一种miRNA及其用于杀灭褐飞虱的应用的制作方法

本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种mirna及其用于杀灭褐飞虱的应用。

背景技术：

褐飞虱属于半翅目、飞虱科(hemiptera：delphacidae)，是水稻上的重要害虫之一。褐飞虱食性单一，仅为害水稻等少数稻属植物；其危害具有隐蔽性、爆发性和毁灭性等特点。此外，褐飞虱还能传播水稻草矮病毒(ricegrassystuntvirus)、齿叶矮缩病毒(riceraggedstuntvirus)、萎蔫矮缩病毒(ricewiltedstuntvirus)。据统计，我国近半数的水稻种植产区都遭到褐飞虱不同程度的为害，每年由褐飞虱造成的稻谷损失多达100～150万吨。21世纪以来，褐飞虱在各个稻区的危害面积和爆发次数都呈现逐年增加的趋势。目前褐飞虱的防治，主要依赖化学防治，由此产生的抗药性等问题日益严重，亟待寻找新的害虫防治措施。

microrna是一类仅有18～25个核苷酸的单链小分子rna，广泛存在于线虫、果蝇、植物和包括人在内的真核生物中，不具有开放阅读框因而不能编码蛋白质，其序列在进化上高度保守，在发育过程中其表达存在明显的组织特异性和时间特异性。在生物体内mirna能协同ago、dicer、trbp、pact等元件形成mirisc，mirisc能通过降解mrna或抑制其翻译两种不同的机制来负调控靶基因的表达。

mirna因其功能具有保守性的特点，在昆虫的研究中受到了更为广泛的关注。以黑腹果蝇为主的多种昆虫的大量研究表明，mirna参与了昆虫的生长发育、变态发育、生殖、免疫等几乎所有的生理过程。过表达mirna会抑制其靶基因的表达进而抑制相应的转录过程，严重时会导致生物体发育畸形甚至死亡。例如在德国小蠊中过表达mir-2，在果蝇中过表达mir-6和mir-11，都会导致昆虫出现死亡的情况。目前关于褐飞虱mirna的研究还相对较少，zhang等通过构建dicer1缺失突变来抑制褐飞虱体内的mirnas发挥功能，能显著抑制卵母细胞的形成。在褐飞虱中过表达mir-2703会抑制几丁质合成酶基因chsa的表达，导致若虫蜕皮困难而死亡。但目前还未见利用mirna防治褐飞虱的实例或报道。

技术实现要素：

本发明旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种mirna及其用于杀灭褐飞虱的应用，以拓展褐飞虱的分子生物学防治方法。

本发明要解决的另一技术问题是，能够通过基因调控作用对褐飞虱起到抑制、杀灭效果的具体基因，尚不明确。

本发明要解决的再一技术问题是，nlu-mir-9a基因对褐飞虱的杀灭作用原理，尚不明确。

为实现以上技术目的，本发明采用以下技术方案：

一种mirna，该mirna的核苷酸序列如seqidno:1所示。

在此基础上，本发明进一步提供了上述mirna用于杀灭褐飞虱的应用。

作为优选，该应用是将所述mirna注射于褐飞虱体内。

作为优选，每只褐飞虱的注射剂量是50～100ng。

作为优选，所述褐飞虱是褐飞虱若虫。

作为优选，所述注射，包括以下步骤：将所述mirna用rnase-freeddh2o稀释成5ng/nl浓度；取3日龄褐飞虱若虫，先用气流量为180～220ml/min的co2对所述褐飞虱若虫麻醉15s，而后在体视显微镜下用显微注射仪从所述褐飞虱若虫腹面中足之间的部位注射所述稀释后的mirna溶液，mirna注射剂量为50～100ng。

在此基础上，本发明进一步提供了上述mirna用于制备褐飞虱防治药物的应用。

作为优选，所述药物的剂型是注射剂。

作为优选，所述药物作用于nlubx基因的3’utr，并且负调控nlubx基因的表达水平。

作为优选，所述药物阻碍褐飞虱由低龄生长至高龄时或羽化时的蜕皮，所述褐飞虱死于不能活动和取食。

本发明提供了一种mirna及其用于杀灭褐飞虱的应用，该技术方案通过实验手段探究了利用基因调控方法抑制褐飞虱生长的可能性，在此基础上筛选得到一种对褐飞虱具有致死效果的mirna，即nlu-mir-9a。克隆了nlu-mir-9a初始转录本，公布了nlu-mir-9a前体和nlu-mir-9a成熟体序列。证明nlu-mir-9a能作用于nlubx基因的3’utr，并且负调控nlubx的表达水平。使褐飞虱由低龄生长至高龄(或羽化)时蜕皮受阻，最终因不能活动和取食而死。基于以上所发现的新性质，可将nlu-mir-9a采用注射方式作用于褐飞虱，从而实现杀灭作用；也可利用其制备褐飞虱防治药物；还可基于该基因构建转基因水稻品系，使其表达nlu-mir-9a前体和nlu-mir-9a成熟体，用于防治褐飞虱的危害。

附图说明

图1是本发明具体实施方式中，nlu-mir-9a最小自由能分析和二级结构预测图；其中a部分为primarynlu-mir-9a；b部分是precursornlu-mir-9a；分析结果来源于rnafoldwebserver。

图2是本发明具体实施方式中，注射mimics和inhibitors对nlu-mir-9a表达水平的影响结果图；图中，a、b部分是注射mimics对长翅品系(a)和短翅品系(b)中nlu-mir-9a表达水平的影响；c、d部分是注射inhibitors对长翅品系(c)和短翅品系(d)中nlu-mir-9a表达水平的影响。

图3是本发明具体实施方式中，注射mimics和inhibitors对nlubx表达水平的影响结果图；图中，a、b部分是注射mimics对长翅品系(a)和短翅品系(b)中nlubx表达水平的影响；c、d部分是注射inhibitors对长翅品系(c)和短翅品系(d)中nlubx表达水平的影响。

图4是本发明具体实施方式中，注射ubx基因对褐飞虱存活率的影响结果图；图中，a部分是长翅品系的存活率；b部分是短翅品系的存活率。

图5是本发明具体实施方式中，双荧光素酶基因报告载体结构图。

图6是本发明具体实施方式中，双荧光素酶基因报告实验结果图；图中，a部分是野生型载体的双荧光素酶报告实验；b部分是突变型1载体的双荧光素酶报告实验；c部分是突变型2载体的双荧光素酶报告实验。

图7是本发明具体实施方式中，褐飞虱3龄若虫注射nlu-mir-9amimics后的存活率实验结果图；图中，a部分是长翅品系的存活率(50ng剂量)；b部分是短翅品系的存活率(50ng剂量)；c部分是长翅品系的存活率(100ng剂量)；d部分是短翅品系的存活率(100ng剂量)。

具体实施方式

以下将对本发明的具体实施方式进行详细描述。为了避免过多不必要的细节，在以下实施例中对属于公知的结构或功能将不进行详细描述。以下实施例中所使用的近似性语言可用于定量表述，表明在不改变基本功能的情况下可允许数量有一定的变动。除有定义外，以下实施例中所用的技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员普遍理解的相同含义。

1、nlu-mir-9a的全长克隆和序列分析

1.1材料与方法

1.1.1mirna提取

参照mirneasyminikit(货号217004，qiagen，德国)提供的试剂和步骤进行。首先供试样品置于液氮预冷的玻璃匀浆器中充分研磨后，加入700μlqiazol试剂裂解组织和细胞。释放出的mirna在一定的盐溶液和ph条件下特异性的结合到吸附柱的硅胶膜介质上，通过洗涤步骤去除dna、蛋白质、盐分等小分子杂质。加入30μlrnase-freeh2o洗脱mirna。

1.1.2mirna的cdna全长克隆

race(rapidamplificationofcdnaends)全长克隆技术以转录本中的一段已知序列为基础获得该转录本完整的5’端和3’端序列。race反应参照smarterrace5’/3’kit(货号634858，clontech，日本)提供的试剂和步骤进行。分别以1μgmirna为起始模板，以5’-cdsprimera、3’-cdsprimera和oligonucleotide为引物，在反转录酶的作用下分别合成5’-racecdna和3’-racecdna，获得的race-cdna均包含一段已知序列的特异性接头。用ddh2o稀释10倍后待用。

降落pcr：分别以5’-racecdna和3’-racecdna为扩增模板，以5’gsp(genespecialprimer，基因特异性引物)或3’gsp以及剂盒提供的upm(universalprimermix，包含等比例的longprimer和shortprimer)为引物。每个反应配制成50μl反应体系，包含2×pcr预混液25μl，5’-racecdna或3’-racecdna2μl，10×upm5μl，5’gsp或3’gsp2μl(10μm浓度)，ddh2o16μl。反应程序：94℃预变性5min；5个循环(94℃30s，72℃3min)；5个循环(94℃30s，70℃30s，72℃3min)；5个循环(94℃30s，68℃30s，72℃3min)；15个循环(94℃30s，66℃30s，72℃3min)；72℃10min；降至25℃。

巢式pcr：分别以5’降落pcr产物和3’降落pcr产物为扩增模板，以5’ngsp(nestedgenespecialprimer，巢式pcr基因特异性引物)或3’ngsp以及shortprimer为引物。每个反应配制成50μl反应体系，包含2×pcr预混液25μl，5’或3’降落pcr产物2μl，shortprimer2μl(10μm浓度)，5’ngsp或3’ngsp2μl(10μm浓度)，ddh2o19μl。反应程序：94℃预变性5min；35个循环(94℃30s，65℃30s，72℃3min)；72℃10min；降至25℃。

反应完成后将pcr产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。1.2结果与分析

通过race技术，获得nlu-mir-9a初始转录本(primarynlu-mir-9a)全长序列如下：5’-acaugggcauaguccgaaauauuacaguaacauuauuaauaauuauuacuuuauuuguaauuguaucuacuaauaaauaaauauuacaucaauuacaucaauaucaguagcuccauuaauaucugcgauaguagacuuugauaucaucauggcgauggcugaagaaaacgacugaauccuucaaucuucaagaaggugcugacgcuuucuuugguuaucuagcuguaugaacguucgauaucauaaagcuagguuaccgaaguuauuaucagcaucugaucucugcucuacacucacacugcgacucccuucuuucaaucaggccccaccagaggauuuuuauuauuuaauuaccaauuuuguaauuauaacguggaccucacuauaguagaccaguucucaauauuuauauuguaucuugcuuuauucagcaucauuauucaauagcauaauuauucaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa-3’。

nlu-mir-9a初始转录本全长为484nt，包含一段长度为26nt的poly(a)序列，最小自由能为-90.20kcal/mol；precursornlu-mir-9a前体(precursornlu-mir-9a)全长为68nt，最小自由能为-22.90kcal/mol(如图1所示)。nlu-mir-9a成熟体为一段长度22nt的片段，即：5’-ucuuugguuaucuagcuguauga-3’。

2、nlu-mir-9a调控nlubx表达

2.1材料与方法

2.1.1显微注射

nlu-mir-9amimics(模拟物)和inhibitors(抑制剂)的注射剂量分别为100ng和50ng，注射等体积等浓度的non-targetcontrol作为对照，上述这些试剂均由锐博生物科技有限公司合成。将供试药剂用rnase-freeddh2o稀释成5ng/nl浓度。实验前收集孵化时间一致的初孵若虫，待若虫生长至3龄时进行显微注射。注射前用气流量约200ml/min的co2对供试昆虫麻醉15s，在体视显微镜下用nanoliter2010显微注射仪(wpi，美国)进行注射，药剂由褐飞虱腹面中足之间的部位注入(由此位点进行注射所引起的机械损伤最小)。将注射后的褐飞虱暂时转移至洁净的培养皿内进行观察，待其复苏后转移至水稻幼苗上进行观察和统计。注射后1d和3d时取样检测nlu-mir-9a和nlubx的表达量变化。每个处理3次重复，每个重复10只若虫。

2.1.2rna提取

totalrna提取：供试样品置于液氮预冷的玻璃匀浆器中充分研磨后，加入1000μltranszolup试剂裂解组织和细胞，将研磨好的提取液转入rnase-free离心管，室温静置5min。向离心管内加入200μl氯仿，剧烈震荡30s后静置5min。在冷冻离心机中，于4℃12000rpm离心15min，此时溶液分为上层的水相(包含rna)和下层的有机相。将上层水相转移至新的离心管，加入1.5倍体积的无水乙醇，于-20℃冰箱中静置30min。取出后于4℃12000rpm离心30min，保留沉淀并弃尽上清液，加入1000μl75％乙醇(rnase-freeh2o配制)，剧烈震荡30s。于4℃7500rpm离心10min，保留沉淀并弃尽上清液，于超净工作台内干燥5-10min。加入30μlrnase-freeh2o溶解totalrna。

mirna提取：参照mirneasyminikit(货号217004，qiagen，德国)提供的试剂和步骤进行。首先供试样品置于液氮预冷的玻璃匀浆器中充分研磨后，加入700μlqiazol试剂裂解组织和细胞。释放出的mirna在一定的盐溶液和ph条件下特异性的结合到吸附柱的硅胶膜介质上，通过洗涤步骤去除dna、蛋白质、盐分等小分子杂质。加入30μlrnase-freeh2o洗脱mirna。

2.1.3cdna合成

totalrna的complementary(cdna)合成反应参照primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser(货号rr047，takara，日本)提供的试剂和步骤进行。以1μgtotalrna为起始模板，首先在gdnaeraser的作用下去除基因组dna后，以random6mers和oligodtprimer为锚定引物，在反转录酶的作用下合成cdna。反应结束后于85℃加热5s失活反应体系中的酶。将所得cdna用ddh2o稀释后存于-20℃冰箱待用。稀释10倍后用于普通pcr扩增；稀释200倍后用于定量pcr反应。

mirna的cdna合成反应参照miscriptⅱrtkit(货号218160，qiagen，德国)提供的试剂和步骤进行。以1μgmirna为起始模板，选择5×miscripthispecbuffer，使maturemirna在反转录酶的作用下合成一段包含已知接头的cdna。反应结束后于95℃加热5min失活反应体系中的酶。将所得cdna用ddh2o稀释50倍后存于-20℃冰箱待用。

2.1.4荧光定量pcr

mrna的荧光定量pcr反应参照sybrpremixextaqii(货号rr820，takara，日本)提供的试剂和步骤进行。每个反应配制成20μl反应体系，包含2×qpcr预混液10μl，50×roxreferencedyeii0.4μl，稀释200倍后的cdna模板8.8μl，qpcr反应上游引物和下游引物各0.4μl(10μm浓度)。qpcr反应和分析在appliedbiosystemsabi7300荧光定量pcr仪中进行。反应程序：95℃预变性2min；35个循环(94℃10s，60℃31s)。

mirna的荧光定量pcr反应参照miscriptsybrgreenpcrkit(货号218073，qiagen，德国)提供的试剂和步骤进行。每个反应配制成20μl反应体系，包含2×qpcr预混液10μl，稀释50倍后的cdna模板6μl，qpcr反应上游引物2μl(2μm浓度)，10×miscriptuniversalprimer2μl。qpcr反应和分析在appliedbiosystemsabi7300荧光定量pcr仪中进行。反应程序：95℃预变性15min；35个循环(94℃10s，55℃30s，70℃31s)。

根据livak和schmittgen(2001)的方法，qpcr反应均以管家基因nlactin1为内参基因用于计算待测基因的相对表达水平，相对表达量＝2^(ctactin–cttestgene)×100％，其中ct为仪器读取的循环数。

2.2结果与分析

通过合成nlu-mir-9a的mimics(模拟物，用于过表达nlu-mir-9a)和inhibitors(抑制剂，用于降低nlu-mir-9a的转录丰度)对褐飞虱3龄若虫进行显微注射，在活体内验证nlu-mir-9a对nlubx的调控作用。

首先对mimics和inhibitors的作用效果进行评价，qpcr结果表明：在注射后第1天时，长翅品系和短翅品系若虫注射100ngmimics后，nlu-mir-9a的表达水平分别显著上升至对照组的2.165倍和2.599倍；在注射后第3天时，长翅品系和短翅品系若虫注射100ngmimics后，nlu-mir-9a的表达水平分别显著上升至对照组的3.547倍和1.950倍(图2a、b所示)。在注射后第1天时，长翅品系和短翅品系若虫注射50nginhibitors后，nlu-mir-9a的表达水平分别显著下降至对照组的32.47％和47.20％；在注射后第3天时，长翅品系和短翅品系若虫注射50nginhibitors后，nlu-mir-9a的表达水平分别显著下降至对照组的24.64％和46.04％(图2c、d所示)。

在注射后第1天时，长翅品系和短翅品系若虫注射100ngmimics后，nlubx的表达水平分别显著下降至对照组的74.42％和85.65％；在注射后第3天时，长翅品系和短翅品系若虫注射100ngmimics后，nlubx的表达水平分别显著下降至对照组的68.50％和79.60％(图3a、b所示)。在注射后第1天时，长翅品系和短翅品系若虫注射50nginhibitors后，nlubx的表达水平分别显著上升至对照组的1.418倍和1.276倍；在注射后第3天时，长翅品系和短翅品系若虫注射50nginhibitors后，nlubx的表达水平分别显著上升至对照组的1.306倍和1.344倍图3c、d所示)。表明nlu-mir-9a可以通过负调控的方式影响nlubx的表达水平。

3、ubx基因对褐飞虱存活率的影响

3.1材料与方法

3.1.1double-strandedrna(dsrna)合成

用于合成dsrna的模板的制备：pcr扩增用于合成dsrna的模板时，以包褐飞虱cdna为模板，上游和下游扩增引物的5’端均连有t7启动子序列(t7序列：5’-taatacgactcactataggg-3’)。每个pcr反应配制成400μl反应体系，包含2×pcr预混液200μl，质粒模板16μl，目的基因的上游引物和下游引物各16μl(10μm浓度)，ddh2o152μl。反应程序：94℃预变性5min；35个循环(94℃30s，60℃30s，72℃1min)；72℃10min；降至25℃。

dna纯化：将质粒pcr产物用rnase-freeh2o定容至400μl，加入等体积的酚氯仿试剂，剧烈震荡30s，室温静置5min；在冷冻离心机中，于4℃12000rpm离心15min，此时溶液分为上层的水相(包含dna)和下层的有机相。将上清液转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3m乙酸钠，于-20℃冰箱中静置10min。取出后于4℃12000rpm离心30min，保留沉淀弃尽上清液，加入1000μl75％乙醇(rnase-freeh2o配制)，剧烈震荡30s。于4℃7500rpm离心10min，保留沉淀弃尽上清液，于超净工作台内干燥5～10min。加入30μlrnase-freeh2o溶解dna。

dsrna合成：以纯化后的质粒pcr产物为合成模板，在转录酶的作用下合成dsrna。每个dsrna合成反应配制成400μl反应体系：包含5×transcriptionbuffer80μl和t7rnapolymerase8μl(20u/μl)，atp、ctp、gtp、utp(100mm)各8μl，rnaseinhibitor10μl(40u/μl)，合成模板10μg，用rnase-freeh2o定容至400μl。37℃水浴反应4h。

dsrna纯化：将dsrna合成产物用rnase-freeh2o定容至400μl，加入半体积(200μl)的水饱和酚和半体积的氯仿，剧烈震荡30s，室温静置5min。在冷冻离心机中，于4℃12000rpm离心10min，此时溶液分为上层的水相(包含dsrna)和下层的有机相。将上清液转移至新的离心管，加入等体积的氯仿，剧烈震荡30s，室温静置5min。于4℃12000rpm离心10min，将上清液转移至新的离心管，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3m乙酸钠，于-20℃冰箱中静置10min。取出后于4℃12000rpm离心30min，保留沉淀弃尽上清液，加入1000μl75％乙醇，剧烈震荡30s。于4℃7500rpm离心10min，保留沉淀弃尽上清液，于超净工作台内干燥5-10min。加入30μlddh2o溶解dsrna。

3.1.2显微注射

供试dsnlubx的注射剂量为150ng，注射等体积等浓度的dsgfp作为对照。将供试药剂用rnase-freeddh2o稀释成5ng/nl浓度。实验前收集孵化时间一致的初孵若虫，待若虫生长至3龄时进行显微注射。注射前用气流量约200ml/min的co2对供试昆虫麻醉15s，在体视显微镜下用nanoliter2010显微注射仪(wpi，美国)进行注射，药剂由褐飞虱腹面中足之间的部位注入(由此位点进行注射所引起的机械损伤最小)。将注射后的褐飞虱暂时转移至洁净的培养皿内进行观察，待其复苏后转移至水稻幼苗上进行观察和统计。注射后每隔24h统计若虫的存活情况直至羽化为成虫，每个处理3次重复，每个重复50只若虫。

3.2结果与分析

注射150ngdsnlubx导致了极高的死亡率，褐飞虱长翅品系和短翅品系分别仅有5.33％和19.33％的若虫能成功羽化，显著低于对照组(73.33％和88.59％)(如图4所示)。几乎所有的致死情况都源于低龄到高龄(或羽化)时的蜕皮受阻，表现为背部出现一条明显的蜕裂线，但无法成功蜕掉旧皮，最终不能活动和取食而死。

4、双荧光素酶基因报告系统验证nlu-mir-9a对nlubx的负调控作用及结合位点

4.1材料与方法

双荧光素酶报告载体pmir-rb-reportvector主要构成元件如下，该载体能表达ampicillin抗性基因，荧光报告基因为海肾荧光素酶基因(hrluc)，荧光校正基因为萤火虫荧光素酶基因(hluc)，外源片段插入位点包含noti、pmei、xhoi、sgfi等酶切位点(如图5所示)。

4.1.1野生型报告载体构建

nlubx3’utr序列扩增：参照nlubx3’utr的序列，设计构建野生型载体的双酶切反应引物，即：wt-ubx-f5’-gcggctcgaggtggacagctaggtgctc-3’；wt-ubx-r5’-aatgcggccgcgctggtatctgtttttct-3’。其中，ctcgag为xhoi酶切位点序列；gcggccgc为noti酶切位点序列，酶切位点5’方向的序列为保护碱基。

每个降落pcr反应配制成30μl反应体系，包含2×phusionhigh-fidelitypcr预混液(货号f531s，thermofisherscientific，美国)15μl，nlubx3’utr质粒模板1μl(约100ng)，上游引物和下游引物各1μl(10μm)，ddh2o12μl。反应程序：98℃预变性3min。10个循环[98℃10s，65℃30s(每个循环后降低1℃)，72℃1min]；25个循环(98℃10s，60℃30s，72℃1min)；72℃10min；降至25℃。

酶切反应：参照xhoi内切酶(货号1094s，takara，日本)和noti内切酶试剂盒(货号1166s，takara，日本)提供的试剂和方法，对上述pcr产物进行双酶切反应。配制40μl反应体系，包含10×h缓冲液4μl，纯化产物2μg，xhoi内切酶(10u/μl)和noti内切酶(10u/μl)各1μl，用ddh2o定容至40μl。于37℃反应4h。

连接反应：将酶切产物与报告载体进行质粒重组。配制10μl反应体系，包含纯化后的酶切产物150ng，pmir-rb-reportvector50ng，solutioni快速连接液5μl，用ddh2o定容至10μl。于16℃反应30min。获得野生型报告载体。

4.1.2突变型1报告载体构建

参照nlubx3’utr的序列和预测的结合位点，设计构建突变型1载体的双酶切反应引物，用于突变第1个潜在结合位点。由于第1个突变位点靠近插入片段的起始位点，因此可以直接利用mut1-ubx-f与wt-ubx-r配对，以nlubx3’utr质粒为模板进行pcr反应，pcr产物无需拼接，即为所需的突变型1报告载体。mut1-ubx-f5’-gcggctcgaggtggacagctaggtgctccaccaggcgcacggcgaggtggacggtttcactcatagcagacatgcc-3’。其中，ctcgag为xhoi酶切位点序列，酶切位点5’方向的序列为保护碱基。

每个降落pcr反应配制成30μl反应体系，包含2×phusionhigh-fidelitypcr预混液15μl，nlubx3’utr质粒模板1μl(约100ng)，上游引物和下游引物各1μl(10μm)，ddh2o12μl。反应程序：98℃预变性3min。10个循环[98℃10s，65℃30s(每个循环后降低1℃)，72℃1min]；25个循环(98℃10s，60℃30s，72℃1min)；72℃10min；降至25℃。

酶切反应：参照xhoi内切酶(货号1094s，takara，日本)和noti内切酶试剂盒(货号1166s，takara，日本)提供的试剂和方法，对上述pcr产物进行双酶切反应。配制40μl反应体系，包含10×h缓冲液4μl，纯化产物2μg，xhoi内切酶(10u/μl)和noti内切酶(10u/μl)各1μl，用ddh2o定容至40μl。于37℃反应4h。

连接反应：将酶切产物与报告载体进行质粒重组。配制10μl反应体系，包含纯化后的酶切产物150ng，pmir-rb-reportvector50ng，solutioni快速连接液5μl，用ddh2o定容至10μl。于16℃反应30min。获得突变型1报告载体。

4.1.3突变型2报告载体构建

参照nlubx3’utr的序列和预测的结合位点，设计构建突变型2载体的双酶切反应引物，用于突变第2个潜在结合位点。mut2-ubx-f5’-agtcaacaggtttctcaacgactgtcaaaggt-3’；mut2-ubx-r5’-gtcgttgagaaacctgttgactgcgccaactg-3’。突变型2载体的序列扩增需进行分段pcr反应：上游引物(wt-ubx-f)与下游突变引物(mut2-ubx-r)配对；上游突变引物(mut2-ubx-f)与下游引物(wt-ubx-r)配对。每个降落pcr反应配制成30μl反应体系，包含2×phusionhigh-fidelitypcr预混液15μl，nlubx3’utr质粒模板1μl(约100ng)，上游引物和下游引物各1μl(10μm)，ddh2o12μl。反应程序：98℃预变性3min。10个循环[98℃10s，65℃30s(每个循环后降低1℃)，72℃1min]；25个循环(98℃10s，60℃30s，72℃1min)；72℃10min；降至25℃。

分段pcr产物拼接：配制成10μl反应体系，包含2×phusionhigh-fidelitypcr预混液5μl，分段pcr产物各1μl，ddh2o3μl。反应程序：98℃预变性3min；8个循环[98℃10s，60℃30s(每个循环后降低1℃)，72℃30s]；10个循环(98℃10s，55℃30s，72℃30s)；72℃5min；降至25℃。

拼接产物pcr反应：配制成30μl反应体系，包含2×phusionhigh-fidelitypcr预混液15μl，上述拼接产物为模板1μl，mut2-ubx-f和mut2-ubx-r为上、下游引物各1μl(10μm)，ddh2o12μl。反应程序：98℃预变性3min；35个循环(98℃10s，60℃30s，72℃1min)；72℃10min；降至25℃。

酶切反应：参照xhoi内切酶(货号1094s，takara，日本)和noti内切酶试剂盒(货号1166s，takara，日本)提供的试剂和方法，对上述pcr产物进行双酶切反应。配制40μl反应体系，包含10×h缓冲液4μl，纯化产物2μg，xhoi内切酶(10u/μl)和noti内切酶(10u/μl)各1μl，用ddh2o定容至40μl。于37℃反应4h。

连接反应：将酶切产物与报告载体进行质粒重组。配制10μl反应体系，包含纯化后的酶切产物150ng，pmir-rb-reportvector50ng，solutioni快速连接液5μl，用ddh2o定容至10μl。于16℃反应30min。获得突变型2报告载体。

4.1.4重组质粒和mimics共转染及荧光值测定

供试293t细胞系于37℃和5％co2条件下进行培养。将处于对数生长期的293t细胞以每孔1.5×10⁴细胞(100μl)转移至96孔细胞培养板，于37℃继续培养24h。取10μlopti-mem培养基(货号31985070，gibco，美国)稀释nlu-mir-9amimics或non-targetcontrol，15μlopti-mem培养基稀释构建好的双荧光素酶基因报告载体，25μlopti-mem培养基稀释0.25μllipofectamine2000试剂(货号11668027，invitrogen，美国)，稀释完成后将三者轻弹混匀后，室温静置20min；每个细胞培养孔吸出50μl培养基，加入上述混合液；6h后加入100μl新鲜培养基。其中，mimics转染浓度为50nm/孔，报告载体转染浓度为250ng/孔。每个处理包含3组生物学重复，每个重复设3个技术重复。

参照dual-gloluciferaseassaysystem(货号e2920，promega，美国)推荐的试剂和方法进行荧光强度检测。检测前，将试剂盒中的luciferase底物与luciferasebuffer混合均匀并分装后于-80℃保存，使用前平衡至室温；将stop&globuffer分装后于-80℃保存，使用前平衡至室温并取适量加入stop&glo底物，现配现用。转染48h后吸出培养基，每孔加入35μlpbs缓冲液和35μlluciferase底物，连续振荡10min；再加入30μlstopreagent，继续振荡10min。反应完成后，利用veritas9100-002荧光照度计测定荧光强度。

4.2结果与分析

首先通过双酶切反应将完整的nlubx3’utr序列连接至海肾荧光素酶基因编码区的下游，构建野生型双荧光素酶融合表达载体。将nlu-mir-9amimics(处理组)和non-targetcontrol(对照组)分别与供试表达载体共转染至人胚肾细胞系(hek293t)中进行培养。以萤火虫荧光素酶基因(hluc)为荧光校正基因，检测海肾荧光素酶基因(hrluc)的表达水平变化。结果表明，当转染mimics时，细胞系表达的荧光强度相比于对照组下降了约40.54％(如图6a所示)，表明nlu-mir-9a可以通过与nlubx3’utr结合而抑制基因上游编码区的表达。

为了进一步确定nlu-mir-9a与nlubx的结合位点，分别对软件预测出的两个潜在结合位点的进行定点突变(ccaaag突变为ggtttc)，构建突变型表达载体。突变第一个结合位点后进行共转染时，细胞系所表达的荧光强度仍然显著下降了16.72％(如图6b所示)；突变第二个结合位点后进行共转染，此时处理组和对照组所产生的荧光强度之间没有显著差异(如图6c所示)，表明第二个结合位点是nlu-mir-9a与nlubx的真实作用位点。

表1mir-9a-5p与nlubx作用位点预测分析

5、nlu-mir-9a对褐飞虱存活率的影响

5.1材料与方法

5.1.1显微注射

nlu-mir-9amimics(模拟物)的注射剂量分别为100ng和50ng，注射等体积等浓度的non-targetcontrol作为对照，上述这些试剂均由锐博生物科技有限公司合成。将供试药剂用rnase-freeddh2o稀释成5ng/nl浓度。

实验前收集孵化时间一致的初孵若虫，待若虫生长至3龄时进行显微注射。注射前用气流量约200ml/min的co2对供试昆虫麻醉15s，在体视显微镜下用nanoliter2010显微注射仪(wpi，美国)进行注射，药剂由褐飞虱腹面中足之间的部位注入(由此位点进行注射所引起的机械损伤最小)。将注射后的褐飞虱暂时转移至洁净的培养皿内进行观察，待其复苏后转移至水稻幼苗上进行观察和统计。注射后每隔24h统计若虫的存活情况直至羽化为成虫，每个处理3次重复，每个重复50只若虫。

5.2结果与分析

注射100ngnlu-mir-9amimics导致了极高的死亡率，长翅品系和短翅品系分别仅有13.33％和14.67％的若虫能成功羽化，显著低于对照组(69.33％和71.33％)(如图7所示)。几乎所有的致死情况都源于低龄到高龄(或羽化)时的蜕皮受阻，表现为背部出现一条明显的蜕裂线，但无法成功蜕掉旧皮，最终不能活动和取食而死。当注射较低剂量(50ng)的mimics时，死亡率约为高剂量(100ng)注射时的一半左右。

以上对本发明的实施例进行了详细说明，但所述内容仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明。凡在本发明的申请范围内所做的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

sequencelisting

<110>江西省农业科学院农业应用微生物研究所（江西省农村能源研究中心）；华中农业大学

<120>一种mirna及其用于杀灭褐飞虱的应用

<160>7

<210>1

<211>484

<212>rna

<213>褐飞虱（nilaparvatalugens）

<400>1

acaugggcauaguccgaaauauuacaguaacauuauuaauaauuauuacuuuauuuguaauuguaucuacuaauaaauaaauauuacaucaauuacaucaauaucaguagcuccauuaauaucugcgauaguagacuuugauaucaucauggcgauggcugaagaaaacgacugaauccuucaaucuucaagaaggugcugacgcuuucuuugguuaucuagcuguaugaacguucgauaucauaaagcuagguuaccgaaguuauuaucagcaucugaucucugcucuacacucacacugcgacucccuucuuucaaucaggccccaccagaggauuuuuauuauuuaauuaccaauuuuguaauuauaacguggaccucacuauaguagaccaguucucaauauuuauauuguaucuugcuuuauucagcaucauuauucaauagcauaauuauucaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

<210>2

<211>20

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>2

taatacgactcactataggg

<210>3

<211>28

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>3

gcggctcgaggtggacagctaggtgctc

<210>4

<211>29

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>4

aatgcggccgcgctggtatctgtttttct

<210>5

<211>76

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>5

gcggctcgaggtggacagctaggtgctccaccaggcgcacggcgaggtggacggtttcactcatagcagacatgcc

<210>6

<211>32

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>6

agtcaacaggtttctcaacgactgtcaaaggt

<210>7

<211>32

<212>dna

<213>人工序列（artificialsequence）

<400>7

gtcgttgagaaacctgttgactgcgccaactg