金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤DNA的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤dna的方法。

背景技术：

循环肿瘤dna，即ctdna(circulatingtumordna)，是指肿瘤细胞经过细胞凋亡或者坏死产生的dna片段释放进入循环系统。ctdna存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中。由于ctdna半衰期为1小时左右，能准确反映肿瘤当前情况，所以ctdna可以作为组织活检的非侵入性替代方案。另外，ctdna在癌症早期诊断、预后和测定药物治疗反应中发挥作用。

目前主流的ctdna突变检测技术包括基于pcr扩增技术和基于dna序列检测技术两类。但是不管哪种测序技术，都需要都对dna进行富集和提取，以降低对扩增或者后续测序的干扰。

ctdna的主要提取方法主要是基于硅球、磁性小球的固相萃取方法和基于苯酚-氯仿的液液提取方法。主要问题是提取效率和重新性。

技术实现要素：

针对上述问题，本发明提供一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤dna的方法。

一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤dna的方法，采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：

1)先采用上样液平衡dna富集材料，将该dna富集材料与生物样品以质量比为100-1000:1混合，孵化0.5分钟-12小时，过滤或者离心分离，弃上混合层清液，收集沉淀；

2)采用ph1-6清洗液与沉淀混合，孵化0.5分钟-60分钟，，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；

3)采用ph8-13洗脱液与沉淀混合，孵化0.5分钟-60分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctdna，上述整个过程在10-60℃进行，

所述dna富集材料为种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料。

所述金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料，其内核为金属纳米颗粒，其外壳的结构式为如下所示：

所述金属为ag,ti,fe,ga,ni,au,pd或pt。

所述生物样品为血液、滑膜液、脑脊液或尿液。

所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。

所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为氨水或三乙胺，有机溶剂体积浓度为10-50％，ph＝8-13。

本发明的有益效果为：本发明方法提取循环肿瘤dna表现出了高选择性和高通量等特点，可以实现循环肿瘤dna的有效分离和富集。

附图说明

图1为本发明一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料的制备示意图。

具体实施方式

本发明所述的一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料采用《colloidalcarbonspheresandtheircore/shellstructureswithnoble-metalnanoparticles》angew.chem.2004,116,607–611中的制备方法制备而得，其制备的过程如图1所示。制备出内核为ag,ti,fe,ga,ni,au,pd或pt纳米颗粒的一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒材料；其外壳的结构式为如下所示。

实施例1

一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤dna的方法，所述的金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒采用上述方法制备而得，其中的内核为金纳米颗粒；采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：

1)先采用上样液平衡dna富集材料，将该dna富集材料与血液以质量比为100:1混合，孵化12小时，过滤或者离心分离，弃上混合层清液，收集沉淀；

2)采用ph1-6清洗液与沉淀混合，孵化60分钟，，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；

3)采用ph8-13洗脱液与沉淀混合，孵化60分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctdna，上述整个过程在30℃进行。

所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈，有机酸为甲酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。

所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈，有机酸为甲酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。

所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为乙腈，有机酸为氨水，有机溶剂体积浓度为10-50％，ph＝8-13。

经过标准品评价，经过dna富集材料提取后，dna的提取回收率是82％，覆盖度是84％。

实施例2

一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤dna的方法，所述的金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒采用上述方法制备而得，其中内核为银纳米颗粒；采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：

1)先采用上样液平衡dna富集材料，将该dna富集材料与滑膜液以质量比为1000:1混合，孵化0.5分钟小时，过滤或者离心分离，弃上混合层清液，收集沉淀；

2)采用ph1-6清洗液与沉淀混合，孵化0.5分钟分钟，，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；

3)采用ph8-13洗脱液与沉淀混合，孵化0.5分钟分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctdna，上述整个过程在60℃进行，

所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为甲醇，有机酸为乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。

所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为甲醇，有机酸为乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。

所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为甲醇，有机酸为三乙胺，有机溶剂体积浓度为10-50％，ph＝8-13。

经过标准品评价，经过dna富集材料提取后，dna的提取回收率是81％，覆盖度是84％。

实施例3

一种金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒提取循环肿瘤dna的方法，所述的金属内核/碳壳层结构的纳米颗粒采用上述方法制备而得，其中内核为pt纳米颗粒；采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：

1)先采用上样液平衡dna富集材料，将该dna富集材料与脑脊液以质量比为500:1混合，孵化6小时，过滤或者离心分离，弃上混合层清液，收集沉淀；

2)采用ph1-6清洗液与沉淀混合，孵化30分钟，，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；

3)采用ph8-13洗脱液与沉淀混合，孵化30分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctdna，上述整个过程在10℃进行。

所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙醇，有机酸为三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。

所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙醇，有机酸为三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。

所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为乙醇，有机酸为三乙胺，有机溶剂体积浓度为10-50％，ph＝8-13。

经过标准品评价，经过dna富集材料提取后，dna的提取回收率是83％，覆盖度是85％。