子水冲洗至中性，倾倒上清液并将大孔树脂放于烘箱中烘干。
优选的，所述碱性溶液为氢氧化钠溶液，酸性溶液为盐酸溶液。
优选的，碱性溶液的质量分数为2-4％，于碱性溶液中浸泡的时间为6-8h。
优选的，乙醇的体积分数为95％，于乙醇中浸泡的时间为4-6h。
优选的，酸性溶液的质量分数为5-7％，于酸性溶液中浸泡的时间为6-8h。
优选的，吸附固定的温度为27-34℃，吸附固定时间为150-200min，吸附固定的转速为150-300r/min。
优选的，羰基还原酶的固定率为90-95％。
采用上述方案，本发明具有以下优点：
本发明提供一种利用树脂作为载体固定羰基还原酶的制备方法，将大孔树脂分别放入氢氧化钠溶液、乙醇、盐酸溶液中浸泡，得到活化后的大孔树脂，以活化的大孔树脂为载体，将其放入一定浓度的cr溶液中搅拌吸附固定，得到固定化cr。该固定化方法操作简单，酶活损失小，稳定性高，适用于机械搅拌或流化床等工业化形式的生产。
具体实施方式
以下实施例中的实验方法如无特殊规定，均为常规方法，所涉及的实验试剂及材料如无特殊规定均为常规生化试剂和材料。
实施例1
一种大孔树脂d72固定cr的制备方法，包括如下步骤：
用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置0.2mol/l的磷酸缓冲溶液(ph＝7.0-7.8)，备用。
将26g大孔树脂d72加入到150ml、2％(w)的氢氧化钠溶液中浸泡8h，用去离子水冲洗至中性，放置于150ml、体积分数为95％的乙醇中浸泡4h后用去离子水冲洗至中性，再放置于150ml、5％(w)的盐酸溶液中浸泡8h后用去离子水冲洗至中性，倾倒上清液并将大孔树脂d72放于烘箱中以80℃烘干，得到活化好的大孔树脂d72。
将处理好的大孔树脂置于300mlcr溶液(3.25gcr用0.2mol/l磷酸缓冲溶液稀释至300ml)中并于30℃、以200r/min的转速搅拌吸附180min，得到固定化cr。
cr的固定率测定：采用考马斯亮蓝法，测出固定前游离酶含量、固定后上清液游离酶含量，依据固定率计算公式，测出cr的固定率为92.3％。
实施例2
一种大孔树脂nka固定cr的制备方法，包括如下步骤：
用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置0.2mol/l的磷酸缓冲溶液(ph＝7.0-7.8)，备用。
将26g大孔树脂nka加入到150ml、2％(w)的氢氧化钠溶液中浸泡8h，用去离子水冲洗至中性，放置于150ml、体积分数为95％的乙醇中浸泡4h后用去离子水冲洗至中性，再放置于150ml、5％(w)的盐酸溶液中浸泡8h后用去离子水冲洗至中性，倾倒上清液并将大孔树脂放于烘箱中以80℃烘干，得到活化后的大孔树脂nka。
将处理好的大孔树脂置于300mlcr溶液(3.25gcr用0.2mol/l磷酸缓冲溶液稀释至300ml)中并于30℃、以200r/min的转速搅拌吸附180min，得到固定化cr。
cr的固定率为83.6％。
实施例3
一种大孔树脂d380固定cr的制备方法，包括如下步骤：
用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置0.2mol/l的磷酸缓冲溶液(ph＝7.0-7.8)，备用。
将26g大孔树脂d380加入到150ml、2％(w)的氢氧化钠溶液中浸泡8h，用去离子水冲洗至中性，放置于150ml、体积分数为95％的乙醇中浸泡4h后用去离子水冲洗至中性，再放置于150ml、5％(w)的盐酸溶液中浸泡8h后用去离子水冲洗至中性，倾倒上清液并将大孔树脂放于烘箱中以80℃烘干，得到活化后的大孔树脂d380。
将处理好的大孔树脂置于300mlcr溶液(3.25gcr用0.2mol/l磷酸缓冲溶液稀释至300ml)中并于30℃，以200r/min的转速搅拌吸附180min，得到固定化cr。
cr的固定率为23.7％。
实施例4
一种大孔树脂d152固定cr的制备方法，包括如下步骤：
用磷酸氢二钾和磷酸二氢钾配置0.2mol/l的磷酸缓冲溶液(ph＝7.0-7.8)，备用。
将26g大孔树脂d152加入到150ml、2％(w)的氢氧化钠溶液中浸泡8h，用去离子水冲洗至中性，放置于150ml、体积分数为95％的乙醇中浸泡4h后用去离子水冲洗至中性，再放置于150ml、5％(w)的盐酸溶液中浸泡8h后用去离子水冲洗至中性，倾倒上清液并将大孔树脂放于烘箱中以80℃烘干，得到活化后的大孔树脂d152。
将处理好的大孔树脂置于300mlcr溶液(3.25gcr用0.2mol/l磷酸缓冲溶液稀释至300ml)中并于30℃、以200r/min的转速搅拌吸附180min，得到固定化cr。
cr的固定率为11.2％。
cr酶活检测
由上述实施例可知，以大孔树脂d72作为载体的固定率最高，因此对其进行酶活检测：取1g游离cr，将其加入29.5ml的反应液(1.5mol/lnadph,1.0mol/lats-6)中，在ph＝7.0，t＝35℃条件下反应，ats-7的产率约为89.6％。取固定了1gcr的大孔树脂，在上述相同的条件下进行反应，ats-7的产率约为86.6％，通过对比游离酶催化合成ats-7的产率，可以得出结论：与游离酶相比，固定化cr酶活损失小于3.4％。
表一cr固定率的测定
以大孔树脂d72为最佳固定化载体，将活化后的d72用于吸附固定cr，固定率约为92.3％，经检测，固定化cr酶活损失小于3.4％。该方法操作简单，酶活损失小，稳定性高，且固定化酶结构韧性大，可以用于搅拌、装柱等工业化生产。
对本领域的技术人员来说，可根据以上描述的技术方案以及构思，做出其它各种相应的改变以及形变，而所有的这些改变以及形变都应该属于本发明权利要求的保护范围之内。