本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种双组分聚合物功能化材料富集提取循环肿瘤dna的方法。
背景技术：
循环肿瘤dna，即ctdna(circulatingtumordna)，是指肿瘤细胞经过细胞凋亡或者坏死产生的dna片段释放进入循环系统。ctdna存在于血液、滑膜液和脑脊液等体液中。由于ctdna半衰期为1小时左右，能准确反映肿瘤当前情况，所以ctdna可以作为组织活检的非侵入性替代方案。另外，ctdna在癌症早期诊断、预后和测定药物治疗反应中发挥作用。
目前主流的ctdna突变检测技术包括基于pcr扩增技术和基于dna序列检测技术两类。但是不管哪种测序技术，都需要都对dna进行富集和提取，以降低对扩增或者后续测序的干扰。
ctdna的主要提取方法主要是基于硅球、磁性小球的固相萃取方法和基于苯酚-氯仿的液液提取方法。主要问题是提取效率和重现性。
技术实现要素：
针对上述问题，本发明提供一种双组分聚合物功能化材料富集循环肿瘤dna的方法。
一种双组分聚合物功能化材料富集提取循环肿瘤dna的方法，采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：
1)先采用上样液平衡dna富集材料，将该dna富集材料与生物样品以质量比100-1000:1混合，孵化0.5-720min，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；
2)采用1-6清洗液与沉淀混合，孵化0.5分钟-60分钟，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；
3)采用ph8-13洗脱液与沉淀混合，孵化0.5分钟-60分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctdna，上述整个过程在10-60℃进行；
所述dna富集材料为双组分聚合物功能化材料。
所述双组分聚合物，其结构如下：
其中r为羧基、硝基、甲基、甲酸乙酯基或氢；x＝0.01-0.5。
其基底的材料为si、cu、ag、au、pt、cuo、fe3o4、多孔sio2、多孔al2o3、多孔tio2或多孔zro2中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。
所述双组分聚合物功能化材料的制备方法为：利用原子转移自由基聚合反应机制，将双组分功能共聚物接枝到无机半导体、金属或金属氧化物表面上，使其获得智能响应性聚合物功能表面；所述的无机半导体为si或sio2中的任意一种或者两种按任意比例的混合。所述的金属为au、ag或pt中的任意一种或者两种以上任意比例的混合，所述的金属氧化物为cuo、al2o3、tio2、zro2或fe3o4中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。
所述双组分聚合物功能化材料的制备方法具体为：在25ml的烧瓶中依次加入0.4mmol异丙基丙烯酰胺，0.1mmol的硫脲功能单体，二者摩尔比为4：1，同时加入6mlh2o以及6mldmf作溶剂；在搅拌下通入氮气，待单体充分溶解之后，在氮气保护下加入催化剂cubr0.032g以及pmdeta或联吡啶配体0.16ml，随后反应体系抽真空—充氮气，除去反应体系中残余的氧气；将溴化处理过的si,、sio2、au、ag、pt、cuo、al2o3、tio2、zro2或fe3o4中的任意一种或者两种以上任意比例的混合物浸入配置好的反应溶液；将烧瓶的温度控制在60℃静置反应4—6小时；反应结束后用dmf，h2o依次洗涤聚合物接枝表面，得到双组分共聚物，此双组分共聚物的功能化表面的厚度为10-50nm，氮气吹干表面后置于真空干燥器中备用。
所述硫脲功能单体结构式为：
所述双组分聚合物功能化材料的粒径是0.2-50μm,孔径为
所述生物样品为血液、滑膜液、脑脊液或尿液。
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。
所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为甲酸、乙酸或三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。
所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为乙腈、甲醇或乙醇，有机酸为氨水或三乙胺，有机溶剂体积浓度为10-50％，ph＝8-13。
本发明的有益效果为：发明的方法在提取循环肿瘤dna方面表现出了高选择性和高通量等特点，可以实现循环肿瘤dna的有效分离和富集。
具体实施方式
实施例1
双组分聚合物功能化材料结构如下：
其中r为羧基、硝基、甲基、甲酸乙酯基或氢；x＝0.01-0.5。
本发明中，基底材料为无机半导体、金属或金属氧化物。所述的无机半导体为si或sio2中的任意一种或者两种按任意比例的混合。所述的金属为au、ag或pt中的任意一种或者两种以上任意比例的混合，所述的金属氧化物为cuo、al2o3、tio2、zro2或fe3o4中的任意一种或者两种以上任意比例的混合。
以x＝0.2为例，在25ml三口烧瓶中依次加入0.4mmol异丙基丙烯酰胺，0.1mmol的硫脲功能单体，二者摩尔比为4:1，同时加入6ml去离子水以及6mldmf作溶剂；在搅拌下通入氮气，待单体充分溶解之后，在氮气保护下加入催化剂cubr0.032g以及联吡啶类配体0.16ml，随后反应体系抽真空—充氮气，除去反应体系中残余的氧气；将溴化处理过的基底浸入配置好的反应溶液；将烧瓶的温度控制在60-80℃静置反应4-24小时；反应结束后用dmf和去离子水依次洗涤聚合物接枝表面，得到循环肿瘤dna富集材料，此循环肿瘤dna富集材料表面双组分共聚物层的厚度为10-80nm，氮气吹干表面后置于真空干燥器中备用。
在本实施例中，选用的基底材料为硅胶，其结构式为：
实施例2
一种双组分聚合物功能化材料富集提取循环肿瘤dna的方法，采用实施例1制备的双组分聚合物功能化材料；采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：
1)先采用上样液平衡dna富集材料，将该dna富集材料与血液以质量比为100:1混合，孵化12小时，过滤或者离心分离，弃上混合层清液，收集沉淀；
2)采用ph1-6清洗液与沉淀混合，孵化60分钟，，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；
3)采用ph8-13洗脱液与沉淀混合，孵化60分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctdna，上述整个过程在30℃进行，
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈，有机酸为甲酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。
所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙腈，有机酸为甲酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。
所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为乙腈，有机酸为氨水，有机溶剂体积浓度为10-50％，ph＝8-13。
经过标准品评价，经过dna富集材料提取后，dna的提取回收率是84％，覆盖度是86％。
实施例3
一种双组分聚合物功能化材料富集提取循环肿瘤dna的方法，采用实施例1制备的双组分聚合物功能化材料；采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：
1)先采用上样液平衡dna富集材料，将该dna富集材料与脑脊液以质量比为500:1混合，孵化6小时，过滤或者离心分离，弃上混合层清液，收集沉淀；
2)采用ph1-6清洗液与沉淀混合，孵化30分钟，，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；
3)采用ph8-13洗脱液与沉淀混合，孵化30分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctdna，上述整个过程在10℃进行，
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙醇，有机酸为三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。
所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为乙醇，有机酸为三氟乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。
所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为乙醇，有机酸为三乙胺，有机溶剂体积浓度为10-50％，ph＝8-13。
经过标准品评价，经过dna富集材料提取后，dna的提取回收率是83％，覆盖度是85％。
实施例4
一种双组分聚合物功能化材料富集提取循环肿瘤dna的方法，采用实施例1制备的双组分聚合物功能化材料；采用分散固相萃取模式，具体步骤如下：
1)先采用上样液平衡dna富集材料，将该dna富集材料与滑膜液以质量比为1000:1混合，孵化0.5分钟小时，过滤或者离心分离，弃上混合层清液，收集沉淀；
2)采用ph1-6清洗液与沉淀混合，孵化0.5分钟分钟，，过滤或者离心分离，弃上层清液，收集沉淀；
3)采用ph8-13洗脱液与沉淀混合，孵化0.5分钟分钟，过滤或者离心分离，收集上清液，得ctdna，上述整个过程在60℃进行，
所述上样液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为甲醇，有机酸为乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。
所述清洗液为有机溶剂、有机酸和水的混合液，有机溶剂为甲醇，有机酸为乙酸，有机溶剂体积浓度为50-90％，ph＝1-6。
所述洗脱液为有机溶剂、有机碱和水的混合液，有机溶剂为甲醇，有机酸为三乙胺，有机溶剂体积浓度为10-50％，ph＝8-13。
经过标准品评价，经过dna富集材料提取后，dna的提取回收率是87％，覆盖度是89％。