一种用于抗体药物偶联物的药物-连接子MC-MMAF的制备方法及其中间体与流程

本发明涉及有机合成领域，特别涉及一种用于抗体药物偶联物的药物-连接子mc-mmaf的制备方法及其中间体。

背景技术：

抗体药物偶联物(antibodydrugconjugate，简称adc)是一类新型的抗肿瘤药物，其原理是将细胞毒素连接在抗体上，通过抗体对癌细胞表面特定抗原的识别，通过内吞作用进入癌细胞，从而将细胞毒素运输到靶点，达到靶向性治疗恶性肿瘤的目的。adc与传统的小分子抗肿瘤药物相比，因能借助抗体的靶向识别性与毒素的高活性，故更具备特异性和有效性。

adc包括三个不同的组成部分，即抗体、连接子和细胞毒素。抗体实现靶向性，连接子保证在adc在血液转运过程中的稳定性，而到达作用靶点后，毒素发挥对癌细胞的杀伤作用。根据作用机制的不同，适用于adc的毒素分为微管类抑制剂(microtubuleinhibitors)，dna损伤剂(dnadamagingagents)，rna聚合酶抑制剂(rnapolymeraseinhibitors)等。目前，市场上销售和临床试验中的adc所采用的毒素主要为微管类抑制剂，主要包括基于海兔毒素(dolastatin-based)设计的化合物，比如mmae、mmaf和mmad，以及基于美登素(maytansine-based)设计的化合物，比如dm1和dm4。连接子方面，主要应用的为不可裂解型，如缬氨酸-瓜氨酸(valine-citriline)和环己基甲酸(mcc)，经过溶酶体水解后，药物仍然具有活性，并通过连接区与某个氨基酸残基结合在一起。

抗体药物偶联物的形成方式有多种。既可以通过抗体上的氨基或巯基和药物连接子进行化学反应偶联，也可以对抗体进行修饰，在抗体上引入特定功能基后，再和药物连接子进行化学反应偶联或酶催化反应偶联。本发明涉及的抗体药物偶联物mc-mmaf结构如下所示。

目前文献报道的mc-mmaf的合成路线为使用毒素mmaf与mc-hex-acid(1-马来酰亚胺基正己酸)发生脱水反应，得到mc-mmaf。mmaf的结构为：

文献报道的合成方案为：

该路线mmaf的n终端缬氨酸的n上带有一个甲基，位阻较大，在这种情况下，将1-马来酰亚氨基正己酸接到mmaf上反应速度就会较慢，即使采用不同的酰胺缩合剂，也会造成mmaf的苯丙酰胺基连接的手性碳消旋。该路线用于小于1g的mc-mmaf合成，最后要应用高压反相制备除去异构杂质，产率低于50％。

该反应路线在放大生产时表现出一定的缺陷，比如：1.该方法因为缩合剂会同时活化mmaf上的羧基，而造成30-50％的消旋，形成难以除去的异构体杂质，影响产率；2.由于前述的位阻原因，反应时间长，杂质多，给反应的后处理和纯化造成困难；3.最终产物需要高压反相制备除去异构体，增加操作成本；4.直接应用毒素mmaf为原料，在大量合成操作上需做好防护，选择好防护设备，为生产操作带来障碍。

技术实现要素：

一方面，针对现有技术存在的缺陷，本发明提供一种mc-mmaf的合成方法，该反应的关键是用结构式为的化合物与mmaf的结构片段肽val-dil-dap-phe-oh发生缩合反应直接得到mc-mmaf或其盐，r选自氢、琥珀酰亚胺基、五氟苯基、对硝基苯基、邻苯二甲酰胺基中的一种或多种。

val-dil-dap-phe-oh的化学结构如下所示：

本发明的上述目的采用以下技术方案来实现。

该合成方法包括如下步骤：1)将化合物溶解于合适的溶剂中，与val-dil-dap-phe-oh发生酰胺缩合反应，得到mc-mmaf。

优选地，在步骤1)中，所述合适的溶剂选自二氯甲烷、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环和2-甲基四氢呋喃中的一种或多种；更优选地，所述合适的溶剂选自二氯甲烷和n,n-二甲基甲酰胺中的一种或多种。

优选地，在步骤1)中，如r为氢，在试剂m的作用下加入试剂n，所述试剂m选自选自dcc、dcep、edc、dic、hatu、hbtu、hbpipu、hbpyu、hspyu、hctu、hotu、hott、hstu、hdma、tatu、tbtu、tctu、tcfh、tdbtu、totu、tott、tptu、tffh、btffh、tntu、tstu、comu、t3p、bop、pybop、pybrop、pyclop、brop、pyaop、pyciu、cdi、tpsi、tstu、depbt、dmtmm、eedq、cip、cib、dmc、hobt和edci中的一种或多种；更优选地，所述试剂m选自edci、edc、dic、hoat和hobt中的一种或多种；进一步优选地，所述试剂m为edci、edc或dic与hoat或hobt的混合物；最优选地，所述试剂m为edci和hobt的混合物。所述试剂n选自三乙胺、二异丙基乙胺(diea)、吡啶、n，n-二甲基-4-吡啶，优选为二异丙基乙胺(diea)。反应的反应温度为-20℃～40℃，优选为-10℃～25℃。

优选地，在步骤1)中，如r为珀酰亚胺基、五氟苯基、对硝基苯基、邻苯二甲酰胺基中的一种或多种，在试剂p的作用下，与val-dil-dap-phe-oh发生反应，得到mc-mmaf。所述试剂p选自三乙胺、二异丙基乙胺(diea)、吡啶、n，n-二甲基-4-吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸锂和碳酸氢锂中的一种或多种，优选为碳酸钠，或二异丙基乙胺(diea)。反应温度为0℃～100℃，优选为15℃～50℃。

优选地，在步骤1)中，还包括在反应完成后，将mc-mmaf从反应液中分离的步骤。

优选地，所述分离包括通过减压蒸干溶剂，然后用中压色谱纯化或重结晶，以得到mc-mmaf。

本发明的制备方法提高了n端的反应活性，从而有效的控制了消旋反应的发生；不直接使用毒素mmaf，而采用毒性较低的片段肽，降低了大量生产时的操作难度；无需反相制备，操作简便。如上所述，该方法降低了操作难度，使得质量标准较易控制，制备百克级别都可以应用。

另一方面，本专利还提供合成mc-mmaf的中间体化合物，其结构式为其中，r选自氢、琥珀酰亚胺基、五氟苯基、对硝基苯基、邻苯二甲酰胺基中的一种。优选为如下化合物，如表1所示：

表1

再一方面，本发明还提供了一种合成的方法，该方法采用氨基酸作为保护基合成该方法如以下路线所示，

化合物a是从未报道的新化合物，我们在合成中使用了具有创造性的设计。

化合物a无法通过如下简单缩合得到，实验中得到的都是氨基酸自身缩合的产物。

通常想到的是用如下的带保护基的氨基酸来合成，再脱掉保护基。但是n-甲基缬氨酸叔丁酯合成很困难，生产成本很高。其他常规保护基也因为各种原因无法使用。

在研究中发现化合物a和其他氨基酸形成的酰胺键很不稳定，在酸性条件下很容易断裂。发明人创造性地采用一个氨基酸作为保护基来合成化合物a，用氨基酸来做氨基酸羧基的保护基并未在现有技术文件中发现，这种酰胺键能通过酸切断也未曾在现有技术文件中发现。

使用氨基酸作为保护基合成化合物a是一种新的技术方案，解决了化合物a难以合成的技术问题。

从本发明合成mc-mmaf的整体技术方案来看，本发明放弃已有的mmaf合成路线，把mc-mmaf看做一个整体来合成。其中最大的问题是mc连接子是反应活性比较高的片段，提前把mc接上去会使合成难度增加，本领域技术人员不会想到这一路线。我们通过很多研究，解决了提前引入mc片段化合物在合成中不稳定的问题，使这条整体合成路线能够实现。

如本文所用，常用的有机物缩写的定义及其相应的cas号如表2所示：

表2

附图说明

图1是本发明合成的化合物a3的液相色谱图。

图2是本发明合成的化合物a3的质谱图。

图3是本发明合成的化合物a4的液相色谱图。

图4是本发明合成的化合物a4的质谱图。

图5是本发明合成的化合物a6的液相色谱图。

图6是本发明合成的化合物a6的质谱图。

图7是本发明合成的化合物a的液相色谱图。

图8是本发明合成的化合物a的质谱图。

图9是本发明合成的化合物b3的液相色谱图。

图10是本发明合成的化合物b3的质谱图。

图11是本发明合成的化合物b的液相色谱图。

图12是本发明合成的化合物b的质谱图。

图13是本发明合成的化合物b的核磁共振谱图。

图14是本发明合成的化合物c2的核磁共振谱图。

图15是本发明合成的化合物c3的液相色谱图。

图16是本发明合成的化合物c3的质谱图。

图17是本发明合成的化合物c5的液相色谱图。

图18是本发明合成的化合物c5的质谱图。

图19是本发明合成的化合物c的液相色谱图。

图20是本发明合成的化合物c的质谱图。

图21是本发明合成的化合物c的核磁共振谱图。

图22是本发明合成的化合物e的液相色谱图。

图23是本发明合成的化合物e的质谱图。

图24是本发明合成的化合物f的液相色谱图。

图25是本发明合成的化合物f的质谱图。

图26是本发明合成的目标产物mc-mmaf的液相色谱图。

图27是本发明合成的目标产物mc-mmaf的质谱图。

图28是本发明合成的目标产物mc-mmaf的核磁共振谱图。

图29是本发明合成的目标产物mc-mmaf的高效液相色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明的技术方案作进一步非限制性的详细说明。需要指出的是，下述实施例仅为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所作的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

lcms表示液质联用检测方法；hplc表示高效液相色谱检测。

本发明所涉及的每一步反应的原料和试剂可从市场购得或依本发明所述方法制得。

本发明提供了一种合成mc-mmaf的方法，该合成方法包括如下步骤：

1)将化合物溶解于合适的溶剂中，所述合适的溶剂选自二氯甲烷、二甲基亚砜、n,n-二甲基甲酰胺、n,n-二甲基乙酰胺、四氢呋喃、1,4-二氧六环和2-甲基四氢呋喃中的一种或多种，与val-dil-dap-phe-oh发生酰胺缩合反应，得到mc-mmaf，val-dil-dap-phe-oh结构式为

在步骤1)中，如r为氢，则在试剂m的作用下，加入试剂n，所述试剂m选自dcc、dcep、edc、dic、hatu、hbtu、hbpipu、hbpyu、hspyu、hctu、hotu、hott、hstu、hdma、tatu、tbtu、tctu、tcfh、tdbtu、totu、tott、tptu、tffh、btffh、tntu、tstu、comu、t3p、bop、pybop、pybrop、pyclop、brop、pyaop、pyciu、cdi、tpsi、tstu、depbt、dmtmm、eedq、cip、cib、dmc、hobt和edci中的一种或多种；更优选地，所述试剂m选自edci、edc、dic、hoat和hobt中的一种或多种；进一步优选地，所述试剂m为edci、edc或dic与hoat或hobt的混合物；最优选地，所述试剂m为edci和hobt的混合物。所述试剂n选自三乙胺、二异丙基乙胺(diea)、吡啶、n，n-二甲基-4-吡啶，优选为二异丙基乙胺(diea)。反应温度为-20℃～40℃，优选为-10℃～25℃。

在步骤1)中，如r为珀酰亚胺基、五氟苯基、对硝基苯基、邻苯二甲酰胺基中的一种或多种，则在试剂p的作用下，与val-dil-dap-phe-oh发生反应，得到mc-mmaf。所述试剂p选自三乙胺、二异丙基乙胺(diea)、吡啶、n，n-二甲基-4-吡啶、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、碳酸锂和碳酸氢锂中的一种或多种，优选为碳酸钠，或二异丙基乙胺(diea)。反应温度为0℃～100℃，优选为15℃～50℃。

在步骤1)中，还包括在反应完成后，将mc-mmaf从反应液中分离的步骤，优选地，所述分离包括通过减压蒸干溶剂，然后用中压色谱纯化或重结晶，以得到mc-mmaf。

本发明还提供了一种合成的方法，该方法采用氨基酸作为保护基合成目标产物。该方法如以下路线所示，

实施例1

本实施例的反应路线如下：

将化合物a1(2.65g，10.0mmol)、hatu(4.56g，12.0mmol)和diea(3.87g，30.0mmol)加入到二氯甲烷(50ml)，氮气保护下室温搅拌反应30分钟，再加入化合物a2(2.09g，10.0mmol)，氮气保护下室温搅拌反应4小时，lcms显示反应液中化合物a1少于3％视为反应结束。反应液依次用柠檬酸水溶液(20ml)，饱和食盐水(20ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，粗品用20ml(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)的混合溶剂打浆，过滤，所得固体用石油醚(10ml)洗，抽干，得到化合物a3(白色固体，3.92g，收率93％)。ms：421.16(m+h⁺)

在100ml单口瓶中，加入50ml甲醇、化合物a3(3.92g，9.28mmol)和pd(oh)2/c催化剂(0.5g)，氢气置换三次，室温反应5h，lcms监测原料a3反应完全。于砂芯漏斗加入硅藻土，抽滤，并以100ml甲醇洗涤滤饼，收集滤液,滤液蒸干，油泵抽至产品不起泡，得到化合物a4(白色固体，2.47g，收率93％)。ms：231.08(m-56+h⁺)287.09(m+h⁺)

将化合物a5(2.65g，12.0mmol)、hatu(5.70g，15.0mmol)和diea(3.87g，30.0mmol)加入到二氯甲烷(50ml)，氮气保护下室温搅拌反应30分钟，再加入化合物a4(2.86g，10.0mmol)，氮气保护下室温搅拌反应16小时，lcms显示反应液中化合物a4少于3％视为反应结束。反应液依次用柠檬酸水溶液(20ml)，饱和食盐水(20ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，粗品用20ml(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)的混合溶剂打浆，过滤，所得固体用石油醚(10ml)洗，抽干，得到化合物a6(白色固体，2.2g，收率44％)。ms：480.26(m+h⁺)502.25(m+na⁺)

将化合物a6(2.2g，4.6mmol)加入二氯甲烷(20ml)充分搅拌，在冰浴下加入三氟乙酸(10ml)，氮气保护下缓慢升至室温，搅拌反应6小时，lcms显示反应液中化合物a6少于1％视为反应结束。将反应液用水(20ml×3)洗涤，再用饱和食盐水(20ml)洗涤，有机相用无水na2so4干燥，旋转蒸发仪浓缩得淡黄色粗品；将粗品加入10ml(石油醚：乙酸乙酯＝10:1)混合溶剂中搅拌，约1小时后会析出白色固体，过滤，滤饼用石油醚(10ml)洗两次，真空干燥得到化合物a(1.27g，收率85％，)。ms：325.14(m+h⁺)347.13(m+na⁺)

称取原料b1(30.0g，88.4mmol)于单口瓶中,加入dcm700ml,室温搅拌溶解，加入hatu(48g，126mmol),常温搅拌30min,再加入原料b2(27.4g，92.6mmol)与diea(43.52g，336mmol),常温搅拌2h。

后处理：反应液中加入水(900ml)，dcm(800ml)萃取两次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶拌样。柱层析正向纯化，洗脱剂ea/pe，产物出峰时，ea浓度为13％，浓缩得化合物b3(48.2g白色泡状固体。产率98.8％)。ms：581.60(m+h⁺)

称取原料b3(48.22g，83.0mmol)于单口瓶中,加入dcm(300ml),15℃以下搅拌溶解，加入三氟乙酸(150ml)，控温15℃以下搅拌3h。

后处理：hplc检测，反应结束。旋蒸除掉溶剂，并用少量ea带两遍，尽量除掉三氟乙酸，加入石油醚乙醚的混合溶剂(400ml，pe:乙醚＝20:1),常温打浆18h,过滤并干燥得产品21.0g。过滤得母液以硅胶拌样，柱层析纯化，dcm/meoh洗脱，产物出峰时，甲醇浓度为3％，得产物18.0g。合并两批产品得到化合物b(白色固体，39.0g，产率89.9％)。ms：525.53(m+h⁺)

称取原料c1(31.0g，107.9mmol)于单口瓶中,加入dcm(100ml),室温搅拌溶解，加入hcl/dioxane(50ml),控温15℃以内，搅拌2h。

旋蒸浓缩得产物粗品c2(25g)，直接用于下一步。

称取原料c2(24.13g，107.88mmol)于单口瓶中,加入thf300ml,室温搅拌溶解，保温20℃，加入fmoc-osu(40.03g，118.67mmol)，滴加三乙胺(32.75g，323.64mmol)，常温搅拌5h。

后处理：hplc检测，反应结束。旋蒸除掉溶剂，加入500ml饱和柠檬酸水溶液,dcm萃取两次，合并有机相，饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶拌样，正相柱层析纯化，洗脱剂meoh/dcm,样品出峰位置甲醇浓度为3％左右。浓缩得产物c3(白色固体，34.10g，产率77.1％)ms：410.48(m+h⁺)

称取原料c3(29.00g，70.82mmol)于三口瓶中,加入dcm500ml,室温搅拌溶解，加入hatu(40.39g，106.23mmol),常温搅拌20min,再加入原料c4(19.17g，74.36mmol)与diea(27.46g，212.46mmol),常温搅拌2h。

后处理：反应液中加入500ml水，dcm萃取两次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶拌样。柱层析正向纯化，洗脱剂ea/pe，产物出峰时，ea浓度为30％，浓缩得产物浓缩得产物c5(白色固体，43.0g，产率99.1％)ms：613.60(m+h⁺)

称取原料c5(41.00g,66.91mmol)于单口瓶中,加入dcm250ml,室温搅拌溶解，加入二乙胺250ml,常温搅拌3-4h。

hplc检测，反应结束。

后处理：浓缩除掉溶剂，硅胶拌样。柱层析正向纯化，洗脱剂a:dcm；b:dcm:meoh:氨水＝4:1:0.1，产物出峰时，b浓度为15％，浓缩得产物浓缩得产物c(白色固体，24.2g，产率92.6％)ms：391.45(m+h⁺)

称取原料b(2.00g,3.81)于三口瓶中,加入dcm40ml,室温搅拌溶解，加入decp(0.93g,5.71mmol),控温在搅拌20min,再加入原料c(1.64g,4.19mmol)与diea(1.23g,9.52mmol),继续在此温度下搅拌3.5h，hplc检测反应结束。

后处理：反应液中加入200ml水，dcm萃取两次，合并有机相，用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩，硅胶拌样。柱层析正向纯化，洗脱剂ea/pe，产物出峰时(出峰时间跨度很长，达60min)，ea浓度为50％，浓缩得产物浓缩得产物d(白色固体，3.20g，产率93.6％)

称取原料d(2.00g,2.23mmol)于三口瓶中,加入dcm10ml,室温搅拌溶解，加入二乙胺20ml,控温在搅拌反应。

1.5h后，hplc检测，反应结束。

后处理：浓缩除掉溶剂，硅胶拌样。柱层析正向纯化，洗脱剂a:dcm；b:dcm:meoh:氨水＝4:1:0.1，产物出峰时，b浓度为15％，浓缩得产物e(白色泡状固体，1.35g，产率90％)。ms：675.44(m+h⁺)

将化合物e(1.35g，2.0mmol)加入二氯甲烷(10ml)充分搅拌，在冰浴下加入三氟乙酸(4ml)，氮气保护下缓慢升至室温，搅拌反应6小时，lcms显示反应液中化合物e少于1％视为反应结束。反应液旋干，粗品用中压反相纯化(选用80g的工业预填充c18反相柱)，纯化梯度水/乙腈(90/10-10/90,v/v),时间1小时。收集纯的产品冻干，得到化合物f(白色固体，1.20g，收率97％)。ms：619.43(m+h⁺)

将化合物a(622mg，1.94mmol)、hatu(737mg，1.94mmol)和diea(500mg，3.88mmol)加入到二氯甲烷(20ml)，氮气保护下室温搅拌反应30分钟，再加入化合物f(1.20g，1.94mmol)，氮气保护下室温搅拌反应4小时，lcms显示反应液中化合物f少于5％视为反应结束。反应液依次用柠檬酸水溶液(20ml)，饱和食盐水(20ml)洗涤，无水硫酸钠干燥，旋干，粗品用中压反相纯化(选用80g的工业预填充c18反相柱)，纯化梯度水/乙腈(90/10-10/90,v/v),时间1小时。收集纯的产品冻干，得到化合物mc-mmaf(白色固体，1.41g，收率78％，hplc纯度99％byuv220nm)。ms：925.51(m+h⁺)