一种萘醌类化合物CWL-168、制备方法及其用途与流程

本发明涉及化合物领域，尤其涉及一种萘醌类化合物CWL-168、制备方法及其用途。

背景技术：

热休克蛋白90(Heat shock protein 90,HSP90)作为一种细胞内的伴侣蛋白，在许多肿瘤组织中高表达，能辅助HSP90客户蛋白的折叠以维持其构象及生理活性。HSP90的客户蛋白至少有100多种，主要是转录因子和蛋白激酶等，这些客户蛋白很多在肿瘤细胞的生长、增殖中发挥着重要作用，HSP90超伴侣复合物能够与其结合，维持其构象稳定及生物活性，造成细胞代谢障碍或异常分裂增殖，导致恶性肿瘤的形成。HSP90客户蛋白参与了肿瘤细胞中的六大标志性事件：逃避凋亡、自我增殖、侵袭及转移、潜在的无限复制能力、促进新生血管生成及对抗增殖信号的抵抗。针对HSP90的抑制剂重要优势在于通过抑制HSP90的伴侣功能后，可在多种致癌的客户蛋白、多条细胞信号通路中发挥组合作用。HSP90抑制剂并不与致癌客户蛋白本身直接作用，而是抑制维持其活性构象的相关分子伴侣，导致大量致癌蛋白通过泛素-蛋白酶体发生降解，使致癌蛋白介导的信号通路失效。针对HSP90靶点的抑制剂可针对HSP90单一靶位实现对肿瘤信号通路网络的多重阻断，如c-Met、EGFR、ALK等等，从而彻底摧毁肿瘤赖以生存的整个信号通路网络。与传统激酶直接抑制剂相比，抑制HSP90单一靶点能够同时产生多路径抗肿瘤效应的特点，既能单一用药又能减少耐药发生这使HSP90成为备受关注的抗肿瘤分子靶点。

最早被发现的HSP90抑制剂是天然产物格尔德霉素(geklanamycin,GA)和根赤壳菌素，它们常被当做化学工具来研究HSP90生物学功能和HSP90作为治疗靶标的可行性，在HSP90早期研究中发挥了巨大的作用。此外，GA类似物17-AAG是最早进行临床试验的HSP90的抑制剂，目前正在开展Ⅲ期临床试验。实验表明，GA可通过泛素-蛋白酶体途径降解或干扰HSP90客户蛋白。更进一步研究发现，使用生物化学方法和X射线晶体学联合证明GA结合位点在HSP90的N末端ATP口袋。之后，研究发现了结构与GA不同的天然产物HSP90抑制剂根赤壳菌素，也进行了与GA相似的一系列实验研究。经体外筛选多次验证了GA和根赤壳菌素的抗肿瘤活性后，这些化合物及其衍生物在许多动物肿瘤模型中也显示了抗癌活性。随后，GA类似物17-AAG开始进入临床试验，成为第一个真正意义上的HSP90抑制剂药物，现在正在开展Ⅲ期临床试验，在此之后其它HSP90抑制剂也开始纷纷出现。

尽管在临床试验中，GA及其衍生物以及其他一些HSP90抑制剂均表现好很好的抗肿瘤活性，但依然存在高致肝毒性、在溶液中的不稳定性和低口服吸收性的等一系列缺陷和不足。因此寻找结构新颖的HSP90抑制剂作为抗肿瘤候选化合物具有重要的意义。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种萘醌类化合物CWL-168，其具有HSP90抑制剂功能。

为实现上述目的，本发明提供一种一种萘醌类化合物CWL-168,其特征在于，所述萘醌类化合物CWL-168的系统命名为1，2,3,4-四氢-1，2,5-三羟基-6,7-二甲氧基-3-甲基-9,10-蒽酮，结构如下所示：

本发明还提供一种所述萘醌类化合物CWL-168的制备方法，其特征在于，

发酵种子液制备：海水PDA液体培养基中接种菌种培养，优选的，培养条件为28℃下以180pm/min振荡培养2-3天；将该培养物作为种子液；所述菌种为海水PDA培养基接种产黄青霉化nicillium Chrysogenum菌丝体培养所得；优选的，培养的条件为28℃下静置培养4-5天；

所述海水PDA培养基的成分为马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，IL海水；

接种：采用固体发酵方式，准备发酵瓶，加入大米固体发酵培养基，高温灭菌，接种所得种子液，培养；优选的，所述培养的条件为28℃培养箱放置28天；所述大米固体发酵培养基为每1L的三角锥瓶装大米105g，小黄米45g；

萃取；待菌种发酵成熟后，加入己醇溶液浸泡发酵产物，浸泡后，将上层己醇溶液倒出，下层为固体发酵产物；再加入新的己醇溶液，反复此步骤，每次浸泡常温过夜，如此制备得到己醇初提液；以己醇溶液为溶剂，采用高压乳化切割机分散提取下层的固体发酵产物，得到胞内提取物，然后与所得的己醇初提液合并，用旋转蒸发仪浓缩至固态，即得到初级浸膏；

分离；将所得初级浸膏息浮于水中，依次用石油醚、己酸己醋萃取，再将萃取液浓缩后，经娃胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂，从体积比95:5-10:90进行梯度洗脱，其中梯度洗脱下来的组分在薄层层析中能用氯仿-丙酮-冰醋酸体积比为30:10:1溶液系统展开，再经Sephadex LH-20柱子纯化，用氯仿-丙酮体积比为5:2的溶液体系洗脱，洗脱液以15ml为一管，收集20管，挑取其中第9-12管合并，并浓缩至干后得到黄色粉末状化合物CWL-168。所述萃取中的己醇溶液为体积分数为70％的己醇水溶液。

本发明还提供一种所述萘醌类化合物CWL-168具有HSP90抑制剂的用途。

本发明还提供一种所述萘醌类化合物CWL-168具有制备抗癌剂药物的用途。

本发明还提供一种HSP90抑制剂，其特征在于，含有作为活性成分的萘醌类化合物CWL-168。

本发明还提供一种抗癌剂，其特征在于，含有作为活性成分的萘醌类化合物CWL-168。

实验证明，本发明的萘醌类化合物CWL-168能有效抑制HSP90活性，可作为抗肿瘤药物及其前体药物进行开发，可以是药物上可接收的任意一种剂型。

附图说明

图1是实施例2萘醌类化合物CWL-168抑制HSP90活性实验结果图。

图2是实施例3萘醌类化合物CWL-168特异性诱导肺癌细胞H1299凋亡实验结果图。

具体实施方式

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例1：萘醌类化合物CWL-168的制备

菌种的准备；使用海水PDA培养基，高温灭菌，制成平板，置于常温状态下，接种产黄青霉化nicillium Chrysogenum菌丝体(中国海洋微生物菌种保藏管理中心，MCCC3A00005)培养，作为菌种；所述海水PDA培养基成分为马铃墓200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，IL海水；

发酵种子液制备：在多个锥形瓶中分别装入海水PDA液体培养基，高温灭菌后，接种上述菌种培养，将该培养物作为种子液；

接种：采用固体发酵方式，准备发酵瓶，加入大米固体发酵培养基，高温灭菌，接种上述种子液，培养；所述大米固体发酵培养基为每1L的三角锥瓶装大米105g，小黄米45g；

萃取：待真菌发酵成熟后，加入己醇溶液500mL/瓶浸泡发酵产物，发酵产物溶入己醇溶液中，浸泡后，将上层己醇溶液倒出，下层为固体发酵产物；加入新的己醇溶液5OOmL/瓶，此步骤反复3次，每次浸泡常温过夜，如此制备得到己醇初提液；以己醇溶液为溶剂，采用高压乳化切割机分散提取下层的固体发酵产物，得到胞内提取物，然后与所得的己醇初提液合并，用旋转蒸发仪浓缩至固态，即得到初级浸膏；

分离；将所得初级浸膏息浮于水中，依次用石油醚、己酸己醋萃取，再将萃取液浓缩后，经硅胶柱层析，以氯仿-甲醇为洗脱剂，从体积比95:5-10:90进行梯度洗脱，其中梯度洗脱下来的组分在薄层层析中能用氯仿-丙酮-冰醋酸体积比为30:10:1溶液系统展开，再经Sephadex LH-20柱子纯化，用氯仿-丙酮体积比为5:2的溶液体系洗脱，洗脱液以15ml为一管，收集20管，挑取其中第9-12管合并，并浓缩至干后得到黄色粉末状化合物CWL-168。

所述萃取中的己醇溶液为体积分数为70％的己醇水溶液。

所述菌种的准备中，培养条件为28℃下静置培养4-5天。

所述发酵种子液制备步骤中培养条件为28℃下以180pm/min振荡培养2-3天。所述接种步骤中培养条件为28℃培养箱放置28天。

所述的萘醌类化合物CWL-168具有很好的HSP90抑制活性。进一步发现萘醌类化合物CWL-168具有很好的抗肿瘤活性。所述的肿瘤为人人肺癌、膀胱癌等。

本发明的发明人对所得到的新的化合物进行结构分析鉴定，其结构式如下，分子式为C17H18O7，系统命名为1，2,3,4-四氢-1，2,5-三羟基-6,7-二甲氧基-3-甲基-9,10-蒽酮。

实施例2：萘醌类化合物CWL-168抑制HSP90活性实验

用3μM的萘醌类化合物CWL-168处理肺癌H2228细胞12小时与24小时，收取样品，裂解，Western-blot分析ALK本底及磷酸化水平以及信号通路下游的AKT、ERK1/2本底和磷酸化水平的影响，结果见图1。从图1可以看出：CWL-168能强烈诱导H1299的ALK、p-ALK、AKT、p-AKT、p-ERK下调。萘醌类化合物CWL-168对HSP90的客户蛋白ALK、AKT具有明显的抑制，说明萘醌类化合物CWL-168能有效抑制HSP90活性。

实施例3：萘醌类化合物CWL-168特异性诱导肺癌细胞H1299凋亡实验

碧云天Caspase 3活性检测试剂盒(Caspase 3Activity Assay Kit)，货号C1115。

采用分光光度法检测细胞或组织裂解液中caspase 3酶活性或纯化的caspase 3酶活性的试剂盒。

Caspase(Cysteine-requiring Aspartate Protease)是一个在细胞凋亡过程中起重要作用的蛋白酶家族。Caspase 3也称CPP32、Yama或apopain，有时被写作caspase-3或caspase3，属于caspase家族的CED-3亚家族(CED-3subfamily)，是细胞凋亡过程中的一个关键酶。Caspase 3是哺乳动物细胞中研究最多的一个caspase。Caspase 3可以剪切procaspase 3、6、7和9，并可以直接特异性剪切许多caspase底物，包括PARP(poly(ADP-ribose)polymerase)，ICAD(Inhibitor of caspase-activated deoxyribonuclease)，gelsolin和fodrin等。这些由caspase 3介导的蛋白剪切是细胞凋亡分子机制的重要组成部分。另外，caspase 3在细胞核凋亡过程中也起到了关键作用，包括染色质固缩(chromatincondensention)，DNA片段化(DNA fragmentation)等。同时caspase 3对细胞起泡(cell blebbing)也起到关键作用。

本Caspase 3活性检测试剂盒是基于caspase 3可以催化底物Ac-DEVD-pNA(acetyl-Asp-Glu-Val-Asp p-nitroanilide)产生黄色的pNA(p-nitroaniline)，从而可以通过测定吸光度来检测caspase 3的活性。pNA在405nm附近有强吸收。

试剂盒中提供了caspase 3催化产生的黄色产物pNA，可以作为定量caspase 3酶活性的标准品，反应细胞凋亡的情况。萘醌类化合物CWL-168特异性诱导肺癌细胞H1299凋亡实验实验结果见图2，其中H1299为非小细胞肺癌细胞，WI-38-Fluc-DEVD表示正常细胞，NS表示无显著差异，“-”表示没有萘醌类化合物CWL-168，“+”表示有萘醌类化合物CWL-168正确。从图2的结果可以看出，萘醌类化合物CWL-168特异性诱导肺癌细胞H1299凋亡而对正常肺细胞影响不大。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。