一种鼠单克隆抗体功能轻链可变区基因的扩增方法与流程

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及从杂交瘤中扩增鼠单克隆抗体功能轻链可变区基因的方法。

背景技术：

单克隆抗体广泛用于生物医学领域，在多种疾病的诊断、临床治疗中发挥重要作用。杂交瘤细胞技术是单克隆抗体研发最重要的技术手段之一，而从筛选获得的杂交瘤基因组扩增功能抗体基因更是为后续重组抗体开发及人源化改造奠定基础。多项研究报道用于杂交瘤融合的sp2/0细胞中含有大量内源性非功能轻链序列，这些序列由于多种原因不能有效翻译成蛋白质，但干扰从杂交瘤中扩增功能性轻链序列。目前，多种策略被用于从杂交瘤细胞中扩增轻链抗体基因，其中最常用是采用限制性内切酶方法去除内源性非功能基因，但操作复杂并且效率不高。

因此，亟需一种简单高效的扩增方法能够快速从杂交瘤细胞中扩增鼠单克隆抗体轻链可变区序列。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种快速、简单、高效的鼠单克隆抗体功能轻链可变区基因的扩增方法。

本发明的技术方案是：鼠单克隆抗体轻链可变区扩增方法，包括以下步骤：

⑴杂交瘤细胞总rna提取；

⑵第一轮反转录反应制备cdna：

在第一轮反转录反应中，使用内源性非功能轻链cdr3区特异性引物进行反转录，反应结束后使用rnaseh对反应产物中rna-dna嵌合体的rna链进行降解，以去除rna模板中内源性非功能轻链可变区转录本；

⑶第二轮反转录反应制备cdna：

在第二轮反转录反应中，以第一轮产物为模板，以鼠单克隆抗体轻链恒定区特异性引物进行反转录，反应结束后使用rnaseh降解rna-dna嵌合体的rna链；

⑷鼠单克隆抗体轻链可变区扩增：

最后使用前导区及恒定区引物进行pcr扩增功能轻链可变区序列。

其中在上述第一轮反转录反应中引物设计模板内源性非功能轻链可变区核苷酸序列如seqidno:1所示。

其中在上述第一轮反转录反应中使用的内源性非功能轻链cdr3区特异性引物核苷酸序列p1为acctattactgtcagcacatta。

其中在上述第二轮反转录反应中引物设计模板鼠单克隆抗体轻链恒定区核苷酸序列如seqidno:2所示。

其中在上述第二轮反转录反应中使用的鼠单克隆抗体轻链恒定区特异性引物核苷酸序列p2为ggatacagttggtgcagcatc。

其中在上述pcr扩增轻链可变区序列使用前导区引物序列p1为acctattactgtcagcacatta和p3为gayattgtgmtsacmcarwct。

本发明提供了简单、快速、高效的从杂交瘤细胞中扩增鼠单克隆抗体轻链可变区序列的方法。

本发明采用两轮反转录法降低杂交瘤细胞cdna中完整的内源性非功能轻链可变区反转录产物含量，增加终产物中功能性轻链可变区比例。

第一轮反转录反应中使用内源性非功能轻链cdr3区特异性引物，并使用rnase对产物进行酶切，去除内源性非功能轻链rna。

第二轮反转录反应以第一轮产物为模板，以鼠单克隆抗体轻链恒定区特异性引物进行反转录，最后使用rnase进行酶切。

最后使用前导区及恒定区引物进行pcr扩增轻链可变区序列。

附图说明

图1为本发明流程图。

图2为q-pcr鉴定两轮反转录反应后内源性非功能轻链含量变化示意图。

图3为轻链可变区pcr产物琼脂糖电泳图。

图4为功能性及非功能性轻链可变区序列比对图。

具体实施方式

实施1：杂交瘤细胞总rna提取

本方法适合于所有鼠源性杂交瘤细胞抗体基因的克隆，本实施方案以杂交瘤细胞2e2为例进行，该细胞为第四军医大学微生物学教研室实验室制备的抗jev抗体。首先离心去除杂交瘤细胞(大约1×10⁶)培养上清，加入1ml裂解液trizol，室温放置5分钟。加入200μl氯仿震荡15秒，室温放置2分钟后4℃12000rpm离心5分钟。吸取上层澄清液体至一干净无rna酶的离心管，加入等体积异丙醇混匀，室温放置5分钟，4℃12000rpm离心5分钟。丢弃上清加入1ml75％乙醇，上下颠倒1min，4℃12000rpm离心5分钟。丢弃上清室温干燥5分钟，加入40ul无rna酶水充分溶解rna，获得rna冻存于-80℃待用。

实施2：第一轮反转录反应制备cdna

根据内源性非功能轻链cdr3核苷酸序列设计引物用于反转录cdna合成(内源性非功能轻链可变区核苷酸序列如seqidno：1，引物序列见表1-引物p1)，反转录使用ivreversetranscriptase(invitrogen)试剂盒，反应体系按照试剂盒说明书配置，反应条件为50℃10分钟，80℃10分钟。反转录产物加入rnaseh后于37℃孵育20分钟，之后在65℃灭活20分钟。

表1：反转录及pcr引物序列

实施3：第二轮反转录反应制备cdna

根据鼠单克隆抗体轻链恒定区序列设计引物(鼠单克隆抗体轻链恒定区seqidno:2，引物序列见表1-引物p2)进行第二轮反转录,反应条件及体系如实施2。

实施4：q-pcr鉴定内源性非功能轻链可变区含量变化

使用内源性非功能轻链cdr3区特异性引物及上游引物(引物序列见表1-引物p2、p3)进行q-pcr鉴定内源性非功能轻链可变区含量变化。未经第一轮反转录反应(对照组)可以扩增出大量内源性非功能轻链可变区，而经过上述处理后不能扩增该片段(结果见图2)。

实施5：鼠单克隆抗体轻链可变区扩增

于鼠单克隆抗体前导区及恒定区特异性引物pcr扩增轻链可变区序列(引物序列见表1-引物p1、p3)，使用taq酶，反应条件：94℃5min，30×(94℃20s，55℃20s，72℃30s)，72℃5min。pcr产物经1％琼脂糖电泳显示，成功扩增出功能性轻链基因(见图3)。测序结果经blast比对分析后表明，杂交瘤细胞内功能性轻链基因与内源性非功能性轻链基因具有较大差异，尤其是3个cdr区(见图4)。这说明利用该种方法可以成功从杂交瘤细胞中扩增获得功能性轻链基因。

序列表

<110>中国人民解放军第四军医大学

<120>一种鼠单克隆抗体功能轻链可变区基因的扩增方法

<160>2

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>335

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<220>

<221>v_region

<222>(80)..(.108)

<223>重链cdr1区

<220>

<221>v_region

<222>(160)..(.168)

<223>重链cdr2区

<220>

<221>v_region

<222>(287)..(.299)

<223>重链cdr3区

<400>1

gacattgtgctgacacagtctcctgcttccttagctgtatctctggggcagagggccacc60

atctcatacagggccagcaaaagtgtcagtacatctggctatagttatatgcactggaac120

caacagaaaccaggacagccacccagactcctcatctatcttgtatccaacctagaatct180

ggggtccctgccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcaccctcaacatccat240

cctgtggaggaggaggatgctgcaacctattactgtcagcacattagggagcttacacgt300

tcggaggggggaccaagctggaaataaaacgggct335

<210>2

<211>324

<212>dna

<213>人工序列(未知)

<400>2

cgggctgatgctgcaccaactgtatccatcttcccaccatccagtgagcagttaacatct60

ggaggtgcctcagtcgtgtgcttcttgaacaacttctaccccaaagacatcaatgtcaag120

tggaagattgatggcagtgaacgacaaaatggcgtcctgaacagttggactgatcaggac180

agcaaagacagcacctacagcatgagcagcaccctcacgttgaccaaggacgagtatgaa240

cgacataacagctatacctgtgaggccactcacaagacatcaacttcacccattgtcaag300

agcttcaacaggaatgagtgttag324