含猪伪狂犬病病毒gB蛋白基因的重组杆状病毒转移载体、重组杆状病毒及制备方法和应用与流程

本发明属于兽用疫苗
技术领域：
，具体涉及含猪伪狂犬病病毒gb蛋白基因的重组杆状病毒转移载体、重组杆状病毒及制备方法和应用。
背景技术：
：猪伪狂犬病(pseudorabies，pr又名aujeszky'sdisease，ad)是由猪伪狂犬病毒(pseudorabiesvirus，prv)引起的一种传染病。除各种年龄的猪、牛都易感外，在自然条件下使羊、犬、猫、兔、鼠、水貂、狐等动物感染发病，容易给畜牧养殖业引起较大的经济损失。猪伪狂犬病病毒(pseudorabiesvirus，prv)又称猪疱疹病毒ⅰ型、传染性延髓麻痹病毒、奇痒症病毒、奥叶兹基氏病病毒，容易引起牛、羊、猪、犬和猫等多种家畜和野生动物发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎等症状。由于本病的临床症状类似狂犬病，故用了"伪狂犬病"这一病名。猪伪狂犬病病毒的感染特点包括两种，一种是潜伏感染，另外一种为隐性感染。潜伏感染是被感染猪不表现临床症状，但感染性病毒却能在猪体内长期以潜伏状态存在，也分离不到病毒，但用聚合酶探针方法可查出病毒基因组dna的存在，在外界不良环境刺激等造成的免疫力减弱时，潜伏状态的病毒可转化为具有感染性的病毒。隐性感染是在猪群使用疫苗接种或自然感染部分少量病毒后，该猪只得到部分免疫，可发生隐性感染猪和表现为亚临床症状的猪，这种带毒猪排毒可持续一年以上。针对猪伪狂犬病毒的感染特点，现已尝试用改良减毒活疫苗和灭活疫苗免疫来控制猪的疾病暴发。减毒活疫苗通常具有长期免疫效果，但存在衰减不足和遗传不稳定的风险。灭活疫苗不如减毒疫苗有效，同时需要重复接种，大大增加灭活疫苗的使用量。目前还没有出现携带prv单个基因的亚单位疫苗。技术实现要素：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种含有猪伪狂犬病病毒gb蛋白基因的重组杆状病毒转移载体，所述载体促进猪伪狂犬病病毒gb蛋白的分泌表达。本发明的目的还在于提供了一种表达猪伪狂犬病病毒gb蛋白或gb-iggfc融合蛋白的重组杆状病毒，所述病毒具有分泌表达gb蛋白或gb-iggfc融合蛋白的特点。本发明的目的还在于提供一种用于猪伪狂犬病的亚单位疫苗，所述亚单位疫苗不仅安全性高，而且具有特异性强，免疫性高效等特点。本发明提供了含有猪伪狂犬病病毒gb蛋白基因的重组杆状病毒转移载体，以gp67信号肽-gb-his标签为外源基因分别插入杆状病毒转移载体的bamhi与ecori之间的酶切位点处和xbai与hindiii之间酶切位点处；所述gb为编码c端跨膜区片段缺失的gb蛋白的基因；所述编码c端跨膜区片段缺失的gb蛋白的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。本发明提供了含有猪伪狂犬病病毒gb-iggfc融合蛋白基因的重组杆状病毒转移载体，以gp67信号肽-gb-iggfc融合蛋白-his标签为外源基因分别插入bamhi与ecori之间的酶切位点处和xbai与hindiii之间酶切位点处；所述gb-iggfc融合蛋白的核苷酸序列为编码c端跨膜区片段缺失的gb蛋白的基因和iggfc蛋白的编码序列通过连接序列顺序连接得到；所述编码c端跨膜区片段缺失的gb蛋白的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述iggfc蛋白的编码序列的核苷酸序列如seqidno.2所示。本发明提供了所述的重组杆状病毒转移载体的构建方法，包括以下步骤：(1)以prv基因组为模板，pcr扩增c端跨膜区片段缺失的gb片段；(2)将c端跨膜区片段缺失的gb片段与基础载体连接获得含gb的重组载体；(3)以含gb的重组载体为模板，用第一引物对进行pcr扩增，获得第一pcr扩增产物为gp67信号肽-gb-his标签目的片段；以所述第一pcr扩增产物为模板，分别添加酶切位点，得到两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段和两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段；(4)将所述两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段和两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段连接到杆状病毒转移载体中，得到含有猪伪狂犬病病毒gb蛋白基因的重组杆状病毒转移载体。优选的，第一引物对包括为gb的5’端添加gp67信号肽的正向引物和为gb的3’端添加his标签的反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示；所述反向引物的核苷酸序列如seqidno.5所示。优选的，添加酶切位点得到两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段的方法包括采用seqidno.6和seqidno.7进行pcr扩增得到；所述添加酶切位点得到两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段的方法包括采用seqidno.8和seqidno.9进行pcr扩增得到。本发明提供了一种含有猪伪狂犬病病毒gb-iggfc融合蛋白基因重组杆状病毒转移载体的构建方法，包括以下步骤：(1)以prv基因组为模板，pcr扩增c端跨膜区片段缺失的gb片段及人工合成iggfc-his片段；(2)将所述c端跨膜区片段缺失的gb片段或iggfc-his片段分别与基础载体连接，获得含gb的重组载体或含iggfc-his的重组载体；(3)以含gb的重组载体为模板，用第一引物对进行pcr扩增，获得第一pcr扩增产物为gp67信号肽-gb-his标签目的片段；(4)以所述gp67信号肽-gb-his标签目的片段和含iggfc-his的重组载体为模板，用第二引物对进行融合pcr扩增，获得第二pcr扩增产物为gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段；以所述第二pcr扩增产物为模板，分别添加酶切位点，得到两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段和两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段；(5)将所述两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段和两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段连接到杆状病毒转移载体中，得到含有猪伪狂犬病病毒gb-iggfc融合蛋白基因的重组杆状病毒转移载体。优选的，所述第二引物对包括如seqidno.10所示为gb的5’端添加gp67信号肽序列的正向引物，如seqidno.11所示为gb的3’端添加同源臂序列的反向引物，如seqidno.12所示为iggfc的5’端添加同源臂序列的正向引物和如seqidno.13所示为iggfc的3’端添加his标签序列的反向引物。在本发明中，以所述第二pcr扩增产物为模板，分别添加酶切位点，得到两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段的方法优选包括采用seqidno.6和seqidno.7进行pcr扩增得到。seqidno.6所示的引物使gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段的5’端添加上bamhi酶切位点；seqidno.7所示的引物使gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段的3’端添加上ecori酶切位点。在本发明中，所述添加酶切位点得到两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段的方法优选包括采用seqidno.8和seqidno.9进行pcr扩增得到。seqidno.8所示的引物使gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段的5’端添加上xbai酶切位点。seqidno.9所示的引物使gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段的3’端添加上hindiii酶切位点。本发明提供了一种表达猪伪狂犬病病毒gb蛋白的重组杆状病毒，将所述的重组杆状病毒转移载体转染至昆虫细胞，培养至细胞出现病变，收集上清液得到。本发明提供了一种表达猪伪狂犬病病毒gb-iggfc融合蛋白的重组杆状病毒，将所述的重组杆状病毒转移载体转染至昆虫细胞，培养至细胞出现病变，收集上清液得到。本发明所述重组杆状病毒转移载体或所述方法构建得到重组杆状病毒转移载体或所述重组杆状病毒在生产猪伪狂犬病的疫苗中的应用。本发明提供了一种防治猪伪狂犬病的亚单位疫苗，包括佐剂和如下蛋白中的一种：所述的重组杆状病毒表达的猪伪狂犬病病毒gb蛋白和所述的重组杆状病毒表达的gb-iggfc融合蛋白。优选的，所述猪伪狂犬病病毒gb蛋白的浓度为200～300μg/ml；所述gb-iggfc融合蛋白的浓度为150～200μg/ml。本发明提供了含有猪伪狂犬病病毒gb蛋白基因的重组杆状病毒转移载体，gp67信号肽-gb-his标签为外源基因分别插入杆状病毒转移载体的bamhi和ecori酶切位点处和xbai和hindiii酶切位点处；所述gb为编码跨膜区片段缺失的gb蛋白的基因。所述gb的序列是根据我国流行优势毒株中编码跨膜区片段缺失的编码gb蛋白的dna序列，所述gb蛋白为prv的糖蛋白，包括2082bp，跨膜区缺失更利于所述gb蛋白的分泌表达，同时所述重组杆状病毒转移载体中将gp67信号肽-gb-his标签以2拷贝的形式置于杆状病毒转移载体中的启动子下，能提高了目的基因的表达量，为后续分离纯化以及体外表达该蛋白提供了便利。本发明提供了含有猪伪狂犬病病毒gb-iggfc融合蛋白基因的重组杆状病毒转移载体，gp67信号肽-gb-iggfc融合蛋白-his标签为外源基因分别插入杆状病毒转移载体的bamhi和ecori酶切位点处和xbai和hindiii酶切位点处；所述gb-iggfc融合蛋白为编码跨膜区片段缺失的gb蛋白的基因和iggfc蛋白的编码序列通过连接序列顺序连接得到。所述gb-iggfc编码的蛋白为prv的gb与鼠源iggfc融合蛋白，全长为3231个碱基，编码1077个氨基酸，gb跨膜区缺失更利于所述gb-iggfc蛋白的分泌表达，同时将prv糖蛋白gb与iggfc融合可以增强对prv的保护性免疫，igg2afc片段发挥潜在的分子佐剂作用。同时将所述gp67信号肽-gb-iggfc融合蛋白-his标签以2拷贝形式置于杆状病毒转移载体的启动子下，提高了目的基因的表达量，为后续分离纯化以及体外表达该蛋白提供了便利。本发明所述重组杆状病毒转移载体或所述方法构建得到重组杆状病毒转移载体或所述重组杆状病毒在生产猪伪狂犬病的疫苗中的应用。由于猪伪狂犬病毒gb蛋白重组杆状病毒表达的gb蛋白以及gb-iggfc融合蛋白重组杆状病毒表达的gb-iggfc融合蛋白，皆非全病毒，因此用以制备亚单位疫苗无病毒扩散的危险，生产过程较安全。同时制备的gb蛋白和gb-iggfc融合蛋白免疫机体后，具有诊断抗原特异性强，灵敏度高，诊断迅速的特点；能够实现高效生产基因工程疫苗。此外，与gb蛋白相比，获得大量的gb-iggfc融合蛋白的抗原免疫原性更好，对小鼠的保护率更高。因此，igg2afc片段作为分子佐剂与抗原融合，起到提高抗原的免疫原性的作用。附图说明图1为重组杆状病毒转移载体pfbd-2-prvgb和pfbd-2-prvgb-iggfc酶切鉴定图谱；图2为westernblot和sda-page分析重组杆状病毒ac-2-prv-gb蛋白表达电泳图；图3为westernblot和sda-page分析重组杆状病毒ac-2-prv-gb-igg2afc蛋白表达电泳图；图4为小鼠免疫两种亚单位疫苗后不同时间点抗prv的抗体水平检测；图5为两种亚单位疫苗免疫小鼠诱导细胞因子水平检测；图6为两种亚单位疫苗免疫小鼠免疫攻毒后小鼠后存活率。具体实施方式本发明提供了包含猪伪狂犬病病毒gb蛋白基因的重组杆状病毒转移载体，以gp67信号肽-gb-his标签为外源基因分别插入杆状病毒转移载体的bamhi与ecori之间的酶切位点处和xbai与hindiii之间酶切位点处；所述gb为编码c端跨膜区片段缺失的gb蛋白的基因；所述编码c端跨膜区片段缺失的gb蛋白的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示。gb基因全长为2745bp(seqidno.14)，gb基因表达的蛋白质的氨基酸序列如seqidno.15所示。在本发明中，所述编码c端跨膜区片段缺失的gb蛋白的基因并不局限于seqidno.1所示的核苷酸序列，还包括与seqidno.1相互补的核苷酸序列以及在seqidno.1的基础上，经过简单添加、删除、替换一个或多个核苷酸得到的序列都能实现本发明的目的，属于本发明的保护范围。在本发明实施例中，所述gp67信号肽-gb-his标签的核苷酸序列如seqidno.16所示。所述gp67信号肽-gb-his标签的编码序列如seqidno.17所示。所述gp67信号肽-gb-his标签的氨基酸序列如seqidno.18所示。本发明对所述杆状病毒转移载体的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的杆状病毒转移载体即可。为了举例说明重组杆状病毒转移载体组成，本领域实施例中用pfbdhmhnm1p10eefp质粒作为重组杆状病毒转移载体制备重组杆状病毒。所述pfbdhmhnm1p10eefp质粒由本实验室构建提供(专利号：zl200910063217.6)。由于本发明所述重组杆状病毒转移载体的核心在于gp67信号肽-gb-his标签为外源基因，而杆状病毒转移载体的种类不做具体，凡是含有两个及两个以上的多克隆位点即可。所述多克隆位点的种类不做限制，并不局限于bamhi与ecori之间的酶切位点和xbai与hindiii之间酶切位点。本发明对所述gp67信号肽的核苷酸序列不做特殊限制，采用本领域所熟知的gp67信号肽的核苷酸序列即可。在本发明实施例中，所述gp67信号肽的序列参见构建方法中seqidno.3和seqidno.4所示序列。本发明对所述his标签的核苷酸序列不做特殊限制，采用本领域所熟知的his标签的核苷酸序列即可。在本发明实施例中，所述his标签的序列参见构建方法中seqidno.5所示序列。本发明提供了包含猪伪狂犬病病毒gb-iggfc融合蛋白基因的重组杆状病毒转移载体，gp67信号肽-gb-iggfc融合蛋白-his标签为外源基因分别插入杆状病毒转移载体的bamhi与ecori之间的酶切位点处和xbai与hindiii之间酶切位点处；所述gb-iggfc融合蛋白的核苷酸序列为编码c端跨膜区片段缺失的gb蛋白的基因和iggfc蛋白的编码序列通过连接序列顺序连接得到；所述编码c端跨膜区片段缺失的gb蛋白的基因的核苷酸序列如seqidno.1所示；所述iggfc蛋白的编码序列的核苷酸序列如seqidno.2所示。在本发明中，所述编码c端跨膜区片段缺失的gb蛋白的序列同时上述描述，在此不做赘述。所述iggfc蛋白选择鼠源iggfc蛋白，优选为鼠源igg2afc蛋白，而不是其他igg亚型，因为igg2afc与鼠源fcγri受体亲和力更高，而fcγri受体是免疫球蛋白的高亲和性受体，有利于形成的融合蛋白具有较强的特异性。所述iggfc蛋白的编码序列并不局限于seqidno.2所示的核苷酸序列，还包括与seqidno.2相互补的核苷酸序列以及在seqidno.2的基础上，经过简单添加、删除、替换一个或多个核苷酸得到的序列都能实现本发明的目的，属于本发明的保护范围。所述连接序列的作用是将iggfc蛋白的核苷酸序列的5’端和gb蛋白的3’端连接起来。所述连接序列具有较高的柔性，采用本领域所熟知的起连接作用的连接序列即可。在本发明实施例中，所述连接序列的具体核苷酸序列参见下述构建方法中如seqidno.8所示为gb的3’端添加同源臂序列的反向引物或如seqidno.9所示为iggfc的5’端添加同源臂序列的正向引物中的核苷酸序列即可。所述杆状病毒转移载体的种类同含有猪伪狂犬病病毒gb蛋白基因重组杆状病毒转移载体，在此不做赘述。在本发明中，所述gp67信号肽-gb-iggfc融合蛋白-his标签的编码序列的核苷酸序列如seqidno.19所示，所述gb-igg2afc基因的核苷酸序列共有2970bp，编码989个氨基酸；所述gb-igg2afc基因编码的蛋白质序列如seqidno.20所示。本发明提供了所述的重组杆状病毒转移载体的构建方法，包括以下步骤：(1)以prv基因组为模板，pcr扩增c端跨膜区片段缺失的gb片段；(2)将c端跨膜区片段缺失的gb片段与基础载体连接获得含gb的重组载体；(3)以gb的重组载体为模板，用第一引物对进行pcr扩增，获得第一pcr扩增产物为gp67信号肽-gb-his标签目的片段；以所述第一pcr扩增产物为模板，分别添加酶切位点，得到两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段和两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段；(4)将所述两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段和两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段连接到杆状病毒转移载体中，得到含有猪伪狂犬病病毒gb蛋白基因的重组杆状病毒转移载体。本发明以prv基因组为模板，pcr扩增c端跨膜区片段缺失的gb片段。所述c端跨膜区片段缺失的gb片段包括以猪伪狂犬病病毒的基因组为模板，进行pcr扩增得到。所述pcr扩增用正向引物包括gcggccgtgacgcgggccgcctcggcctcgcc(seqidno.21)；所述pcr扩增用反向引物包括gttgtggtccaccttgaccacgcggtcaatg，(seqidno.22)。所述pcr扩增的程序如下：4℃，5min；(94℃，30s；60℃，30s；72℃，1kb/min)30个循环；72℃，5min；所述pcr扩增的总体系为50μl：10xbuffer(含mg2+)，5μl；dntp，6ul；10μmprimer1，2μl；10μmprimer2，2μl；模板，200ng；taq酶，0.5μl；ddh2o补齐体系。得到c端跨膜区片段缺失的gb片段后，本发明将c端跨膜区片段缺失的gb片段与基础载体连接获得含gb的重组载体。在本发明中，所述基础载体的种类不做具体限制，采用本领域所熟知的基础载体即可。本发明实施例中，所述基础载体是以peasyblunt载体为了，说明连接过程。所述peasyblunt载体和跨膜区片段缺失的gb片段混合室温反应5min，通过平末端连接。以gb的重组载体为模板，本发明用第一引物对进行pcr扩增，获得第一pcr扩增产物为gp67信号肽-gb-his标签目的片段；以所述第一pcr扩增产物为模板，分别添加酶切位点，得到两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段和两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段。在本发明中，第一引物对优选包括为gb的5’端添加gp67信号肽的正向引物和为gb的3’端添加his标签的反向引物，所述正向引物的核苷酸序列如seqidno.3和seqidno.4所示；所述反向引物的核苷酸序列如seqidno.5所示。所述第一引物对进行pcr扩增的反应体系为50μl：10×buffer(含mg2+)，5μl；dntp,6μl；10μm正向引物，2μl；10μm反向引物，2μl；模板，200ng；taq，0.5μl；ddh2o补足体系；所述第一引物对进行pcr扩增的反应程序为94℃，5min；(94℃，30s；65℃，30s；72℃，1kb/min)30个循环；72℃，5min。在本发明中，所述添加酶切位点得到两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段的方法优选包括采用seqidno.6和seqidno.7进行pcr扩增得到。seqidno.6所示的引物使gp67信号肽-gb-his标签目的片段的5’端添加上bamhi酶切位点；seqidno.7所示的引物使gp67信号肽-gb-his标签目的片段的3’端添加上ecori酶切位点。seqidno.6和seqidno.7进行pcr扩增时的反应程序优选如下：94℃，5min；(94℃，30s；65℃，30s；72℃，1kb/min)30个循环；72℃，5min。所述反应体系同上。在本发明中，所述添加酶切位点得到两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段的方法优选包括采用seqidno.8和seqidno.9进行pcr扩增得到。seqidno.8所示的引物使gp67信号肽-gb-his标签目的片段的5’端添加上xbai酶切位点。seqidno.9所示的引物使gp67信号肽-gb-his标签目的片段的3’端添加上hindiii酶切位点。seqidno.8和seqidno.9进行pcr扩增时的反应程序优选如下：94℃，5min；(94℃，30s；65℃，30s；72℃，1kb/min)30个循环；72℃，5min。所述反应体系同上。得到两个片段后，本发明将所述两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段和两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段连接到杆状病毒转移载体中，得到含有猪伪狂犬病病毒gb蛋白基因的重组杆状病毒转移载体。在本发明中，所述连接前，优选将杆状病毒转移载体或上述两目标片段先后用bamhi与ecori和xbai与hindiii酶进行酶切。所述连接的方法优选采用t4dna连接酶在16℃连接过夜。本发明提供了一种含有猪伪狂犬病病毒gb-iggfc融合蛋白基因的重组杆状病毒转移载体的构建方法，包括以下步骤：(1)以prv基因组为模板，pcr扩增c端跨膜区片段缺失的gb片段及人工合成iggfc-his片段；(2)将所述c端跨膜区片段缺失的gb片段或iggfc-his片段分别与基础载体连接，获得含gb的重组载体或含iggfc-his的重组载体；(3)以含gb的重组载体为模板，用第一引物对进行pcr扩增，获得第一pcr扩增产物为gp67信号肽-gb-his标签目的片段；(4)以所述gp67信号肽-gb-his标签目的片段和含iggfc-his的重组载体为模板，用第二引物对进行融合pcr扩增，获得第二pcr扩增产物为gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段；以所述第二pcr扩增产物为模板，分别添加酶切位点，得到两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段和两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目的片段；(5)将所述两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段和两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段连接到杆状病毒转移载体中，得到含有猪伪狂犬病病毒gb-iggfc融合蛋白基因的重组杆状病毒转移载体。在本发明中，所述以prv基因组为模板，pcr扩增c端跨膜区片段缺失的gb片段及人工合成iggfc-his片段的操作方法同上，再次不做赘述。在本发明中，将所述c端跨膜区片段缺失的gb片段或iggfc-his片段分别与基础载体连接的操作方法同上，再次不做赘述。在本发明中，以含gb的重组载体为模板，用第一引物对进行pcr扩增的操作方法同上，再次不做赘述。在本发明中，所述第二引物对优选包括如seqidno.10所示为gb的5’端添加gp67信号肽序列的正向引物，如seqidno.11所示为gb的3’端添加同源臂序列的反向引物，如seqidno.12所示为iggfc的5’端添加同源臂序列的正向引物和如seqidno.13所示为iggfc的3’端添加his标签序列的反向引物。所述第二引物对进行融合pcr扩增时反应程序：94℃，5min；(94℃，30s；65℃，30s；72℃，1kb/min)30个循环；72℃，5min；所述pcr扩增时反应体系为：50μl：10xbuffer(含mg2+)，5μl；dntp，6μl；10μm正向引物，2μl；10μm反向引物，2μl；模板(hbm-gd-his或iggfc-his)，200ng；taq，0.5μl；ddh2o补足体系；扩增体系2：50μl：10xbuffer(含mg2+)，5μl；dntp，6μl；10μm正向引物，2μl；10μm反向引物，2μl；模板1(hbm信号肽-gd-his)，200ng；模板2(iggfc-his)，200ng；taq，0.5μl；ddh2o补足体系。在本发明中，以所述第二pcr扩增产物为模板，分别添加酶切位点，得到两端分别连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段的方法优选包括采用seqidno.6和seqidno.7进行pcr扩增得到。seqidno.6所示的引物使gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段的5’端添加上bamhi酶切位点；seqidno.7所示的引物使gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段的3’端添加上ecori酶切位点。seqidno.6和seqidno.7进行pcr扩增时的反应程序优选如下：94℃，5min；(94℃，30s；65℃，30s；72℃，1kb/min)，30个循环)；72℃，5min。所述反应体系同上。在本发明中，所述添加酶切位点得到两端分别连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段的方法优选包括采用seqidno.8和seqidno.9进行pcr扩增得到。seqidno.8所示的引物使gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段的5’端添加上xbai酶切位点。seqidno.9所示的引物使gp67信号肽-gb-iggfc-his标签目的片段的3’端添加上hindiii酶切位点。seqidno.8和seqidno.9进行pcr扩增时的反应程序优选如下：94℃，5min；(94℃，30s；65℃，30s；72℃，1kb/min)，30个循环；72℃，5min。所述反应体系同上。本发明提供了一种表达猪伪狂犬病病毒gb蛋白或gb-iggfc融合蛋白的重组杆状病毒，将上述构建方法制备的重组杆状病毒转移载体转染至昆虫细胞，培养至细胞出现病变，收集上清液得到。在本发明中，所述重组杆状病毒转移载体转染至昆虫细胞的方法优选为采用脂质体介导转染法转染。本发明对所述昆虫细胞的种类没有特殊限制，采用本领域所熟知的昆虫细胞即可。在本发明实施例中，所述昆虫细胞优选为sf9昆虫细胞。本发明对转染后的细胞培养的方法没有特殊限定，采用本领域常规的转染细胞培养方法即可。本发明待所述细胞出现病变后，采用常规离心法收集上清液即可。本发明所述重组杆状病毒转移载体或所述方法构建得到重组杆状病毒转移载体或所述重组杆状病毒在生产猪伪狂犬病的疫苗中的应用。在本发明中，所述生产猪伪狂犬病的疫苗的方法优选包括以下步骤：将表达猪伪狂犬病病毒gb蛋白或gb--iggfc融合蛋白的重组杆状病毒以0.1moi剂量接种转染昆虫细胞中，继续培养，待细胞出现病变时，收集上清液，经过westernblot分析检测发现gb，和gb-iggfc融合蛋白分泌上清液中。本发明提供了一种防治猪伪狂犬病的亚单位疫苗，包括佐剂和如下蛋白中的一种：所述的重组杆状病毒表达的猪伪狂犬病病毒gb蛋白和所述的重组杆状病毒表达的gb-iggfc融合蛋白。在本发明中，所述猪伪狂犬病病毒gb蛋白的浓度优选为200～300μg/ml，更优选为250μg/ml；所述gb-iggfc融合蛋白的浓度为150～200μg/ml，更优选为180μg/ml。在本发明中，所述佐剂优选为seppicims-1313佐剂。所述gb或gb-iggfc蛋白与佐剂的体积比优选为7:3。本发明所述的亚单位疫苗的滴鼻剂量优选为20μg/只6周龄小鼠，所述小鼠的品种为babic。首次免疫后14天以同样剂量加强免疫一次。下面结合实施例对本发明提供的猪伪狂犬病病毒gb蛋白重组杆状病毒转移载体、重组杆状病毒病毒及其制备方法和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。实施例1含有猪伪狂犬病毒gb蛋白基因的重组杆状病毒转移载体pfbd-2-prvgb的构建方法人工合成编码c端跨膜区片段缺失的基因gb，将所述gb与peasyblunt载体连接获得peasyblunt-gb重组载体，然后测序验证，结果比对后正确备用。以质粒peasyblunt-gb为模板，分别通过2组引物对进行pcr扩增获得连接有gp67信号肽序列的gb基因，进而通过bamhi和ecori，xbai和hindiii将目的基因分别克隆到杆状病毒转移载体pfbdhmhnm1p10eefp简称pfbd(参见中国专利200910063217.6一种表达扔修饰合成的夹心h1n1流感病毒ha-na-m1基因的重组杆状病毒)。具体为以peasyblunt-gb为模板，用第一引物对分别进行pcr扩增获得gp67-gb-his标签目的片段；以第一引物对扩增获得的片段gp67信号肽-gb-his标签目标序列为模板，用第二引物对分别进行pcr扩增获得连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目标序列和获得连接有xbai和hindiii酶切位点的gp67信号肽-gb-his标签目标序列。其中第一组引物对的序列如seqidno.3和seqidno.4，seqidno.5所示；连接有xbai和hindiii酶切位点的引物如seqidno.6，seqidno.7，连接有bamhi和ecori酶切位点的引物如seqidno.8，seqidno.9所示；所述引物序列见表1。表1引物序列信息一览表获得的转移载体通过bamhi和ecori，spei和hindiii酶切鉴定，结果如图1中a所示，其中，m为15000bpmarker。酶切结果显示酶切鉴定片段大小与预期结果一致，表达转移载体构建成功。转移载体pfbd-2-prv-gb含有2个拷贝的prvgb基因序列。实施例2重组杆状病毒ac-2-prvgb的构建方法取1μg杆状病毒转移质粒pfbd-2-prv-gb加入到dhi0bac大肠感菌感受态细胞中，冰浴30分钟后。于42℃水中热激45秒，然后冰浴2分钟，加900微升soc液体培养基，37℃振摇培养4h，取100微升涂布于三抗lb平板(kan、gen和tel)，37℃培养24～48h。挑取经过3轮蓝白筛选的单个白菌落于10ml含有适宜浓度卡那霉素、庆大霉素、四环素三抗的lb培养基中，于37℃摇床(180rpm/min)培养16h。离心收集细菌，加入0.3mlsolutionⅰ重悬，加入0.3mlsolutionⅱ轻轻混匀，立即加入0.3mlsoutionⅲ混匀，冰浴10min，4℃12000rpm离心10min，转移上清于另一无菌空白的1.5mlep管中，加入0.5ml异丙醇混匀后静置10min，4℃12000rpm离心10min，弃掉上清后用75％乙醇洗涤，干燥后加入30～50μlte溶解，4℃保存。利用脂质体介导转染法，将鉴定阳性的杆粒转染sf9昆虫细胞：将sf9细胞接种于六孔板中，待细胞长到80～90％时进行转染，取两个1.5ml无菌ep管。a管中加入100μl无血清grace’s培养基和8μlcellinfection，管b中依次加入100μl无血清grace’s培养基和1-2ug重组的bacmid，室温静置5-10min，将管b中的溶液逐渐滴滴加至管a中，室温静置20min，然后补加无血清grace’s培养基至1ml。将1.5mlep管中的混合物加至单层细胞上，于27℃培养箱中培养5-6h，更换完全的grace’s培养液，继续培养2～3d，待出现细胞病变后，收集培养物上清液即获得了重组杆状病毒ac-2-prvgb。实施例3人工合成跨膜区片段缺失的编码gb蛋白的核苷酸序列gb和编码鼠源igg2afc蛋白的核苷酸序列的igg2afc；所述gb或igg2afc与peasyblunt载体按照体积比为0.5～4:1的比例混合室温反应5min，连接获得peasyblunt-gb及peasyblunt-igg2afc重组载体，测序验证，结果比对后正确备用。以peasyblunt-gb为模板，用实施例1中的第一引物对分别进行pcr扩增获得连接有gp67信号肽-gb-his标签目的片段；以第一引物对扩增获得的产物gp67-gb-his标签及peasyblunt-igg2afc为模板，用第二引物对分别进行pcr扩增获得连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-igg2afc-his目的片段；以第一引物对扩增获得的片段gp67-gb-igg2afc-his及peasyblunt-iggfc为模板，用第三引物对扩增，连接有bamhi和ecori酶切位点的gp67信号肽-gb-igg2afc-his序列目的片段。其中第二组引物对的序列如seqidno.10，seqidno.11，seqidno.12及seqidno.13所示；所述引物序列见表2。表2引物序列信息一览表序列编号gccaccatgctactagtaaatcagtcacaccaag-fseqidno.10ccacctcctccggacccacccccgcctgatccgttgtggtccaccttgaccacgcggtc-rseqidno.11ggggtgggtccggaggaggtggctcgggatctgagcccagagggcccacaatcaagccc-fseqidno.12ctagtgatggtgatggtgatgagagcccgatcc-rseqidno.13将连接有gp67信号肽序列且连接有bamhi和ecori酶切位点的gb-iggfc目的片段，连接有gp67信号肽序列且连接有xbai和hindiii酶切位点的gb-igg2afc目的片段连接到杆状病毒转移载体pfbdhmhnm1p10eefp中获得杆状病毒转移载体pfbd-2-prvgb-igg2afc。双酶切鉴定杆状病毒转移载体pfbd-2-prvgb-igg2afc。结果如图1中b所示，其中m为15000bpmarker。酶切结果显示酶切鉴定片段大小与预期结果一致，表达转移载体构建成功。酶切鉴定结果表明转移载体pfbd-2-prv-gb含有2个拷贝的prvgb基因序列。按照实施例2的构建方法制备表达gb-iggfc融合蛋白的重组杆状病毒ac-2-prvgb-igg2afc。实施例4分别以实施例2中得到的重组杆状病毒ac-2-prvgb和实施例3中得到的重组杆状病毒ac-2-prvgb-igg2afc为对象采用westernblot分析检测gb基因和gb-igg2afc融合基因的表达将sf9细胞接种6孔板，待细胞长至90％时，以0.1moi剂量接种实施例2或3中的重组杆状病毒。接种72小时后分别收集细胞培养上清和细胞。sda-page跑胶后，转入pvdf膜，以商品化his抗体为一抗(mbl,美国)，hrp标记的羊抗鼠igg(武汉博士德生物)为二抗，通过ecl显示液检测appve2蛋白表达。实验结果如图2和图3中左图所示。其中图2中左图，出现一条71kda的条带，图3中左图，出现一条90kda的条带。由此可见，重组病毒杆菌ac-2-prvgb和ac-2-prvgb-igg2afc感染昆虫细胞表达的gb蛋白和gb-igg2afc融合蛋白分泌上清中。sda-page检测纯化的gb蛋白及gb-igg2afc融合蛋白以0.0001moi剂量将实施例2中获得的重组杆状病毒ac-2-prvgb或ac-2-prvgb-igg2afc，接种hf细胞(1*106/ml)，接种4天或5天后收取，4度保存。收取后也可直接10000rpm，离心10min，收获培养上清。0.45mm或0.22μm滤器过滤上清。取20ml用平衡缓冲液平衡好的his填料，加入到过滤的上清中，4度搅拌过夜。将与his填料结合过夜的gb蛋白或gb-iggfc融合蛋白放入柱子中，自由滴落，将流穿液再次与his结合，自由滴落。0mm咪唑10mmtris-200mmnacl缓冲液洗脱2个柱体积，然后20mm咪唑10mmtris-200mmnacl缓冲液洗脱2个柱体积进行洗杂蛋白。最后200mm咪唑10mmtris-200mmnacl缓冲液洗脱2个柱体积，进行目的蛋白洗脱。洗脱后蛋白经过脱咪唑处理，取30～50μl样品进行sds-page检测。sda-page分析重组杆状病毒ac-2-prv-gb蛋白表达电泳图如图2中右图所示，其中出现一条71kda左右纯化出特异性条带。sda-page分析重组杆状病毒ac-2-prv-gb-igg2afc蛋白表达电泳图如图3中右图所示，其中出现一条90kda左右纯化出特异性条带。重组病毒杆菌ac-2-prvgb和ac-2-prvgb-igg2afc感染昆虫细胞表达的gb蛋白和gb-iggfc融合蛋白分泌上清中。实施例5防治猪伪狂犬病的疫苗(一)、重组杆状病ac-2-prvgb及ac-2-prvgb-igg2afc亚单位疫苗制备以实施例2获得重组杆状病毒ac-2-prvgb及实施例3制备的ac-2-prvgb-igg2afc，按照以0.0001moi剂量接种hf细胞(1*106/ml)，培养5天后，离心收获上清，经镍柱纯化，sds-page检测。计算gb及gb-igg2afc蛋白含量，疫苗中gb蛋白的浓度为200μg/ml；疫苗中gb-iggfc蛋白的浓度为300μg/ml。均以200μg/ml剂量与seppic的ims-1313佐剂进行乳化制备亚单位疫苗，每只免疫20μg蛋白。制备好亚单位疫苗经无菌检验后存于4度保存。(二)、重组杆状病毒ac-2-prvgb及ac-2-prvgb-igg2afc制备的亚单位疫苗的安全性试验。制备所述亚单位疫苗，分别免疫6周龄babic小鼠，每批分别接种12只小鼠。接种方式为滴鼻免疫。试验结果表明，疫苗接种后体温、精神和食欲均正常。证实该疫苗对小鼠均是安全的。(三)、重组杆状病毒ac-2-prvgb及ac-2-prvgb-igg2afc制备的亚单位疫苗在小鼠上的免疫原性试验为了系统评价上述指标的亚单位疫苗的有效性。购买6-7周龄pcr检测prv阴性小鼠60只，随机分成4组。免疫剂量20μg/只，免疫途径为滴鼻免疫。首次免疫后14天以同样剂量加强免疫一次。免疫前及免疫14，28，42天前眼睑下采血，免疫42天分离脾淋巴细胞，通过gd及gb蛋白刺激分离淋巴细胞，收获上清，测定细胞因子含量。1.机体产生针对prv的特异性抗体检测间接elisa法检测prv抗体，操作步骤如下：以本发明的重组杆状病毒表达纯化的prgb蛋白包被elisa板，进行方阵滴定，确定每孔包被0.5μg，4℃过夜。然后用1％bsa37℃封闭1h。洗涤后每孔加入50μl100倍稀释的待检血清，孵育1h。洗涤3遍，每孔加入50μl10000倍稀释的hrp标记的羊抗鼠或兔igg，37度孵育1h。洗涤后加入tmb底物溶液，室温显色10min。每孔加入50μl2mol/lh2so4终止溶液终止反应，测定od450值。结果表明，免疫本实施例制备的亚单位疫苗，除pbs组外，所有组均在14、28、42dpi处产生prv特异性igg抗体，并在42dpi处达到峰值。此外，接种gd-igg2afc和gb-igg2afc的小鼠igg抗体滴度均高于接种gd和gb的小鼠(如图4所示)。上述结果证实，ac-2-prvgb及ac-2-prvgb-igg2afc制备的亚单位疫苗能有效诱导产生针对appv的特应性抗体。显然，gb-igg2afc免疫组产生的prv特异性igg抗体明显高于gd或gb免疫组。这些结果表明，将抗原融合到igg2afc可有效促进体液免疫反应。2.机体产生特异性细胞免疫反应检测(1)无菌取出小鼠脾脏，置盛有不完全rpmi-1640的平皿中清洗后，转入无菌匀浆器中，加少许不完全1640，轻轻研磨，补加不完全rpmi-1640混匀，经细胞滤器过滤去除组织碎片。轻轻吸取过滤液入15ml离心管中，1000rpm离心10min。弃上清，加入5ml无菌的8.3g/lnh4cl，静止5min(去除红细胞)，1000rpm离心10min。弃上清，用不完全rpmi-1640洗涤，1000rpm离心10min。弃上清，沉淀用完全2.5mlrpmi-1640(含10％fbs)悬浮。细胞计数，台盼蓝染色，要求细胞活性应在95％以上。调整细胞浓度为1×106/ml。混匀后加入12孔板，每孔500μl。每个样品用纯化的gb蛋白，刀豆素(阳性对照)和培养液(阴性对照)刺激，且每种刺激物做3个重复；将12孔细胞培养板放置37℃，5％co2温箱中培养24h，然后离心收获上清。用商品化小鼠ifn-γ和il-4elisa检测试剂盒分别检测上清中ifn-γ和il-4蛋白表达水平，试剂盒采用双抗夹心elisa。结果表明，四个亚单位疫苗免疫组的il-4浓度明显高于ifn-γ。此外gb-iggfc免疫组的il-4浓度明显高于在gd或gb组(图5，其中左图为三个处理组中il-4浓度变化，右图为三个处理组中ifn-γ的浓度变化)。这些数据表明，连接fc的prvgd或gb蛋白可显著的促进细胞免疫反应。(四)、重组杆状病毒ac-2-prvgb及ac-2-prvgb-igg2afc制备的亚单位疫苗在小鼠上的攻毒保护实验为了评估小鼠igg2afc片段作为潜在分子佐剂的适宜性，所有小鼠均鼻内感染100ld50的prvgx野毒株。在监测期间，不同组的保护率如图6所示。攻毒后，gb-igg2afc组的保护率明显高于gb组。免疫gb-igg2afc的小鼠全部存活，无任何临床症状；免疫gd-igg2afc的小鼠存活率为83％；免疫gd的小鼠存活率为50％；免疫gb-igg2afc的小鼠存活率为67％(如图6所示)。这些数据表明重组杆状病毒表达的prvgd或gb蛋白能够有效地保护小鼠免受prv感染。此外，gb与igg2afc片段亚单位疫苗的融合可以达到最佳的保护效果。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本
技术领域：
的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。序列表<110>华中农业大学<120>含猪伪狂犬病病毒gb蛋白基因的重组杆状病毒转移载体、重组杆状病毒及制备方法和应用<160>22<170>siposequencelisting1.0<210>1<211>2082<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>1gcggccgtgacgcgggccgcctcggcctcgcccgcgcccgggacgggcgccaccccagac60ggcttctccgcggaggagtccctcgaggagatcgacggggccgtctcccccggcccctcg120gacgcccccgacggcgagtacggcgacctggacgcgcgcacggccgtgcgcgcggccgcg180accgagcgggaccgcttctacgtctgcccgccgccgtccggctccacggtggtgcgcctg240gagcccgagcaggcctgccccgagtactcgcaggggcgcaacttcacggaggggatcgcc300gtgctcttcaaggagaacatcgccccgcacaagttcaaggcccacatctactacaagaac360gtcatcgtcacgaccgtgtggtccgggagcacgtacgcggccatcacgaaccgcttcacg420gaccgcgtgcccgtccccgtgcaggagatcacggacgtgatcgaccgccgcggcaagtgc480gtctccaaggccgagtacgtgcgcaacaaccacaaggtgaccgccttcgaccgcgacgag540aaccccgtcgaggtggacctgcgcccctcgcgcctgaacgcgctcggcacccgcggctgg600cacaccaccaacgacacctacaccaagatcggcgccgcgggcttctaccacacgggcacc660tccgtcaactgcatcgtcgaggaggtggaggcgcgctccgtgtacccctacgactccttc720gccctgtccacgggggacatcgtgtacatgtcccccttctacggcctgcgcgagggggcc780cacggggagcacatcggctacgcgcccgggcgcttccagcaggtggagcactactacccc840atcgacctggactcgcgcctccgcgcctccgagagcgtgacgcgcaactttctgcgcacg900ccgcacttcacggtggcctgggactgggcccccaagacgcggcgcgtgtgcagcctggcc960aagtggcgcgaggccgaggagatgatccgcgacgagacgcgcgacgggtccttccgcttc1020acgtcgcgggccctgggcgcctccttcgtcagcgacgtcacgcagctcgacctgcagcgc1080gtgcacctgggcgactgcgtcctccgcgaggcctcggaggccatcgacgccatctaccgg1140cggcgctacaacaacacgcacgtgctggccggcgacaagcccgaggtgtacctcgcccgc1200gggggcttcgtggtggccttccgcccgctgatctcgaacgagctggcgcagctgtacgcg1260cgcgagctcgagcgcctcggcctcgccggcgtcgtgggccccgcgtcccccgcggccgcc1320cgtcgggcccggcgctcccccggcccggcggggacgcccgagccgccggccgtcaacggc1380acggggcacctgcgcatcaccacgggctcggccgagtttgcgcgcctgcagttcacctac1440gaccacatccaggcgcacgtgaacgacatgctgagccgcatcgcggccgcctggtgcgag1500ctgcagaacaaggaccgcaccctgtggggcgagatgtcgcgcctgaaccccagcgccgtg1560gccacggccgcgctgggccagcgcgtctcggcgcgcatgctcggcgacgtgatggccatc1620tcgcggtgcgtggaggtgcgcggcggcgtgtacgtgcagaactccatgcgcgtgcccggc1680gagcgcggcacgtgctacagccgcccgctggtgaccttcgagcacaacggcacgggcgtg1740atcgagggccagctcggcgacgacaacgagctcctcatctcgcgcgacctcatcgagccc1800tgcaccggcaaccaccggcgctactttaagctgggcggcgggtacgtgtactacgaggac1860tacagctacgtgcgcatggtggaggtgcccgagacgatcagcacgcgggtgaccctgaac1920ctgacgctgctcgaggaccgcgagttcctgcccctcgaggtgtacacgcgcgaggagctc1980gccgacacgggcctcctggactacagcgagatccagcgccgcaaccagctgcacgcgctc2040aagttctacgacattgaccgcgtggtcaaggtggaccacaac2082<210>2<211>699<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>2gagcccagagggcccacaatcaagccctgtcctccatgcaaatgcccagcacctaacctc60ttgggtggaccatccgtcttcatcttccctccaaagatcaaggatgtactcatgatctcc120ctgagccccatagtcacatgtgtggtggtggatgtgagcgaggatgacccagatgtccag180atcagctggtttgtgaacaacgtggaagtacacacagctcagacacaaacccatagagag240gattacaacagtactctccgggtggtcagtgccctccccatccagcaccaggactggatg300agtggcaaggagttcaaatgcaaggtcaacaacaaagacctgccagcgcccatcgagaga360accatctcaaaacccaaagggtcagtaagagctccacaggtatatgtcttgcctccacca420gaagaagagatgactaagaaacaggtcactctgacctgcatggtcacagacttcatgcct480gaagacatttacgtggagtggaccaacaacgggaaaacagagctaaactacaagaacact540gaaccagtcctggactctgatggttcttacttcatgtacagcaagctgagagtggaaaag600aagaactgggtggaaagaaatagctactcctgttcagtggtccacgagggtctgcacaat660caccacacgactaagagcttctcccggactccgggtaaa699<210>3<211>76<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>3taagcgctattgttttatatgtgcttttggcggcggcggcgcattctgcctttgcggcgg60ccgtgacgcgggccgc76<210>4<211>85<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>4gccaccatgctactagtaaatcagtcacaccaaggcttcaataaggaacacacaagcaag60atggtaagcgctattgttttatatg85<210>5<211>59<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>5ctagtgatggtgatggtgatgagagcccgatccgcggtggcgcgagacgcccggcgcgg59<210>6<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>6ggatccgccaccatgctactagtaaatcagtcac34<210>7<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>7gaattcctagtgatggtgatggtgatgagagcccg35<210>8<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>8tctagagccaccatgctactagtaaatcagtcac34<210>9<211>35<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>9aagcttctagtgatggtgatggtgatgagagcccg35<210>10<211>34<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>10gccaccatgctactagtaaatcagtcacaccaag34<210>11<211>59<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>11ccacctcctccggacccacccccgcctgatccgttgtggtccaccttgaccacgcggtc59<210>12<211>59<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>12ggggtgggtccggaggaggtggctcgggatctgagcccagagggcccacaatcaagccc59<210>13<211>33<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>13ctagtgatggtgatggtgatgagagcccgatcc33<210>14<211>2745<212>dna<213>人工序列(artificialsequence)<400>14atgcccgctggtggcggtctttggcgcgggccccgcgggcatcggcccgggcaccacggc60ggtgctggcctcggacgtctttggcctgctccacaccacgctgcagctgcgcggggcgcc120gtcgcgctagcgctgctgctgctggcgctcgccgcgaccccgacgtgcggcgcggcggcc180gtgacgcgggccgcctcggcctcgcccgcgcccgggacgggcgccaccccagacggcttc240tccgcggaggagtccctcgaggagatcgacggggccgtctcccccggcccctcggacgcc300cccgacggcgagtacggcgacctggacgcgcgcacggccgtgcgcgcggccgcgaccgag360cgggaccgcttctacgtctgcccgccgccgtccggctccacggtggtgcgcctggagccc420gagcaggcctgccccgagtactcgcaggggcgcaacttcacggaggggatcgccgtgctc480ttcaaggagaacatcgccccgcacaagttcaaggcccaca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