一种调控蛋鸭卵泡发育的长链RNALnc-13814及其应用的制作方法

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814及其应用。

背景技术：

卵泡发育与蛋鸭的产蛋性能密切相关，直接影响蛋鸭的产蛋量。已有研究表明，禽类卵泡发育是极为复杂的生物学过程，目前人们已对家禽的卵泡发育模式有了一定的了解，但是作为决定产蛋量的重要因素，卵泡发育的具体调控机理仍需深入研究。颗粒细胞的生长状况直接影响到卵泡的发育情况，卵泡颗粒细胞可以分泌性腺激素及生长因子调控卵泡膜细胞和卵母细胞的生长、分化和成熟，同时也精确的调控卵泡的生长发育。因此，保障良好的卵泡发育、掌握卵泡发育的调控规律有助于进一步提高蛋鸭的繁殖力，对于提高蛋鸭生产性能具有重要意义。

长链非编码rna(longnon-codingrnas,lncrna)是一类长度超多200nt、缺少特异完整的开放阅读框、没有或很少有蛋白编码功能的rnas分子。已有研究表明，lncrnas在细胞增殖、细胞周期、凋亡、侵袭迁移等生理和病理过程中发挥重要作用，通过在表观遗传、转录和转录后水平广泛调节基因的表达，参与了生物体生长、发育、衰老及死亡等重要生命活动的调控。近年来的研究发现，一些lncrna分子在人的肿瘤诊断和治疗中具有重要的意义；在鸡方面的研究发现lncrna对肌内脂肪细胞分化、肉品质、脂质代谢、胴体性状、繁殖性能等具有重要的调控作用。

然而目前关于蛋鸭组织特异性lncrna的研究尤其是蛋鸭卵泡lncrna及其调控机制的研究尚未见报道。因此，迫切需要提高蛋鸭卵泡lncrna研究水平和完整性，从而为蛋鸭基因组及其非编码rna的研究提供科学的理论依据，以便更为深入了解蛋鸭卵泡发育的调控机制，为提高蛋鸭的繁殖性能提供理论支撑。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术的研究空白，提供了一种调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814及其应用。

为实现上述目的，本发明通过以下方案实现：

在本发明的第一方面，提供了一种调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814，所述蛋鸭lncrna13814对应的cdna序列如seqidno：1所示。

本发明的调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814是申请人在前期完成的蛋鸭卵泡组织全转录组测序结果的基础上，通过对不同发育时期两组卵泡组织样品的测序结果进行大量生物信息学分析筛选获得的一个新的长链rna分子。申请人将其命名为蛋鸭长链rnalnc-13814，所述蛋鸭长链rnalnc-13814对应的cdna序列的长度为974bp。

在本发明的第二方面，提供了所述的调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814作为分子标志物在用于鉴别蛋鸭卵泡发育情况中的应用。

经过研究，申请人发现，本发明的调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814在蛋鸭白卵泡中的表达量显著高于蛋鸭黄卵泡中的表达量，由此本发明的蛋鸭长链rnalnc-13814可作为分子标志物用于鉴别蛋鸭卵泡的发育情况。

在本发明的第三方面，提供了所述的调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814作为分子标志物在用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞增殖分化状况中的应用。

经过研究，申请人发现，本发明的调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814分子组成的过表达载体转染进入蛋鸭卵泡颗粒细胞中，与空载体组相比，过表达蛋鸭长链rnalnc-13814基因后，抑制细胞凋亡的标志基因bcl2的表达量极显著降低(p<0.01)，促进细胞凋亡标志基因fas的表达量极显著增加(p<0.01)，从而可以得出该lncrna可作为分子标志物应用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞凋亡状况；过表达长链rnalnc-13814后，细胞凋亡数量增加，说明长链rnalnc-13814对蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡具有促进作用，从而进一步证明该lncrna可作为分子标志物应用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞凋亡状况。

在本发明的第四方面，提供了调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814基因的荧光定量pcr检测引物对，包括：

上游引物长链rnalnc-13814-f，如seqidno：2所示的核苷酸序列；

下游引物长链rnalnc-13814-r，如seqidno：3所示的核苷酸序列。

在本发明的第五方面，提供了调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814基因的荧光定量pcr检测试剂盒，包括所述的荧光定量pcr检测引物对。

作为本发明所述试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒还包括rna提取试剂、逆转录反应体系和荧光定量pcr反应体系，其中所述荧光定量pcr反应体系包括thunderbirdsybrqpcrmix、ddh2o、所述逆转录反应体系逆转录得到的cdna以及所述的检测引物对。

作为以上具体实施方式，所述荧光定量pcr反应体系如下：thunderbirdsybrqpcrmix10μl,10um蛋鸭长链rnalnc-13814上游引物和下游引物各0.4μl，待检测cdna模板2.0μl，ddh2o7.2μl，总体积20μl。

在本发明的第六方面，提供了所述试剂盒的使用方法，包括如下步骤：

步骤1、提取待检测样品中的rna，进行逆转录得到cdna；

步骤2、利用所述的引物对，对待检测样品cdna进行荧光定量pcr扩增，采用2^-δδct方法计算并获得不同来源卵泡样本中长链rnalnc-13814基因的相对表达量；

步骤3、根据pcr扩增产物及基因相对表达量判断待检测样本是否存在蛋鸭长链rnalnc-13814基因及其表达情况。

作为以上具体实施方式，所述步骤2中的荧光定量pcr反应条件为，98℃，10s；94℃，15s，54℃，15s，60℃，15s，40个循环；95℃，10s；65℃，60s，97℃，1s，1个循环。

在本发明的第七方面，提供了调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814基因过表达载体，所述载体包括所述蛋鸭长链rnalnc-13814对应的cdna序列。

本发明具有的有益效果是：

1、本发明提供的一种调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814的荧光定量pcr检测引物对及检测试剂盒，根据蛋鸭长链rnalnc-13814基因序列，设计特异性引物，利用荧光定量pcr检测该lncrna的表达，然后根据pcr扩增产物及基因相对表达量判断待检测样本是否存在蛋鸭长链rnalnc-13814基因及其表达情况。

2、本发明提供一种调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814，(1)该lncrna作为分子标志物在用于鉴别蛋鸭卵泡发育情况上的应用：本发明利用荧光定量pcr检测引物对及检测试剂盒，可以准确检测不同发育阶段卵泡组织中长链rnalnc-13814的不同表达情况，从而分析首次发现蛋鸭长链rnalnc-13814基因与蛋鸭卵泡发育相关，弥补了本领域现有的空缺，为解析蛋鸭卵泡发育的遗传机理提供理论基础和科学依据，对于研究蛋鸭繁殖性状的遗传本质及提高蛋鸭繁殖力具有重要的意义。(2)该lncrna作为分子标志物在检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞凋亡状况中的应用：本发明中用蛋鸭长链rnalnc-13814基因过表达载体可以稳定表达蛋鸭长链rnalnc-13814基因，检测指标反映蛋鸭长链rnalnc-13814基因的表达量，与空载体组相比，过表达蛋鸭长链rnalnc-13814基因后，抑制细胞凋亡标记基因bcl2的表达量极显著降低(p<0.01)，促进细胞凋亡标志基因fas的表达量极显著增加(p<0.01)，从而可以得出该lncrna可作为分子标志物应用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞凋亡状况；过表达长链rnalnc-13814后，细胞凋亡数量增加，说明长链rnalnc-13814对蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡具有促进作用，从而进一步证明该lncrna可作为分子标志物应用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞凋亡状况。

3、本发明提供的蛋鸭长链rnalnc-13814基因过表达载体，含有长链rnalnc-13814基因的全长序列片段，该载体可以稳定表达蛋鸭的长链rnalnc-13814，可以通过荧光定量检测反映蛋鸭长链rnalnc-13814基因的表达量，可以应用于相关技术领域；本发明提供的上述蛋鸭长链rnalnc-13814基因过表达载体的构建方法操作简单、快速易得，可以通过筛选准确得到带有目的基因的重组载体，制备得到的重组载体可以稳定表达目的基因。

附图说明

图1为本发明实施例2中提供的蛋鸭长链rnalnc-13814基因过表达载体中的pcdna3.1载体的结构示意图；

图2为本发明实施例2提供的蛋鸭长链rnalnc-13814基因过表达载体的菌落pcr电泳结果图；附图标记说明，图中泳道m为dl2000dnamarker，泳道1、2为长链rnalnc-13814过表达载体菌液扩增片段；

图3为本发明实施例2提供的蛋鸭长链rnalnc-13814基因的荧光定量pcr检测引物对及其检测试剂盒中蛋鸭长链rnalnc-13814基因的相对定量表达结果；

图4为实施例3中过表达蛋鸭长链rnalnc-13814后，过表达载体组与空载体组中长链rnalnc-13814基因表达变化情况；

图5为实施例3中过表达蛋鸭长链rnalnc-13814后，过表达载体组与空载体组中细胞增殖与凋亡关键基因表达变化情况；

图6为实施例3中过表达长链rnalnc-13814后，过表达载体组与空载体组中细胞凋亡变化情况。

具体实施方式

实施例1

一、蛋鸭长链rnalnc-13814基因

本实施例所述蛋鸭长链rnalnc-13814对应的cdna序列如seqidno：1所示，本发明的蛋鸭长链rnalnc-13814是申请人基于前期完成的蛋鸭卵泡组织全转录组测序结果，通过对不同发育时期两组卵泡组织样品的测序结果进行大量生物信息学分析筛选获得的一个新的lncrna分子。申请人将其命名为蛋鸭长链rnalnc-13814，所述蛋鸭长链rnalnc-13814对应的cdna序列的长度为974bp。

二、蛋鸭长链rnalnc-13814基因全长序列片段的制备

1、样本采集

采集产蛋高峰期蛋鸭白卵泡和黄卵泡样品各3份，pbs清洗干净后用针头刺破卵泡挤出卵泡液，放入无酶的1.5mlep管中，做好标记后投入液氮或-80℃冰箱保存。

2、样品总rna提取

利用传统的trizol、氯仿法提取卵泡组织总rna，具体步骤如下：

(1)液氮研磨，取50-100mg组织样品放于研钵中，倒入液氮少许，迅速研磨，待液氮挥发干净再加入少量液氮，直至组织样品研为粉末，将组织样品转入1.5ml离心管中，加入1mltrizol，试温放置5min，使其充分裂解；

(2)4℃12000g离心10min，将上清转入干净的无rnaase的1.5ml离心管中；

(3)按照每1ml匀浆液加0.2ml氯仿，剧烈15s，室温放置15min；

(4)4℃12000g离心10min；

(5)小心吸出上层无色溶液于另一个1.5ml无rnaase的离心管中，加入0.5倍的异丙醇混匀，试温静置5-10min；

(6)4℃12000g离心10min，弃上清，rna沉于管底；

(7)加入1ml75％乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

(8)4℃8000g离心5min，弃上清；

(9)加入1ml无水乙醇，温和振荡离心管，悬浮沉淀；

(10)4℃8000g离心5min，弃上清，室温晾干；

(11)使用30-50μl无rnaase去离子水溶解rna，-80℃保存备用。

3、rna样品质量检测分析

使用nanodrop1000微量分光光度计检测rna样品浓度与od值，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。

4、反转录

采用takara公司的反转录试剂盒rtreagentkitwithgdnaeraser的说明书步骤进行反转录获得cdna模板。

(1)基因组dna的除去反应

表1

反应条件如下：42℃2min；4℃保存。

(2)反转录反应

反应液配制过程在冰上进行。

表2

反应条件如下：37℃，15min；85℃，5sec；4℃保存。

5、以反转录得到的cdna为模板扩增蛋鸭长链rnalnc-13814基因序列的全长片段

(1)引物设计与合成

根据全转录组测序结果中蛋鸭长链rnalnc-13814基因序列的全长片段，采用premierpremier5.0软件设计引物，蛋鸭长链rnalnc-13814基因扩增引物序列如seqidno：4和seqidno：5所示；上述引物由北京奥科生物技术有限公司合成。

(2)将获得的目的片段蛋鸭长链rnalnc-13814基因pcr产物直接送测序，测序结果与预期的完全一致。

实施例2蛋鸭长链rnalnc-13814基因的荧光定量检测试剂盒与方法

本实施例设计荧光定量pcr检测引物对并识别鉴定实施例1所述蛋鸭长链rnalnc-13814在蛋鸭卵泡颗粒细胞中的客观存在。本实施例识别鉴定的方法包括以下步骤：

1、样本采集

采集产蛋高峰期蛋鸭白卵泡和黄卵泡样品各3份，pbs清洗干净后用针头刺破卵泡挤出卵泡液，放入无酶的1.5mlep管中，做好标记后投入液氮或-80℃冰箱保存。

2、样品总rna提取

利用传统的trizol、氯仿法提取卵泡组织总rna，具体步骤同实施例1。

3、rna样品质量检测分析

使用nanodrop1000微量分光光度计检测rna样品浓度与od值，利用1％琼脂糖凝胶电泳检测rna的完整性。

4、反转录

采用takara公司的反转录试剂盒rtreagentkitwithgdnaeraser的说明书步骤进行反转录获得cdna模板，同实施例1。

5、荧光定量pcr反应

长链rnalnc-13814基因荧光定量检测引物核苷酸序列如seqidno：2和seqidno：3所示。

利用takara公司的realtime试剂盒thunderbirdsybrqpcrmix说明书步骤进行荧光定量pcr，反应体系如下(20μl)：

表3

利用rochesw1.1三步法进行荧光定量pcr，扩增条件为：98℃，10s；94℃，15s，54℃，15s，60℃，15s，40个循环；95℃10s，65℃60s，97℃1s，1个循环。

反应结束后导出数据，结果利用2^-δδct方法进行分析。利用graphadprism软件对分析结果进行作图。

白卵泡和黄卵泡组织中长链rnalnc-13814基因表达结果见图3，结果显示，第一，白卵泡中以及黄卵泡中均有长链rnalnc-13814基因的表达，所述蛋鸭长链rnalnc-13814在蛋鸭卵泡颗粒细胞中的客观存在。第二，白卵泡中长链rnalnc-13814基因的表达量极显著高于黄卵泡中(p<0.01)。因此，可以看出，长链rnalnc-13814基因与卵泡的发育具有重要的相关性。

实施例3长链rnalnc-13814基因过表达对蛋鸭卵泡颗粒细胞凋亡的作用

一、蛋鸭长链rnalnc-13814基因过表达载体构建

本实施例提供蛋鸭长链rnalnc-13814基因过表达载体，所述载体包括所述蛋鸭长链rnalnc-13814对应的cdna序列。载体构建具体包括如下步骤：

1、pcdna3.1(+)载体的双酶切处理

pcdna3.1(+)载体的结构示意图如图1所示，载体含有限制性内切酶kpni和xhoi酶切位点。用两种内切酶kpni和xhoi对上述载体进行双酶切，酶切反应体系如下，体系总体积为50μl：

表4

反应条件为：37℃酶切6h，随后对酶切产物进行纯化回收。

2、蛋鸭长链rnalnc-13814基因全长片段的双酶切

对上述得到的目的片段蛋鸭长链rnalnc-13814基因pcr产物测序验证，对于实施例1中验证正确的pcr产物进行纯化，用两种内切酶kpni和xhoi对回收的上述pcr产物进行双酶切，酶切反应体系如表4所示，体系的总体积为50μl，反应条件为：37℃酶切6h，随后对酶切产物进行纯化回收。

表5

3、蛋鸭长链rnalnc-13814基因过表达载体的构建

将pcr扩增并双酶切后的长链rnalnc-13814基因片段与同样经过双酶切后的载体进行连接，连接反应体系如下(总体积10μl)：

表6

反应条件为：16℃过夜连接。

将连接产物转化入感受态细胞，对阳性克隆进行菌落pcr鉴定，结果如图2所示，图中m表示dl2000dnamarker，图中1-2表示单菌落的菌落pcr结果；进一步地，对重组载体蛋鸭长链rnalnc-13814基因过表达载体进行测序验证，测序结果如seqidno：1所示；菌落pcr和测序结果均正确的个体即为成功构建的重组载体，命名为13814-pcdna3.1。

二、蛋鸭卵泡颗粒细胞分离

蛋鸭卵泡颗粒细胞的分离采用如下步骤：

1、选择产蛋高峰期的产蛋鸭，颈静脉放血处死；取出整个卵巢组织，置于装有预冷pbs的无菌培养皿中；

2、用加有双抗的pbs缓冲液冲洗血污，漂洗3次；

3、将漂洗干净的卵泡移入装有预冷pbs缓冲液的平皿中，剥净卵泡外膜、结缔组织及血管网；

4、用手术刀在卵泡表面划一道1-2cm长的切口(动作要快)，释放卵黄，用pbs缓冲液将剩余的卵黄液漂洗干净，剩下的卵泡膜即为：基膜和卵泡颗粒细胞层；

5、将漂洗干净的卵泡膜尽量剪碎，置于15ml离心管中，加4ml培养基，用1ml移液枪反复吹打1min，4℃1000rpm离心后弃上清；

6、向沉淀中加入4ml0.2％ⅱ型胶原酶，重悬沉淀，置于37℃恒温摇床80rpm消化30min；

7、消化结束，加入4mlm199完全培养基(含10％血清)终止消化；用200目不锈钢筛过滤，并用2mlm199完全培养基清洗网筛，收集滤液，4℃1000rpm离心10min；

8、弃上清，加入10mlm199完全培养基，4℃1000rpm离心10min；

9、弃上清，加入m199完全培养基(含10％fbs及1％双抗)重悬后，测定细胞密度，调整悬浮液细胞密度为1×10⁶个/ml，接种于6孔培养皿，置于37℃、5％co2培养箱内静置培养；

10、颗粒细胞培养24小时后，换新鲜含有胎牛血清的m199培养基，贴壁细胞可用于进一步研究中。

三、细胞转染

1、分别取125μlopti-mem培养基稀释实施例3所得的长链rnalnc-13814基因过表达载体13814-pcdna3.1和空载体pcdna3.1(+)，并向其中加入5μlp3000；

2、取250μlopti-mem培养基稀释试剂，充分混匀；

3、分别向(1)中两管混合物中加入125μl(2)中的混合物，室温孵育5min；

4、将250μl混合物转入细胞。

各实验组设置3个重复孔，转染细胞分组如下：①转染pcdna3.1(+)(空载体组)，②转染13814-pcdna3.1(长链rnalnc-13814基因过表达载体组)。各转染组转染细胞24h后，利用trizol消化细胞，提取细胞总rna后用于过表达后荧光定量分析。

四、荧光定量分析

1、细胞中总rna的提取

利用trizol消化细胞，参照实施例1中总rna的提取方法提取细胞中总rna。

2、反转录

同实施例1中反转录的方法。

3、荧光定量pcr反应

(1)荧光定量pcr反应条件和方法同实施例1，其中长链rnalnc-13814基因荧光定量引物核苷酸序列如seqidno：2和seqidno：3所示，扩增条件为：98℃，10s；94℃，15s，54℃，15s，60℃，15s，40个循环；95℃10s，65℃60s，97℃1s，1个循环；

(2)抑制细胞凋亡标志基因bcl2荧光定量引物核苷酸序列如seqidno：6和seqidno：7所示，扩增条件为：98℃，10s；94℃，15s，56℃，15s，60℃，15s，40个循环；95℃10s，65℃60s，97℃1s，1个循环；

(3)细胞凋亡标志基因fas荧光定量引物核苷酸序列如seqidno：8和seqidno：9所示，扩增条件为：98℃，10s；94℃，15s，54℃，15s，60℃，15s，40个循环；95℃10s，65℃60s，97℃1s，1个循环。

五、细胞凋亡分析

1、收集上清：收集培养液于流式管中(有少量悬浮细胞)。

2、收集细胞：六孔板中的细胞用pbs洗涤一次，加入1ml0.25％胰酶消化细胞，待细胞变圆且有部分细胞悬浮，即加入pbs终止消化。用移液枪轻轻吹打细胞，使细胞悬浮。收集于流式管中，1500rpm离心5min，弃上清。

3、pbs洗涤细胞：加入3ml4℃预冷的pbs完全重悬细胞，1500rpm离心5min，弃上清。沉淀用300μl的bindingbuffer重悬。

4、荧光标记：加入5μlannexinv-fitc混匀后，加入5μlpropidiumiodide，混匀。室温下避光反应5-15min。

5、于1小时内上机检测

annexinv-fitc的绿色荧光通过fitc通道(fl1)检测，pi红色荧光通过pi通道(fl2)检测。流式细胞仪参数如下：激发波长ex＝488nm，发射波长em＝530nm。

六、结果分析

1、荧光定量结果分析

反应结束后导出数据，结果利用2^-δδct方法进行分析。利用graphadprism软件对分析结果进行作图。转染蛋鸭长链rnalnc-13814过表达载体后长链rnalnc-13814基因的表达量及抑制细胞凋亡、促进细胞凋亡标志基因的表达量分析结果见图4-5。

由图4可以看出，过表达蛋鸭长链rnalnc-13814基因后，与空载体组相比，过表达蛋鸭长链rnalnc-13814基因后长链rnalnc-13814的表达量极显著高于空载体组(p<0.01)；由此可知，本发明中的蛋鸭长链rnalnc-13814基因过表达载体可以稳定表达蛋鸭长链rnalnc-13814基因。

由图5可以看出，过表达蛋鸭长链rnalnc-13814基因后，与空载体组相比，抑制细胞凋亡的标记基因bcl2的表达量极显著降低(p<0.01)，细胞凋亡标志基因fas的表达量极显著增加(p<0.01)。从而可以得出该lncrna可作为分子标志物应用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞凋亡状况。

2、细胞凋亡结果分析

对流式细胞检测结果见图6。对测定结果进行分析，结果见下表7。

表7过表达长链rnalnc-13814后流式细胞仪检测细胞凋亡统计结果

由表7可以看出，过表达长链rnalnc-13814后，细胞凋亡数量增加，说明长链rnalnc-13814对蛋鸭卵泡颗粒细胞的凋亡具有促进作用，从而进一步证明该lncrna可作为分子标志物应用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞中细胞凋亡状况。

综上所述，本发明中的蛋鸭长链rnalnc-13814基因过表达载体可以稳定表达蛋鸭长链rnalnc-13814基因，可以作为检测指标反映蛋鸭长链rnalnc-13814基因的表达量，蛋鸭长链rnalnc-13814具有促进卵泡颗粒细胞凋亡的功能，可以应用于检测蛋鸭卵泡颗粒细胞凋亡状况。

本发明中的“蛋鸭长链rnalnc-13814”、“长链rnalnc-13814”、“调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814”均为同一rna的不同名称而已。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>湖北省农业科学院畜牧兽医研究所

<120>一种调控蛋鸭卵泡发育的长链rnalnc-13814及其应用

<160>9

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>974

<212>dna

<213>蛋鸭(cdna)

<400>1

gtcagtgtgctctgaggagctgggggcttgttcctgtgggctcagagtacaaagtctgag60

ccacttttgaaagcaagaaatggctgtcattaaggaaaaacggcattcctgaggtcactt120

cagagggaggtgtgattctcccttgcagagcagaaccaagagcccaggaaggtagcaagg180

atgaagggaatgagctgtggggacgggattacctccaggagaggggctggaggaatgcca240

acagctaaatgaccgaaccaccttcaaaggaatttggaagatcgccttccccagccacca300

ggctgctttgggagatgcctttcactgtgttggggtgaatatcaccgagcaggaacagga360

agaagactccagcccttctgacacagcagaggtttcctcctagaagacagggataaggag420

ggcagagggcttcatgtgggccactgtgggactgtaacaccacgaaggccaacgagaatt480

gtgtgcagggtggacaaggaaacaaatacgtccgagagaatcaacagtttgggaatatgc540

aagttaactttccatggctgtgtttctttgaaggtatccccttcccctaaattttccttt600

gctcctctcagttgtgtttctgtccaaactttcttcccctccaaaagctggaatactttc660

attatattgaaattaaatggaaaaaaatatatatccccaactaaatctgaaagtgatcaa720

aaaatttaatacaaaaagccatttttccttgaaaacaattcagctggctgggatcaaatc780

ttctcctgttgaaacagcaaaattccccttggtttcaggaaccgtggggtgggtgcttgg840

cagattttggtgcccacaagggcaacagactcctaatttcatcagttgcagaactctttt900

ccctgatcaccacatgggttttctgcctatggattaggcacatttggattttggagctcg960

tctaccaggcacga974

<210>2

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agcccaggaaggtagca17

<210>3

<211>17

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

aaggcatctcccaaagc17

<210>4

<211>48

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

cgtgtaattctagttgtttaaacacaaatacgtccgagagaatcaaca48

<210>5

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

caggtcgactctagactcgagtcgtgcctggtagacgagct41

<210>6

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

acggctctcgctcctgct18

<210>7

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>7

cggttgacgctctccacg18

<210>8

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>8

gccccagttgaagaaaaa18

<210>9

<211>18

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>9

tccaggcaagtaagaccc18