高粱InDel分子标记及其应用的制作方法

本发明属于分子标记技术领域，具体涉及一种高粱indel分子标记及其应用。

背景技术：

高粱(sorghumbicolor(l.)moench)是世界上第五大禾本科作物，其产量仅次于玉米、小麦、水稻和大麦，是集粮食、饲用、酿酒、糖料、生物质能源等多用途的一种c4植物，其光合效率高、生物量大，具有抗旱、抗涝、耐盐碱、耐瘠薄等多重抗逆性，广泛种植于干旱与半干旱地区。因其遗传多样性丰富，与玉米、甘蔗类禾本科作物亲缘关系较近，且基因组较小(约750m)，被认为是禾本科作物基因组研究的又一重要模式植物，对其深入开展遗传学研究具有重要的理论意义和应用价值。

分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种遗传标记形式，它以蛋白质、核酸分子的突变为基础，检测生物遗传结构与其变异，可以弥补和克服在形态学鉴定及同工酶、蛋白电泳鉴定中的许多缺陷和难题，因而广泛应用于作物杂交品种鉴定、连锁图谱构建、遗传多样性分析、比较基因组学、功能基因/qtl定位、植物起源、分类和进化研究、分子辅助育种选择等研究。植物遗传研究中常用的分子标记，如限制性片段长度多态性(rflp)、扩增片段长度多态性(aflp)、随机扩增多态性(rapd)和简单重复序列(ssr)标记等。rflp需要放射性同位素的参与，技术较复杂；rapd实验重复性较差，结果可靠性较低，这些缺点限制了标记在植物遗传研究中的应用。与这些早期的分子标记相比，基于pcr的简单重复序列(ssr)标记相对比较简单、便宜、重复性较好，但是有些扩增条带不清楚及技术上的缺陷，如假等位基因、无效等位基因，导致ssr标记在基因型分型和数据分析上容易产生错误。近年来，基因组测序技术的快速发展，使得高通量测序技术为snp和indel标记的开发提供了可能。indel和snp标记作为第三代高通量、低成本的新型的分子标记类型，可以通过生物信息学的方法获得，具有经济实用、特异性高、稳定性好等特点，为分子标记辅助育种提供了一种可选择的方法。但是snp受限于基因型分型技术，在小型和中型检测中需要特殊的设备，成本高，且操作复杂。而indel分子标记是基于插入/缺失位点两侧的序列设计特异性引物，通过pcr扩增体现序列长度多态性的一种分子标记。较之ssr标记，indel分布密度远高于ssrs。较之snp标记，indel标记呈现共显性，可利用电泳平台进行分型，快捷经济，不需要复杂的实验仪器，可操作性强。传统分子标记开发一般是基于单一序列，而indel标记开发则基于序列差异，在开发过程中变异稳定、准确性高，避免了由于特异性和复杂性导致的后续分析模糊等问题。indel标记作为高通量分子标记，在植物基因组中有较高的分布频率，具有遗传稳定性高、分布广、多态性强、通用性强等优点，目前已在水稻、玉米、棉花、黄瓜、白菜等主要作物中得到广泛应用。

随着分子标记技术的日益成熟和完善，分子标记在高粱上的理论研究和实际应用得到了长足的进展。其中高粱分子标记因其优点众多而得到了广泛的关注，在过去的十几年里，关于高粱标记的开发和应用不断有文章报道。然而分子标记技术在我国高粱研究中的应用远远落后于水稻、玉米等作物。我国在有关高粱分子标记开发利用方面的研究则相对薄弱，有关高粱indel标记的开发与应用目前尚没有相关报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种高粱indel分子标记及其应用。

一种高粱indel分子标记，包括有如下87个位点对应的正向和反向引物：

indel01位点：正向引物chr01-np2-f和反向引物chr01-np2-r分别如序列表seqidno：1和seqidno：2所示；

indel02位点：正向引物chr01-np3-f和反向引物chr01-np3-r分别如序列表seqidno：3和seqidno：4所示；

indel03位点：正向引物chr01-np4-f和反向引物chr01-np4-r分别如序列表seqidno：5和seqidno：6所示；

indel04位点：正向引物chr01-np6-f和反向引物chr01-np6-r分别如序列表seqidno：7和seqidno：8所示；

indel05位点：正向引物chr02-np2-f和反向引物chr02-np2-r分别如序列表seqidno：9和seqidno：10所示；

indel06位点：正向引物chr02-np4-f和反向引物chr02-np4-r分别如序列表seqidno：11和seqidno：12所示；

indel07位点：正向引物chr02-np7-f和反向引物chr02-np7-r分别如序列表seqidno：13和seqidno：14所示；

indel08位点：正向引物chr02-np10-f和反向引物chr02-np10-r分别如序列表seqidno：15和seqidno：16所示；

indel09位点：正向引物chr02-np11-f和反向引物chr02-np11-r分别如序列表seqidno：17和seqidno：18所示；

indel10位点：正向引物chr02-np12-f和反向引物chr02-np12-r分别如序列表seqidno：19和seqidno：20所示；

indel11位点：正向引物chr02-np14-f和反向引物chr02-np14-r分别如序列表seqidno：21和seqidno：22所示；

indel12位点：正向引物chr02-mp1-f和反向引物chr02-mp1-r分别如序列表seqidno：23和seqidno：24所示；

indel13位点：正向引物chr02-mp2-f和反向引物chr02-mp2-r分别如序列表seqidno：25和seqidno：26所示；

indel14位点：正向引物chr02-mp4-f和反向引物chr02-mp4-r分别如序列表seqidno：27和seqidno：28所示；

indel15位点：正向引物chr02-mp12-f和反向引物chr02-mp12-r分别如序列表seqidno：29和seqidno：30所示；

indel16位点：正向引物chr02-mp13-f和反向引物chr02-mp13-r分别如序列表seqidno：31和seqidno：32所示；

indel17位点：正向引物chr02-mp14-f和反向引物chr02-mp14-r分别如序列表seqidno：33和seqidno：34所示；

indel18位点：正向引物chr02-mp16-f和反向引物chr02-mp16-r分别如序列表seqidno：35和seqidno：36所示；

indel19位点：正向引物chr03-mp3-f和反向引物chr03-mp3-r分别如序列表seqidno：37和seqidno：38所示；

indel20位点：正向引物chr03-mp5-f和反向引物chr03-mp5-r分别如序列表seqidno：39和seqidno：40所示；

indel21位点：正向引物chr03-mp10-f和反向引物chr03-mp10-r分别如序列表seqidno：41和seqidno：42所示；

indel22位点：正向引物chr03-mp12-f和反向引物chr03-mp12-r分别如序列表seqidno：43和seqidno：44所示；

indel23位点：正向引物chr03-mp14-f和反向引物chr03-mp14-r分别如序列表seqidno：45和seqidno：46所示；

indel24位点：正向引物chr03-np3-f和反向引物chr03-np3-r分别如序列表seqidno：47和seqidno：48所示；

indel25位点：正向引物chr03-np4-f和反向引物chr03-np4-r分别如序列表seqidno：49和seqidno：50所示；

indel26位点：正向引物chr03-np7-f和反向引物chr03-np7-r分别如序列表seqidno：51和seqidno：52所示；

indel27位点：正向引物chr03-np9-f和反向引物chr03-np9-r分别如序列表seqidno：53和seqidno：54所示；

indel28位点：正向引物chr04-mp1-f和反向引物chr04-mp1-r分别如序列表seqidno：55和seqidno：56所示；

indel29位点：正向引物chr04-mp2-f和反向引物chr04-mp2-r分别如序列表seqidno：57和seqidno：58所示；

indel30位点：正向引物chr04-mp3-f和反向引物chr04-mp3-r分别如序列表seqidno：59和seqidno：60所示；

indel31位点：正向引物chr04-mp13-f和反向引物chr04-mp13-r分别如序列表seqidno：61和seqidno：62所示；

indel32位点：正向引物chr04-np1-f和反向引物chr04-np1-r分别如序列表seqidno：63和seqidno：64所示；

indel33位点：正向引物chr04-np2-f和反向引物chr04-np2-r分别如序列表seqidno：65和seqidno：66所示；

indel34位点：正向引物chr04-np6-f和反向引物chr04-np6-r分别如序列表seqidno：67和seqidno：68所示；

indel35位点：正向引物chr04-np7-f和反向引物chr04-np7-r分别如序列表seqidno：69和seqidno：70所示；

indel36位点：正向引物chr04-np8-f和反向引物chr04-np8-r分别如序列表seqidno：71和seqidno：72所示；

indel37位点：正向引物chr04-np11-f和反向引物chr04-np11-r分别如序列表seqidno：73和seqidno：74所示；

indel38位点：正向引物chr05-mp9-f和反向引物chr05-mp9-r分别如序列表seqidno：75和seqidno：76所示；

indel39位点：正向引物chr05-mp13-f和反向引物chr05-mp13-r分别如序列表seqidno：77和seqidno：78所示；

indel40位点：正向引物chr05-mp14-f和反向引物chr05-mp14-r分别如序列表seqidno：79和seqidno：80所示；

indel41位点：正向引物chr05-np1-f和反向引物chr05-np1-r分别如序列表seqidno：81和seqidno：82所示；

indel42位点：正向引物chr05-np2-f和反向引物chr05-np2-r分别如序列表seqidno：83和seqidno：84所示；

indel43位点：正向引物chr05-np5-f和反向引物chr05-np5-r分别如序列表seqidno：85和seqidno：86所示；

indel44位点：正向引物chr05-np6-f和反向引物chr05-np6-r分别如序列表seqidno：87和seqidno：88所示；

indel45位点：正向引物chr05-np8-f和反向引物chr05-np8-r分别如序列表seqidno：89和seqidno：90所示；

indel46位点：正向引物chr05-np9-f和反向引物chr05-np9-r分别如序列表seqidno：91和seqidno：92所示；

indel47位点：正向引物chr05-np10-f和反向引物chr05-np10-r分别如序列表seqidno：93和seqidno：94所示；

indel48位点：正向引物chr06-mp1-f和反向引物chr06-mp1-r分别如序列表seqidno：95和seqidno：96所示；

indel49位点：正向引物chr06-mp8-f和反向引物chr06-mp8-r分别如序列表seqidno：97和seqidno：98所示；

indel50位点：正向引物chr06-mp12-f和反向引物chr06-mp12-r分别如序列表seqidno：99和seqidno：100所示；

indel51位点：正向引物chr06-np2-f和反向引物chr06-np2-r分别如序列表seqidno：101和seqidno：102所示；

indel52位点：正向引物chr06-np7-f和反向引物chr06-np7-r分别如序列表seqidno：103和seqidno：104所示；

indel53位点：正向引物chr07-np1-f和反向引物chr07-np1-r分别如序列表seqidno：105和seqidno：106所示；

indel54位点：正向引物chr07-np3-f和反向引物chr07-np3-r分别如序列表seqidno：107和seqidno：108所示；

indel55位点：正向引物chr07-np6-f和反向引物chr07-np6-r分别如序列表seqidno：109和seqidno：110所示；

indel56位点：正向引物chr07-mp8-f和反向引物chr07-mp8-r分别如序列表seqidno：111和seqidno：112所示；

indel57位点：正向引物chr08-mp1-f和反向引物chr08-mp1-r分别如序列表seqidno：113和seqidno：114所示；

indel58位点：正向引物chr08-mp12-f和反向引物chr08-mp12-r分别如序列表seqidno：115和seqidno：116所示；

indel59位点：正向引物chr08-ap2-f和反向引物chr08-ap2-r分别如序列表seqidno：117和seqidno：118所示；

indel60位点：正向引物chr08-ap4-f和反向引物chr08-ap4-r分别如序列表seqidno：119和seqidno：120所示；

indel61位点：正向引物chr08-ap5-f和反向引物chr08-ap5-r分别如序列表seqidno：121和seqidno：122所示；

indel62位点：正向引物chr08-np3-f和反向引物chr08-np3-r分别如序列表seqidno：123和seqidno：124所示；

indel63位点：正向引物chr09-mp1-f和反向引物chr09-mp1-r分别如序列表seqidno：125和seqidno：126所示；

indel64位点：正向引物chr09-ym1-f和反向引物chr09-ym1-r分别如序列表seqidno：127和seqidno：128所示；

indel65位点：正向引物chr09-ym2-f和反向引物chr09-ym2-r分别如序列表seqidno：129和seqidno：130所示；

ndel66位点：正向引物chr09-ym5-f和反向引物chr09-ym5-r分别如序列表seqidno：131和seqidno：132所示；

ndel67位点：正向引物chr09-ym10-f和反向引物chr09-ym10-r分别如序列表seqidno：133和seqidno：134所示；

ndel68位点：正向引物chr09-ym11-f和反向引物chr09-ym11-r分别如序列表seqidno：135和seqidno：136所示；

indel69位点：正向引物chr09-mp4-f和反向引物chr09-mp4-r分别如序列表seqidno：137和seqidno：138所示；

indel70位点：正向引物chr09-mp5-f和反向引物chr09-mp5-r分别如序列表seqidno：139和seqidno：140所示；

indel71位点：正向引物chr09-mp9-f和反向引物chr09-mp9-r分别如序列表seqidno：141和seqidno：142所示；

indel72位点：正向引物chr09-mp11-f和反向引物chr09-mp11-r分别如序列表seqidno：143和seqidno：144所示；

indel73位点：正向引物chr09-np1-f和反向引物chr09-np1-r分别如序列表seqidno：145和seqidno：146所示；

indel74位点：正向引物chr09-np2-f和反向引物chr09-np2-r分别如序列表seqidno：147和seqidno：148所示；

indel75位点：正向引物chr09-np4-f和反向引物chr09-np4-r分别如序列表seqidno：149和seqidno：150所示；

indel76位点：正向引物chr09-np5-f和反向引物chr09-np5-r分别如序列表seqidno：151和seqidno：152所示；

indel77位点：正向引物chr09-np9-f和反向引物chr09-np9-r分别如序列表seqidno：153和seqidno：154所示；

indel78位点：正向引物chr10-mp2-f和反向引物chr10-mp2-r分别如序列表seqidno：155和seqidno：156所示；

indel79位点：正向引物chr10-mp5-f和反向引物chr10-mp5-r分别如序列表seqidno：157和seqidno：158所示；

indel80位点：正向引物chr10-mp7-f和反向引物chr10-mp7-r分别如序列表seqidno：159和seqidno：160所示；

indel81位点：正向引物chr10-mp8-f和反向引物chr10-mp8-r分别如序列表seqidno：161和seqidno：162所示；

indel82位点：正向引物chr10-mp11-f和反向引物chr10-mp11-r分别如序列表seqidno：163和seqidno：164所示；

indel83位点：正向引物chr10-np4-f和反向引物chr10-np4-r分别如序列表seqidno：165和seqidno：166所示；

indel84位点：正向引物chr10-np6-f和反向引物chr10-np6-r分别如序列表seqidno：167和seqidno：168所示；

indel85位点：正向引物chr10-np7-f和反向引物chr10-np7-r分别如序列表seqidno：169和seqidno：170所示；

indel86位点：正向引物chr10-np9-f和反向引物chr10-np9-r分别如序列表seqidno：171和seqidno：172所示；

indel87位点：正向引物chr10-np11-f和反向引物chr10-np11-r分别如序列表seqidno：173和seqidno：174所示。

上述高粱indel分子标记在高粱遗传连锁图谱的构建中的应用。

indel标记作为一种重要的遗传标记，已经广泛用于作物连锁图谱的构建。本发明利用mapchat软件绘制这87个indel分子标记在高粱染色体上的物理图谱(图2)，为高粱遗传连锁图谱的构建奠定基础。

上述高粱indel分子标记在高粱种质资源遗传多样性研究中的应用。

indel分子标记技术作为一种高通量的dna指纹标记，能够更好地揭示基因组中的多态性，因此在种质资源鉴定方面具有较为突出的优越性，在玉米、水稻、大白菜等作物中得到广泛应用。本发明利用开发的多态性indel引物，从中随机选取两对多态性引物(indel20、indel38)，结合高粱幼苗基因组dna快速提取方法，对11份高粱品种进行鉴别，pcr扩增结果显示，不同品种在不同引物的检测下呈现出品种特异性(图3)。结果表明，indel技术作为一种快速、准确、高效方法，可用于大规模dna指纹分析。本发明所开发的indel标记可在高粱种质资源鉴别中发挥重要的作用。

上述高粱indel分子标记在高粱杂交种/纯度鉴定中的应用。

随机选取3个经pcr验证具有多态性的indel标记，结合高粱叶片基因组dna快速提取方法，对配制高粱2个杂交群体的17个杂交后代进行了杂交种真实度和纯度评价，根据pcr扩增产物的电泳结果，对父、母本及杂交子代进行对比分析，若杂交子代扩增出条带大小与父母本完全一致/表现父母本条带的完全互补型(双带)即为真杂种，而扩增只呈现出类似父本或母本的单一条带或其它片段大小的后代均为假杂种(图4)。表明indel标记可被用于快速、准确和经济地鉴定高粱杂交种的真实性及纯度。

上述高粱indel分子标记在高粱重要农艺性状相关基因的定位方面的应用。

本发明的有益效果：

本发明基于高通量基因组测序数据技术开发以pcr为基础、操作简便、应用价值大的indel标记，可为高粱遗传连锁图谱的构建、遗传多样性分析、高粱杂交种/纯度鉴定、高粱重要农艺性状相关基因的定位和分子标记辅助选择育种等奠定基础。

本发明开发的indel标记是利用高通量illumina测序技术对高粱常规品种jiutian1基因组进行重测序，通过与测序品种btx623参考基因组序列进行同源比对，获得丰富的插入/缺失位点。根据这些indel位点在两个基因池间的序列差异(>10bp)及在高粱10条染色体上的分布情况，在开发过程中选择变异稳定、准确性高的indel位点进行引物设计，以避免由于特异性和复杂性而导致的后续分析模糊的问题。本发明设计了约100对引物，经pcr验证所获得的87对indel引物具有多态性高、分布广、稳定性高的特点。

本发明indel引物开发基于pcr扩增，采用4％的琼脂糖凝胶电泳平台进行检测，扩增条带清晰，多态性高、分辨率高，且简便易行，可操作性强，经济实用。

附图说明

图1为高粱87个indel标记pcr产物琼脂糖凝胶电泳检测结果；

图中，m--dnamarker，为康润生物科技有限公司生产的genstardirect-load^tmstarmarker(d5000)，由5000bp、3000bp、2000bp、1500bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp条带组成；①高粱btx623；②高粱jiutian1。

图2基于开发的87个indel分子标记所构建的高粱物理图谱。

图3利用高粱indel分子标记进行高粱品种遗传多样性分析的电泳图谱；

图中：m-dnamarker(d2000)；1-11为不同高粱品种：1-白蛇眼、2-wheatland、3-河北糯杂、4-丽欧、5-t32、6-sem-e32、7-sem-42、8-zih08894、9-e-tian、10-jiutian1、11-btx623。

图4利用indel标记进行高粱杂交种鉴定的电泳图谱；

图中：m-dnamarker(d2000)ii；1：jiutianym1；2：btx623；3-7：jiutianym1与btx623杂交子代；8:jiutianym2；9:btx623；10-13：jiutianym2与btx623杂交子代；12:jiutianym1；13:btx623；14-17：jiutianym1与btx623杂交子代；18:jiutianym2；19:btx623；20-23：jiutianym2与btx623杂交子代。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明。

实施例1高粱基因组dna提取

在高粱品种jiutian1三叶期取1g幼嫩叶片，经液氮研磨破碎后，转入2.0mleppendorf离心管中，加入700μlctab裂解液[2％ctab、2mnacl、20mmedta、100mmtris-hcl(ph＝8.0)、0.2％的β-巯基乙醇(随用随配)]，充分混匀后放置于65℃水浴0.5h～1h，之后取出冷却至室温，加入等体积的苯酚：氯仿：异戊醇(24：23：1)混合物后轻轻摇动5min～10min，将乳状物以12000r/min转速室温离心8min～10min，取上清液转移到新的1.5ml离心管中，加入等体积的氯仿：异戊醇(24:1)抽提1次～2次，提取上清并加入2倍体积预冷的异丙醇，4℃静置3h以上，将静置后的混合物以12000r/min转速离心10min，弃上清，用70％乙醇洗涤dna沉淀2-3遍，每次洗涤后12000r/min转速离心3min。弃上清，将dna在室温条件下干燥，加入适量1xte溶液或ddh2o中，待充分溶解后4℃保存备用。利用紫外/可见光光度计进行dna纯度分析和定量检测。

实施例2高粱indel标记引物的设计

利用truseqdnapcr-freeltlibrarypreparationkit构建dna文库，利用illuminahiseqx^tmten测序平台对高粱品种jiutian1进行重测序；利用trimmomatic软件对序列进行质控，利用bwa软件将cleandata与高粱测序品种btx623参考基因组序列进行比对(https://genome.jgi.doe.gov/portal/pages/dynamicorganismdownload.jsf？organism＝sbicolor)。通过大规模同源序列比对筛选目标区域中序列差异≥10bp的indel位点，利用primerpremier5.0软件设计indel标记引物。引物设计的条件：pcr扩增产物长度为170-300bp；变性温度(tm)在50-62℃之间，以56℃为最佳；gc含量在40-60％之间，以50％为最佳；引物长度在18-25bp，以20bp为最佳。从中挑选了覆盖高粱10条染色体的100个标记用于多态性分析。共设计了100对引物，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，经pcr验证具有多态性的indel引物有87对，引物序列如序列表seqidno：1-seqidno：158所示。

实施例3indel引物的pcr扩增

合成的indel引物先通过2个基因池间(高粱jiutian1和btx623)的pcr扩增进行多态性筛选。pcr扩增反应体系为20μl，其中含1.0μl基因组dna(200ng/μl)，17μl1×goldenstart6superpcrmix(北京擎科生物科技有限公司)，1.0μl正向引物(10μm)，1.0μl反向引物(10μm)。pcr扩增程序为：98℃预变性2min；98℃变性10sec，tm退火(50～62℃)10sec，72℃延伸10sec，35个循环；72℃延伸5min，于4℃保存。在杭州博日科技有限公司(bioer)lifeeco基因扩增仪(tc-96/g/h(b)c)上进行pcr扩增。

实施例4琼脂糖凝胶电泳检测

琼脂糖凝胶制备：称取4g琼脂糖(agarose，invitrogen)，加入2ml50×tae电泳缓冲液(12.2gtris，2.85ml冰醋酸，10ml0.25mol/ledta(ph8.0)，加水至50ml)和98ml蒸馏水，加热溶解配成4.0％的琼脂糖凝胶100ml。稍冷后，加入0.5μg/mleb溶液混匀；安装好电泳槽和样品梳，灌胶，待胶冷却凝结后，在电泳槽内倒入1×tae电泳缓冲液。取5μlpcr扩增产物加入1μl6×dnaloadingbuffer，混匀后用移液器加样。使用电泳仪(dyy-6c型，北京六一生物科技有限公司)连接电极在60v恒压条件进行电泳，电泳时间为1.0h～1.5h，以扩增的dna条带充分展开为止。

通过对100对indel引物pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳检测，对indel引物在高粱品种jiutian1和测序品种btx623基因池中的多态性进行筛选，最终筛选到87对引物扩增效果良好并表现出多态性的indel标记(图1)。这些indel标记可应用于高粱品种鉴定、遗传图谱构建、功能基因/qtl定位、分子辅助育种及遗传多样性分析等研究。

序列表

<110>中国农业科学院生物技术研究所

<120>高粱indel分子标记及其应用

<160>174

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>20

<212>dna

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