基于微孔阵列芯片的数字PCR扩增装置和利用其进行扩增的方法与流程

基于微孔阵列芯片的数字pcr扩增装置和利用其进行扩增的方法
技术领域
[0001]
本发明属于核酸检测领域，尤其涉及一种基于微孔阵列芯片的数字pcr检测方法。


背景技术：

[0002]
现代生物学研究，特别是医学研究时常涉及对核酸定量分析的需求。比如检测血液中某些游离dna及其含量，可以指导某些癌症的临床诊断，以及监控癌症的治疗效果。以往的定量主要采取荧光定量pcr进行相对定量，即选取一个表达稳定的基因的转录物作为参照，来评判目的核酸的量的高低。但这种方法易受非目的核酸分子(背景噪音)的干扰，只适用于定性或者低精度检测，无法满足某些含量特别稀少的目标核酸分子的检测。
[0003]
数字pcr(dpcr)则能通过大规模的平行pcr扩增，将微弱的扩增信号从背景噪音中提炼出来，以“终点信号的有或无”来统计被扩增的分子的个数。到目前为止，已经发展出了各式各样的dpcr装置，主要有孔板式和液滴式。
[0004]
孔板式dpcr就是在足够数量的同尺寸微孔阵列排布的平板上离散化核酸分子，实现数字化扩增。例如：thermofisher公司推出的quantstudiotm 3d dpcr系统就是采用这种方式。它在一块10mm边长正方形平板上蚀刻出高达20000个六角形微孔，每个微孔容积0.8nl，实现微孔间隔离，通过简单涂刷上样，每个微孔有1个左右的目标核酸分子；pcr后就可检测孔中荧光信号，通过泊松分布计算目标分子的个数。
[0005]
液滴式dpcr则是通过数以万计的单分散性小液滴来分割样本，液滴借助疏水的管道和油相液体，把dna分散与各个油包水小液滴，一个液滴理论上只含有一个左右的dna分子；dna扩增后可以转移到荧光检测装置进行最终检测。该方法的缺点是液滴容易在pcr过程或者转移过程中出现液滴相互汇合的情况，导致结果不准确。
[0006]
以上各种dpcr的技术都采用荧光信号来读取结果，这就要求配套装置中含有昂贵的荧光激发装置和耗材、荧光高分辨率检测装置。另外，光信号的相互污染也会增加判断结果难度。
[0007]
因此，目前现有的pcr扩增装置仍有待进一步改进。


技术实现要素：

[0008]
本发明旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明的一个目的在于提出一种基于微孔阵列芯片的数字pcr扩增装置和利用其进行扩增的方法。该数字pcr扩增装置具有检测灵敏度高、准确度高和成本低的优点。
[0009]
为此，根据本发明的一个方面，本发明提出了一种基于微孔阵列芯片的数字pcr扩增装置，根据本发明的实施例，该数字pcr扩增装置包括：微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片包括：
[0010]
底板，所述底板上形成有微孔阵列；
[0011]
密封盖，所述密封盖置于所述底板上方，用于密封所述微孔阵列中的每个微孔；
[0012]
多个生化传感器，所述微孔阵列中每个微孔内均设置有一个所述生化传感器，所述生化传感器表面上设置有捕获探针，所述捕获探针适于捕获所在微孔内的目标核酸并产生电信号；
[0013]
电极，所述电极适于向所述微孔内的溶液提供电压。
[0014]
由此，本发明上述实施例的数字pcr扩增装置的生化传感器通过其表面设置的捕获探针来捕获扩增后的目标核酸分子，通过检测核酸分子的固有负电荷的电子检测方式，来代替荧光检测的传统方式。本申请的上述装置可以显著降低系统的复杂度、体积和价格。另外，本发明可大幅降低微孔体积(可降至1fl～10pl)，从而显著降低最低试剂的使用量和耗材价格。
[0015]
另外，根据本发明上述实施例的基于微孔阵列芯片的数字pcr扩增装置还可以具有如下附加的技术特征：
[0016]
在本发明的一些实施例中，所述电极包括片上电极、溶液电极和外接电极中的至少一种，其中，所述片上电极或所述溶液电极设置在所述底板上。
[0017]
在本发明的一些实施例中，所述生化传感器为离子敏感场效应晶体管，碳纳米管，硅纳米线、石墨烯或二硫化钼晶体管传感器中的一种，或微型电化学传感器。
[0018]
在本发明的一些实施例中，所述生化传感器表面设有钝化层，所述钝化层形成在所述微孔的内壁上，所述捕获探针设置在所述钝化层的表面上。
[0019]
在本发明的一些实施例中，所述钝化层为金、三氧化二铝、二氧化铪、二氧化钛、五氧化二钽、二氧化硅、碳化硅的一种或多种的叠加。
[0020]
在本发明的一些实施例中，每个所述生化传感器表面上设置有1-100万个所述捕获探针。
[0021]
在本发明的一些实施例中，还包括：读取装置，所述读取装置与计算机电气连接，以便实现所述微孔阵列芯片pcr扩增前及pcr扩增后微孔内生化传感器电信号的读取。
[0022]
在本发明的一些实施例中，所述读取装置包括：
[0023]
底座，所述底座的上表面上形成有用于容纳所述微孔阵列芯片的凹槽，所述凹槽的底壁内设置有金属探针，所述金属探针适于与所述微孔阵列芯片的引脚pad形成电气连接，从而实现对微孔阵列芯片的供电及生化传感器电信号的数据读取；
[0024]
电路板，所述电路板设置在所述底座的下表面上，所述电路板包括依次相连的数据采集模块、adc芯片和处理器，其中，
[0025]
所述数据采集模块与所述金属探针相连，且适于采集所述生化传感器的电信号；
[0026]
所述电信号被输送至所述adc芯片，并由所述adc芯片进行模数转换；
[0027]
经过所述模数转换的电信号被输送给所述处理器，由所述处理器进行数字信号处理并计算出扩增后dna的浓度；
[0028]
上盖，所述上盖的一侧边缘铰接在所述底座的边缘处，用于封盖所述底座。
[0029]
在本发明的一些实施例中，所述读取装置包括：
[0030]
插卡电路板，所述插卡电路板包括用于容纳微孔阵列芯片的容纳仓、置于容纳仓仓口的压盖、用于放大所述微孔阵列芯片上所述生化传感器信号的信号放大器芯片以及插头；
[0031]
数据处理电路板，所述数据处理电路板包括插槽、adc模数转换芯片、微处理器mcu
和通信端口，所述插槽与所述插头相配，通过所述插头与所述插槽的连接实现所述插卡电路板与所述数据处理电路板的通信，所述adc模数转换芯片分别于所述信号放大器芯片和所述微处理器mcu相连，所述微处理器mcu通过通信端口和终端设备相连。
[0032]
在本发明的一些实施例中，进一步包括：
[0033]
热循环器，所述热循环器包括端盖和基座，所述端盖活动安装在所述基座的顶部；所述基座包括用于容纳所述微孔阵列芯片的放置腔、紧挨所述放置腔底部设置的导热块、设置在所述导热块上端部紧挨所述放置腔位置处的温度传感器、置于所述导热块底部的加热器、以及置于所述加热器底部的散热器；所述导热块两侧通过限位板固定在所述基座内，所述加热器通过定位板固定在所述导热块的底部，所述温度传感器和所述加热器通过控制电路与主控板相连。
[0034]
根据本发明的第二方面，本发明还提出了利用前面实施例的所述数字pcr扩增装置进行扩增的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：
[0035]
(1)将dna反应体系滴加到所述微孔阵列芯片中的每个微孔内，并用所述密封盖密封；
[0036]
(2)将加样后的所述微孔阵列芯片放入读写装置中，读出所述微孔阵列芯片的初始电信号；
[0037]
(3)将所述微孔阵列芯片置于热循环器上进行pcr扩增反应；
[0038]
(4)将所述pcr扩增反应后的微孔阵列芯片置于读取装置内，利用所述读取装置读取所述微孔底部生化传感器的目标电信号；
[0039]
(5)通过数据处理后获得dna样本的初始浓度，并显示在终端设备上。
[0040]
根据本发明的第三方面，本发明还提出了利用前面实施例的所述数字pcr扩增装置进行扩增的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：
[0041]
(1)将所述微孔阵列芯片放入读写装置中，再加入标准液到微孔后，读出所述微孔阵列芯片的初始电信号；
[0042]
(2)取出所述微孔阵列芯片并去掉所述标准液后，将dna反应体系滴加到所述微孔阵列中的每个所述微孔内，并用所述密封盖密封；
[0043]
(3)将加样后的所述微孔阵列芯片置于热循环器上进行pcr扩增反应；
[0044]
(4)将所述pcr扩增反应后的微孔阵列芯片清洗后，置于读取装置内，再加入所述标准液到微孔后，读出微孔阵列芯片的目标电信号；
[0045]
(5)通过数据处理后获得所述dna样本的初始浓度，并显示在终端设备上。
[0046]
在本发明的一些实施例中，上述步骤(5)按照下列步骤进行：
[0047]
(5-1)直方图分析：对于每一个生化传感器，用所述目标电信号减去所述初始电信号获得每个所述微孔内的pcr扩增反应前后的所述dna电荷的差值电信号，再对所述差值电信号的数据进行所述直方图histogram分析，从而获得所述差值电信号的分布峰：
[0048]
若某个所述微孔中没有发生pcr扩增反应，则所述生化传感器的捕获探针未捕获到目标核酸，则所述微孔内所述生化传感器在pcr扩增反应前后的所述差值电信号的值为0，未发生pcr扩增反应的微孔为阴性反应单元；
[0049]
若所述微孔中发生了单个dna样本扩增反应，则所述生化传感器的捕获探针捕获到所述目标核酸，则所述微孔内所述生化传感器在所述pcr扩增反应前后的差值电信号的
值为第一电信号，发生单个所述dna样本扩增反应的微孔为阳性反应单元；
[0050]
若所述微孔内的所述生化传感器输出值的绝对值大于所述第一电信号值的绝对值，则此微孔内为多个所述dna样本发生所述pcr扩增反应；
[0051]
(5-2)所述dna样本初始浓度的计算：由步骤(5-1)获得的所述阳性反应单元个数或所述阴性反应单元个数计算所述dna样本的初始浓度。
[0052]
在本发明的一些实施例中，上述步骤(5-2)按照下列步骤进行：
[0053]
绘制标准曲线：根据各组所述dna样本的浓度和对应的所述阳性反应单元个数n绘制标准曲线c＝f(n)；
[0054]
数据计算：将待测浓度的所述dna样本进行所述pcr扩增反应后，首先根据步骤(5-1)计算所述微孔阵列芯片上所有的所述阳性反应单元数量，然后根据预先绘制的标准曲线计算得到所述dna样本的初始浓度。
[0055]
在本发明的一些实施例中，上述步骤(5-2)按照下列步骤进行：
[0056]
将所述直方图分析获得的所述阳性反应单元个数或所述阴性反应单元个数带入泊松方程计算所述dna样本的初始浓度。
附图说明
[0057]
图1是本发明实施例的微孔阵列芯片本体结构示意图；
[0058]
图2中的(a)本发明实施例的芯片座式读取装置的结构示意图(关闭状态立体图)；
[0059]
图2中的(b)本发明实施例的芯片座式读取装置的结构示意图(关闭状态俯视图)；
[0060]
图2中的(c)本发明实施例的芯片座式读取装置的结构示意图(关闭状态主视图)；
[0061]
图2中的(d)本发明实施例的芯片座式读取装置的结构示意图(打开状态侧视图)；
[0062]
图2中的(e)本发明实施例的芯片座式读取装置的结构示意图(打开状态立体图)；
[0063]
图2中的(f)是图2中的(c)中沿a-a沿剖视图；
[0064]
图2中的(g)图2中的(f)中部分放大示意图；
[0065]
图3本发明实施例的芯片座式读取装置组成框图；
[0066]
图4中的(a)本发明实施例的插卡式读取装置的总体结构示意图；
[0067]
图4中的(b)本发明实施例的插卡式读取装置中插卡电路板的结构示意图；
[0068]
图5本发明实施例的插卡式读取装置的组成框图；
[0069]
图6本发明实施例的热循环器结构示意图；
[0070]
图7本发明实施例的热循环器立体示意图；
[0071]
图8本发明实施例中方法(一)的半导体芯片微孔pcr示意图；
[0072]
图9本发明实施例中方法(二)的半导体芯片微孔pcr示意图；
[0073]
图10中的(a)本发明实施例1的pcr仪适配器示意图；
[0074]
图10中的(b)为图10中的(a)的pcr仪适配器的截面示意图；
[0075]
图10中的(c)为图10中的(b)的pcr仪适配器的局部放大示意图；
[0076]
图11本发明之实施例1的示范数据数字二维热力图；
[0077]
图12本发明实施例1的dna探针连接前后(即表面化学前后)的电信号变化(i/v曲线)；
[0078]
图13本发明实施例1的pcr扩增前后传感器信号变化的直方图；
[0079]
图14本发明实施例1的阳性单元pcr前后的电信号变化(i/v曲线)图；
[0080]
图15本发明实施例1的阳性单元数量与dna浓度标准曲线图。
具体实施方式
[0081]
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
[0082]
根据本发明的一个方面，本发明提出了基于微孔阵列芯片的数字pcr扩增装置。
[0083]
下面参考附图对本发明实施例的基于微孔阵列芯片的数字pcr扩增装置进行详细描述：
[0084]
如图1、图8和图9所示，该数字pcr扩增装置包括：微孔阵列芯片，所述微孔阵列芯片包括：
[0085]
底板110，所述底板110上形成有微孔阵列111；密封盖120，所述密封盖120置于所述底板110上方，用于密封所述微孔阵列111中的每个微孔112；多个生化传感器，所述微孔阵列111中每个微孔112内均设置有一个所述生化传感器，所述生化传感器表面上设置有捕获探针131，所述捕获探针适于捕获所在微孔内的目标核酸；电极，所述电极适于向所述微孔内的溶液提供电压。
[0086]
由此，本发明上述实施例的数字pcr扩增装置的生化传感器通过其表面设置捕获探针来捕获扩增后的目标核酸分子，通过检测核酸分子的固有负电荷的电子检测方式，来代替荧光检测的传统方式。本申请的上述装置可以显著降低系统的复杂度、体积和价格。另外，本发明可大幅降低微孔体积(可降至1fl～10pl)，从而显著降低最低试剂的使用量和耗材价格。
[0087]
根据本发明的实施例，参照图9，电极包括片上电极141、溶液电极142和外接电极143中的至少一种，其中，片上电极141或溶液电极142设置在底板110上。由此，可以通过多种形式为微孔中的溶液提供电压。
[0088]
根据本发明的实施例，所述微孔阵列111中含有0.1万～1000万个微孔112，每个微孔112的容积为1fl～10pl，在微孔112内加入dna样本及扩增液后，使用密封盖120进行压紧密封，使得不同微孔112中的液体被相互隔离，且每个微孔112内有一个的目标核酸分子，由此实现dna样本的单分子pcr扩增。
[0089]
根据本发明的实施例，每个所述生化传感器表面上设置有1个-100万个所述捕获探针。由此，捕获探针的分布密度较大，可以捕获较多的目标核酸，进而产生更大的电信号。根据本发明的实施例，所述生化传感器可以为离子敏感场效应晶体管(isfet)，纳米线、石墨烯或二硫化钼晶体管传感器中的一种，或微型电化学传感器。具体地，生化传感器采样新型的纳米线作为沟道的场效应晶体管nanowire fet或者石墨烯或二硫化钼等二维半导体材料为沟道的fet，相比isfet，这些纳米晶体管传感器能提供更高的灵敏度，从而提供更小的反应腔体，更高的集成度和准确性；微型电化学传感器可以大大降低扩增装置的生产成本。
[0090]
根据本发明的实施例，参照图9，离子敏感场效应晶体管(isfet)包括金属浮栅结构132、沟道133、源极134、漏极135和硅衬底136。由此，采用cmos工艺制作isfet，可以在微
小的芯片上集成大量的生化传感器，大幅提高微孔的数量，从而提高扩增数量、检测灵敏度、准确度和动态范围。
[0091]
根据本发明的实施例，参照图8和图9，生化传感器表面设有钝化层150，所述钝化层150形成在微孔112的内壁上，捕获探针131连接到钝化层的表面上。根据生化传感器的表面积大小，可以设置最少1个捕获探针，最多100万个捕获探针，比如纳米线可以涂一个到几十个捕获探针；如果是比较大的表面积，比如微孔面积2个微米，可以涂成千上万个捕获探针。
[0092]
其中，捕获探针131连接到钝化层的表面上的方法可以采用表面化学的方法将捕获探针连接到钝化层的表面上，具体的：在一些实施例中，直接将巯基dna探针直接通过巯基固载到钝化层表面；在另一些实施例中，通过在dna上连接biotin(生物素)，由biotin再连接到钝化层上镀有avidin(亲和素)的材料上，也能形成捕获探针牢固地形成在钝化层表面上；在又一些实施例中，在dna的一端接上胺基，再通过胺基和微孔阵列芯片上涂有醛基的单分子结合，从而固载到钝化层表面。
[0093]
由此，钝化层不仅可以防止微孔中的溶液与生化传感器等其他结构接触，保证测试的准确性以及防止生化传感器中的金属材料面受溶液的腐蚀；而且，钝化层还可用于承载捕获探针。
[0094]
其中，所述钝化层150为金、三氧化二铝、二氧化铪、二氧化钛、五氧化二钽、二氧化硅、碳化硅的一种或多种的叠加。由此，钝化层不会与溶液反应。
[0095]
另外，本发明上述实施例的数字pcr扩增装置还包括：读取装置，所述读取装置与计算机电气连接，以便实现微孔阵列芯片pcr扩增前及pcr扩增后微孔内生化传感器电信号的读取。
[0096]
其中，作为一种优选的技术方案，如图2和图3所示，所述读取装置可以为一种基于芯片座的芯片座式读取装置200，芯片座式读取装置200具体包括：底座210、电路板220和上盖230。电路板220设置在底座210的下表面上，上盖的一侧边缘铰接在底座的边缘处，用于封盖所述底座。
[0097]
具体地：底座210的上表面上形成有用于容纳所述微孔阵列芯片100的凹槽211，所述凹槽211的底壁内设置有金属探针212，所述金属探针212适于与所述微孔阵列芯片的引脚pad形成电气连接，从而实现对微孔阵列芯片100的供电及生化传感器130电信号的数据读取；
[0098]
电路板220，所述电路板220包括依次相连的数据采集模块、adc芯片和处理器(未示出)，其中，所述数据采集模块与所述金属探针相连，且适于采集所述生化传感器的电信号；所述电信号被输送至所述adc芯片，并由所述adc芯片进行模数转换；经过所述模数转换的电信号被输送给所述处理器，由所述处理器进行数字信号处理并计算出扩增后dna的浓度。
[0099]
根据本发明的具体实施例，上述电路板220具有的处理器可以为fpga、dsp、或arm。
[0100]
作为另外一种技术方案，如图4中的(a)-图4中的(b)和图5所示，所述读取装置可以是基于插卡式芯片pcb电路板的插卡式读取装置300，具体包括插卡电路板310和数据处理电路板320。
[0101]
具体地，插卡电路板310包括用于容纳微孔阵列芯片的容纳仓311、置于容纳仓仓
口的压盖312、用于放大所述微孔阵列芯片100上所述生化传感器130信号的信号放大器芯片313以及插头314。
[0102]
使用时，生化传感器130的管脚焊接在插卡电路板310上，实现对生化传感器130的电路连接，所述信号放大器芯片313将生化传感器130输出的电信号进行放大处理，提高信号噪声比后传输给数据处理电路板320的adc模数转换芯片322；
[0103]
具体地，数据处理电路板320包括插槽321、adc模数转换芯片322、微处理器mcu323和通信端口，所述插槽321与所述插头314相配，通过所述插头314与所述插槽321的连接实现插卡电路板310与数据处理电路板320的通信，所述adc模数转换芯片322分别于所述信号放大器芯片313和微处理器mcu323相连，所述微处理器mcu323通过通信端口和终端设备相连。具体地，通信端口可以包括图4中的(b)所示的usb端口324、串行端口325或并行端口326。终端设备可以是电脑，也可以是智能手机。
[0104]
使用时，只需将插卡电路板310的插头314插入数据处理电路板320的插槽321中，即可实现插卡电路板310和数据处理电路板320的通信连接，进而通过数据处理电路板对接收到生化传感器130上的信号进行数据处理，获得并计算出扩增后dna的浓度。
[0105]
如图6和图7所示，根据本发明的实施例，本发明上述实施例的数字pcr扩增装置还可以进一步包括：热循环器400。由此可以将微孔阵列芯片100置于热循环器400上进行扩增反应。
[0106]
具体地，热循环器400包括端盖410和基座，所述端盖410活动安装在所述基座的顶部；所述基座包括用于容纳微孔阵列芯片本体100的放置腔420、紧挨所述放置腔420底部设置的导热块430、设置在所述导热块430上端部紧挨放置腔420位置处的温度传感器440、置于所述导热块430底部的加热器450、以及置于所述加热器450底部的散热器460；所述导热块430两侧通过限位板470固定在所述基座内，所述加热器450通过定位板480固定在所述导热块430的底部，所述温度传感器440和所述加热器450通过控制电路与主控板490相连。
[0107]
使用时，由主控板490根据pcr扩增反应的需要设置放置腔420内的温度，温度传感器440用于监测放置腔420内的温度传输给主控板490，由主控板490根据放置腔420内的实际温度向加热器450发送加热或停止加热的命令；其中加热器450可以是半导体加热器也可以是热电阻。
[0108]
根据本发明的第二方面，本发明还提出了利用前面实施例的所述数字pcr扩增装置进行扩增的方法，根据本发明的实施例，该方法(一)包括：
[0109]
(1)将dna反应体系滴加到所述微孔阵列芯片中的每个微孔内，并用所述密封盖密封；
[0110]
(2)将加样后的所述微孔阵列芯片放入读写装置中，读出所述微孔阵列芯片的初始电信号；
[0111]
(3)将加样后的所述微孔阵列芯片置于热循环器上进行pcr扩增反应；
[0112]
(4)将pcr扩增反应后的微孔阵列芯片置于读取装置内，利用所述读取装置读取所述微孔底部生化传感器的目标电信号；
[0113]
(5)通过数据处理后获得dna样本的初始浓度，并显示在终端设备上。下面对本发明具体实施例的扩增方法(一)进行详细描述：
[0114]
根据本发明的具体实施例，上述步骤(1)加样，具体包括：将目标dna片段3根据其
原有样本中的浓度情况稀释或者浓缩一定比例后，与含有引物5对及扩增酶4的缓冲液混合均匀后加入到微孔阵列芯片上的微孔112中，用密封盖120压紧密封，每个微孔112形成相互隔离的pcr反应单元，如图8所示。
[0115]
步骤(3)扩增，具体包括：步骤(1)加样后的微孔阵列芯片100可以进行恒温pcr和变温pcr扩增反应，如将微孔阵列芯片100置于变温pcr仪或热循环器400上可实现变温pcr扩增反应，将微孔阵列芯片100置于恒温pcr仪或恒温台上即可实现恒温pcr扩增反应；将密封好的微孔阵列芯片100置于pcr仪或热循环器内进行pcr扩增反应；每个微孔112中的目标dna片段3在引物对5和扩增酶4的作用下进行链式pcr扩增反应，拷贝数持续增加，并不断地被捕获探针识别捕获，并同时释放电信号。
[0116]
其中，pcr仪为平板pcr或者配合使用pcr适配器在传统pcr仪进行扩增，如96孔板。
[0117]
步骤(4)信号读取，具体包括：将pcr扩增反应后的微孔阵列芯片本体置于读取装置的凹槽内，读取微孔底部生化传感器的电信号、通过数据处理后获得扩增后dna的浓度在计算机或显示屏上显示。具体为，首先将上盖打开，将pcr扩增反应后的密封状态的微孔阵列芯片本体放入底座上的凹槽中，盖上上盖，使得密封盖压紧微孔；微孔阵列芯片本体底部生化传感器的引脚pad与底座内的探针形成电气连接，再将探针连接到电路板中，从而对微孔阵列芯片本体进行供电；然后数据采集模块采集微孔底部生化传感器的电信号，由adc芯片进行模数转换后发生给fpga、dsp、arm等处理器处理进行数字信号计算处理，然后将计算获得dna样本的初始浓度发送给显示屏显示。
[0118]
根据本发明的具体实施例，上述步骤(5)按照下列步骤进行：
[0119]
(5-1)直方图分析：对于每一个生化传感器，用所述目标电信号减去所述初始电信号获得每个所述微孔内的pcr扩增反应前后的所述dna电荷的差值电信号，再对所述差值电信号的数据进行直方图histogram分析，从而获得差值电信号的分布峰：若某个微孔中没有发生pcr扩增反应，则所述生化传感器的捕获探针未捕获到目标核酸，则所述微孔内所述生化传感器在pcr扩增反应前后的差值电信号的值为0，未发生pcr扩增反应的微孔为阴性反应单元；若微孔中发生了单个dna样本扩增反应，则所述生化传感器的捕获探针捕获到目标核酸，则所述微孔内所述生化传感器在pcr扩增前后的差值电信号的值为第一电信号值，发生单个dna样本pcr扩增反应的微孔为阳性反应单元；若微孔内的生化传感器输出值的绝对值大于所述第一电信号值的绝对值，则此微孔内为多个dna样本发生pcr扩增反应；
[0120]
(5-2)dna样本初始浓度的计算：由步骤(5-1)获得的阳性反应单元个数或阴性反应单元个数计算dna样本的初始浓度。
[0121]
根据本发明的具体实施例，上述步骤(5-2)按照下列步骤进行：
[0122]
绘制标准曲线：根据各组dna样本的浓度和对应的阳性反应单元个数n绘制标准曲线c＝f(n)；
[0123]
数据计算：将待测浓度的dna样本进行pcr扩增反应后，首先根据步骤(5-1)计算微孔阵列芯片上所有的阳性反应单元数量，然后根据预先绘制的标准曲线计算得到dna样本的初始浓度。
[0124]
根据本发明的具体实施例，上述步骤(5-2)还可以按照下列步骤进行：
[0125]
将直方图分析获得的阳性反应单元个数或阴性反应单元个数带入泊松方程计算dna样本的初始浓度。
[0126]
根据本发明的第三方面，本发明还提出了利用前面实施例的所述数字pcr扩增装置进行扩增的方法，根据本发明的实施例，参照图9，该方法(二)包括：
[0127]
(1)将所述微孔阵列芯片放入读写装置中，再加入标准液6到微孔后，读出微孔阵列芯片的初始电信号；
[0128]
(2)取出所述微孔阵列芯片并去掉标准液6后，将dna反应体系滴加到所述微孔阵列中的每个微孔内，并用所述密封盖密封；
[0129]
(3)将加样后的所述微孔阵列芯片置于热循环器上进行pcr扩增反应，得到pcr扩增反应后dna 7，参照图9；
[0130]
(4)将所述pcr扩增反应后的微孔阵列芯片清洗后，置于读取装置内，再加入标准液6到微孔后，读出微孔阵列芯片的目标电信号；
[0131]
(5)通过数据处理后获得所述dna样本的初始浓度，并显示在终端设备上。
[0132]
其中，该方法(二)中的步骤(5)与前面所述方法(一)中的步骤(5)的操作分析步骤一致，在此不再过多的赘述。
[0133]
实施例
[0134]
为了更好的说明本发明提供的扩增装置的使用方法，现以cmos isfet作为生化传感器的微孔阵列芯片本体作为实施例进行具体说明，具体指标如表1：
[0135]
表1微孔阵列芯片本体的指标
[0136]
传感器种类isfet微孔及传感器数量～26万个微孔尺寸(长，宽，深度)2微米，2微米，1.5微米传感器表面感应材料种类ta
2
o
5
/au传感器表面感应材料厚度20nm检测pcr的信号类型氢离子浓度，或扩增后dna的电荷
[0137]
1.捕获探针连接芯片
[0138]
捕获探针(也可称为dna探针)连接微孔阵列芯片的操作按如下步骤进行：a、将含有捕获探针的连接液(见表2)混匀后取2.5ul滴加到芯片上；b、将微孔阵列芯片放入真空装置内抽真空(0.1m pa)并保持1分钟后取出；c、在室温保湿1小时后用去离子水洗掉未连接的捕获探针。
[0139]
表2：捕获探针连接液配制
[0140]
nacl1mtris-hcl50mm巯基peg41mmtcep1mm巯基dna探针10umph7.5
[0141]
2.上样
[0142]
如图9所示，将6个不同已知浓度的目标dna溶液(0.01pm，0.1pm,1pm,10pm,100pm,
1nm)分别与含有dna聚合酶、dntps和引物的pcr扩增液混合均匀。溶液混合量及比例如表3所示，10微升体系可用于四张芯片。按如下步骤上样：a、将混合后的溶液取2.5ul滴加到微孔阵列芯片上(每个特定浓度溶液对应一个芯片)，使每个微孔内均含有混合溶液；b、将芯片放入真空装置内抽真空(0.1m pa)并保持1分钟后取出；c、将微孔阵列芯片100(也可简称为芯片)放入图10所示的pcr锥形适配器里；d、用密封盖密封半导体芯片表面并合上pcr适配器上盖1030，将密封压片与微孔阵列芯片100微孔上表面压紧密封，使得微孔阵列芯片100本体的每个微孔均是独立的反应空间。
[0143]
其中，参照图10中的(a)、(b)和(c)，pcr锥形适配器可单独或者多个一起放置在pcr仪器的加热槽内进行加热，对放置在微孔阵列芯片100上的液体进行pcr扩增；pcr锥形适配器的导热性能佳，可快速将pcr仪器的加热槽上的热量传导至芯片上；芯片可分离的设置在pcr锥形适配器上，使芯片pcr适配器完成不同芯片的pcr扩增。pcr锥形适配器包括：基座1010、上盖1030、堵头1040、卡扣1060和弹簧1070，具体的：包括与基座1010扣合连接的上盖1030，上盖1030上设置有压合在芯片上的堵头1040，上盖1030的外侧设置有扣合在基座上的卡扣1060。卡扣1060的中部枢轴连接在上盖1030上，卡扣1060的上端与弹簧1070的一端固定相连，弹簧1070的另一端固定在上盖1030上。人工拨动卡扣1060可将上盖1030扣合在基座1010上，当上盖1030扣合在基座1010上后，堵头1040将芯片100压合在芯片放置槽内，使芯片100位置固定。
[0144]
表3：pcr溶液配制
[0145]
dna template0.01pm到1nmpcr mix5ulprimer适量去离子h
2
o至10ul
[0146]
3.pcr扩增反应
[0147]
将一个或多个含有芯片本体的pcr适配器放到普通pcr仪上的96孔板的孔洞内，适配器底座为金属或导热材料，对芯片本体进行导热，进行pcr扩增，扩增条件如表4所示：
[0148]
表4：pcr扩增条件
[0149][0150][0151]
4.信号读取
[0152]
pcr扩增完成后将带有密封压片的芯片(保持密封状态)从pcr适配器中取出后有2种方法对pcr扩增产生的电信号进行读取：方法a、将芯片取出后放置在如图2和图3所示的读取装置的socket内，直接通过读取装置(通过片上电极给芯片的微孔溶液提供基准电压)的电路连接芯片管脚，将所有微孔内传感器的电信号经数据处理读出到计算机或到显示屏；为防止方法a中的pcr扩增结束后pcr溶液发生变化会导致可能发生两种信号，一种是dna本身的电荷信号，另外一个是pcr溶液本身发生变化引起的另外一个假信号，从而导致测得的结果不准确，进一步地，可以采用方法b、将芯片取出后用ph8.0缓冲液或去离子水或纯净水进行冲洗，将原先的溶液清洗掉，然后再将加有ph8.0缓冲液或去离子水或纯净水的芯片放置在如图2和图3所示的读取装置的socket内，这样使得pcr溶液测之前和测之后没有任何变化，最后通过读取装置(通过片上电极或外接电极给芯片的微孔溶液提供基准电压)的电路连接芯片管脚，将所有微孔内传感器的电信号经数据处理读出到计算机或到显示屏。
[0153]
对芯片本体进行数据驱动过程中，每一个时间点，都产生26万个数据，作为一帧，分别对应26个生化传感器。数据按512行
×
512列，形成一个二维热力图，如图11所示，每一个像素的颜色对应相应传感器的输出信号的大小，即其对应的微孔内的ph值/dna电荷。多个时间点可产生多帧二维热力图。
[0154]
具体过程如下：
[0155]
(1)dna探针连接前后：首先在dna探针连接前后分别获取芯片的数帧二维热力图数据，对微孔内连接dna探针前后的多帧电信号进行比较。如图12所示微孔的电信号变化明显，即为微孔内连有dna探针，其中，图12中的上曲线a1表示dna探针连接之前，下曲线a2表示dna探针连接之后。
[0156]
(2)pcr扩增前后：对于各个初始dna浓度(c1＝0.01pm到1nm)的6个样本，对应的6颗芯片本体，每颗芯片本体都获得pcr扩增前后的数帧二维热力图数据。首先，对微孔内pcr扩增前后的多帧电信号进行比较。其次，对每个芯片本体求得所有微孔的电信号变化并进行直方图histogram分析。如图13所示，histogram分析获得多个分布峰：没有dna样本发生pcr扩增的微孔，其电信号没有发生变化，传感器输出为0，则相应微孔为阴性反应单元，即阴性传感器；再次，有一个或多个dna样本发生pcr反应的微孔中电信号发生变化，则相应微孔为阳性反应单元，即阳性传感器，如图14所示微孔的电信号变化明显，即为微孔内有dna模板进行了pcr扩增(图14中上曲线b1为pcr扩增之后，下曲线b2为pcr扩增之前)。如果溶液稀释比例合适，多个dna样本发生pcr反应干扰的单元数量很少。
[0157]
将各个初始dna浓度(c1＝0.01pm到1nm)和对应的阳性传感器的数量n绘制如图15所示的标准曲线c＝f(n)。
[0158]
再根据待测样本在芯片本体上的信号所计算出的阳性传感器数量，带入标准曲线方程，计算得到dna样本的初始拷贝浓度(c2)。通过对比泊松公式计算的结果，所测dna拷贝浓度c2与实际拷贝浓度c1较为接近，从而验证所获得的标准曲线与泊松分布公式一致。
[0159]
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一
个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
[0160]
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。