敲降甘蓝型油菜及其亲本物种MYB43的表达在提高植物抗病性中的应用的制作方法

文档序号：18832779发布日期：2019-10-09 04:00阅读：499来源：国知局

本发明涉及基因工程技术领域，特别涉及敲降myb43在提高甘蓝型油菜及其亲本物种抗病性中的应用。

背景技术：

甘蓝型油菜(brassicanapus，简称油菜)属于十字花科芸薹属，是由同属的白菜(brassicarapa)与甘蓝(brassicaoleracea)通过种间天然杂交和染色体组加倍而形成的异源四倍体物种。由于天然杂交及其随后的成种过程仅仅几千年时间，因此全基因组测序等研究已表明，油菜拥有两个亲本物种(白菜、甘蓝)的全套基因组之和，且与亲本物种在对应基因间的序列几乎一致或高度相似。油菜及其亲本物种白菜和甘蓝是世界性的重要油料、蔬菜、饲料和观赏植物。在世界范围内，油菜、白菜、甘蓝等芸薹属乃至整个十字花科作物的生产中，受到多种生物和非生物性逆境胁迫的危害，其中菌核病发生普遍，危害巨大，菌核病造成油菜产量损失10％-80％。

myb转录因子超家族对于植物生长发育和适应性具有重要意义，但绝大多数myb基因的功能未知。对于myb43而言，目前在十字花目植物中的已有报道只涉及其少量的表达特征信息，在拟南芥中atmyb43在发育的纤维中表达，且atmyb43启动子能够被维管发育调控因子atmyb46的结合。在十字花目以外的植物中，杨树ptrmyb152是拟南芥atmyb43的同源基因，将其超量表达后茎秆木质部变厚，次生细胞壁加厚，木质素含量增加。

但迄今为止的整个植物界中，尚缺乏myb43与株高、分枝、株型、抗倒伏性、籽粒产量、植株抗病性等性状之间的关系的研究报道，更缺乏其分子育种应用方面的报道。对于包括拟南芥、油菜、白菜、甘蓝在内的十字花科植物的myb43基因而言，并无转基因植物功能研究的报道。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供敲降甘蓝型油菜及其亲本物种myb43的表达在提高植物抗病性中的应用，目的之二在于提供敲降甘蓝型油菜及其亲本物种myb43的表达在减小甘蓝型油菜或其亲本物种茎杆核盘菌病斑长度中的应用；本发明的目的之三在于提供敲降甘蓝型油菜及其亲本物种myb43的表达在提高甘蓝型油菜或其亲本物种单位面积产量中的应用。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、敲降甘蓝型油菜及其亲本物种myb43的表达在提高植物抗病性中的应用，所述甘蓝型油菜myb43家族的全长cdna序列为seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27和seqidno.28所示，亲本物种白菜myb43家族的全长cdna序列为seqidno.29、seqidno.30所示，亲本物种甘蓝myb43家族的全长cdna序列为seqidno.31、seqidno.32所示。

优选的，所述甘蓝型油菜myb43家族的全长gdna序列为seqidno.33、seqidno.34、seqidno.35和seqidno.36所示，亲本物种白菜myb43家族的全长gdna序列为seqidno.37、seqidno.38所示，亲本物种甘蓝myb43家族的全长gdna序列为seqidno.39、seqidno.40所示。

优选的，敲降myb43的方法为，针对甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族，构建rna干扰载体，然后将获得的转化子转化甘蓝型油菜或其亲本物种，获得敲降myb43的植株。

优选的，所述rna干扰载体由seqidno.25所示的602-1081bp、seqidno.26所示的604～1084bp、seqidno.27所示的578～1058bp、seqidno.28所示的606～1086bp、seqidno.29所示的602～1081bp、seqidno.30所示的580～1060bp、seqidno.31所示的597～1077bp、seqidno.32所示的604～1084bp的反义片段插入pfgc5941m载体的camv35s启动子与bnpap2intronii之间而得；

或seqidno.25所示的602-1081bp、seqidno.26所示的604～1084bp、seqidno.27所示的578～1058bp、seqidno.28所示的606～1086bp、seqidno.29所示的602～1081bp、seqidno.30所示的580～1060bp、seqidno.31所示的597～1077bp、seqidno.32所示的604～1084bp的正义片段插入到pfgc5941m中bnpap2intronii与ocs3’之间，形成rnai载体pfgc5941m-bmyb43i。

优选的，所述转化子为含所述rna干扰载体的根癌农杆菌工程菌株。

优选的，所示植物为甘蓝型油菜、白菜或甘蓝。

2、敲降甘蓝型油菜及其亲本物种myb43的表达在减小甘蓝型油菜或其亲本物种茎杆核盘菌病斑长度中的应用，所述甘蓝型油菜myb43家族的全长cdna序列为seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27和seqidno.28所示，亲本物种白菜myb43家族的全长cdna序列为seqidno.29、seqidno.30所示，亲本物种甘蓝myb43家族的全长cdna序列为seqidno.31、seqidno.32所示。

3、敲降甘蓝型油菜及其亲本物种myb43的表达在提高甘蓝型油菜或其亲本物种单位面积产量中的应用，所述甘蓝型油菜myb43家族的全长cdna序列为seqidno.25、seqidno.26、seqidno.27和seqidno.28所示，亲本物种白菜myb43家族的全长cdna序列为seqidno.29、seqidno.30所示，亲本物种甘蓝myb43家族的全长cdna序列为seqidno.31、seqidno.32所示。

本发明中，甘蓝型油菜外植体品种为商业品种中双10号种子，所述外植体为无菌苗下胚轴段。

本发明中，提高甘蓝型油菜及其亲本物种抗病性的指标为，对转基因植株茎秆接种核盘菌，病斑显著比非转基因(对照)植株小，抗病性显著提高。

本发明中，改变生长发育指标为植株略矮，分枝略少略短，叶片略小，单株产量略有下降。但却能够耐密植，适当增加密度后能增加单位土地面积上的籽粒产量。

本发明的有益效果在于：本发明提供了在甘蓝型油菜及其亲本物种白菜、甘蓝中myb43家族的成员基因数、全长序列、编码蛋白特征、进化关系，并确认了适当敲降myb43家族的表达水平可以使植物的抗病性显著增强，合理密植后产量增加。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族全长cdna扩增的电泳图(m:dnamarker；1～8分别代表bnmyb43-1、bnmyb43-2、bnmyb43-3、bnmyb43-4、brmyb43-1、brmyb43-2、bomyb43-1和bomyb43-2的全长cdna的pcr扩增条带)。

图2为甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族全长gdna扩增的电泳图(m:dnamarker；1～8分别代表bnmyb43-1、bnmyb43-2、bnmyb43-3、bnmyb43-4、brmyb43-1、brmyb43-2、bomyb43-1和bomyb43-2的全长gdna的pcr扩增条带)。

图3为甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族成员蛋白的二级结构；纵向从长到短的4种线段分别表示α螺旋、延伸链、β转角和随机卷曲。数字表示蛋白的氨基酸残基的计数(a～h依次代表bnmyb43-1、bnmyb43-2、bnmyb43-3、bnmyb43-4、brmyb43-1、brmyb43-2、bomyb43-1和bomyb43-2蛋白的二级结构)。

图4为甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族成员蛋白的三级结构(a～h依次代表bnmyb43-1、bnmyb43-2、bnmyb43-3、bnmyb43-4、brmyb43-1、brmyb43-2、bomyb43-1和bomyb43-2蛋白的三级结构)。

图5为甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族成员和部分拟南芥myb转录因子的系统发生关系。

图6为甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族转录表达的器官特异性。

图7为甘蓝型油菜myb43家族响应核盘菌诱导的表达特征。

图8为甘蓝型油菜及其亲本物种myb43家族rna干扰表达载体的构建(a：rna干扰表达载体电泳图；b：rna干扰表达载体结构图)。

图9为3个最优转基因株系的pcr鉴定及其与对照植株表达水平的比较，其中1、2、3分别表示敲降myb43基因家族的转基因株系，(a)上部引物组合为rbmyb43i+rbnpap2i2,(a)下部引物组合为fbmyb43i+rocst5n，(b)中引物组合为fbmyb43rt+rbmyb43rt。

图10为转基因植株产量的变化。

图11为转基因植株抗病性的变化(a：茎秆病斑结果图；b：茎秆病斑长度结果)。

具体实施方式

以下将参照附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如分子克隆实验指南(第三版，j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译，科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

优选实施例采用的植物材料：甘蓝型油菜中油821(zy821)、中双10号(zs10)均为商业品种，常规大田试验条件种植，套袋自交留种。

优选实施例采用的试剂及试剂盒：easyspin植物rna快速提取试剂盒购自北京博迈德生物技术有限公司；primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)反转录试剂盒购自大连takara公司；荧光定量试剂盒faststartessentialdnagreenmaster购自roche公司；各种限制性内切酶ncoi、aatii、bamhi和xbai等为立陶宛mbifermentas公司产品；murashige&skoog(ms)培养基购自荷兰duchefa公司；goldview核酸染料购自北京赛百盛基因技术有限公司；ctab、tebuffer、dnaloadingbuffer、利福平(rif)、链霉素(str)、卡那霉素(kan)、氨苄青霉素(amp)、头孢噻肟钠(cef)、琼脂糖、胰蛋白胨、酵母提取物、basta除草剂及其它试剂均购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

优选实施例采用的主要仪器：美国appliedbiosystems公司abi9700型pcr仪，bio-radcfx96touch^tm荧光定量pcr仪；以及分子生物学和植物基因工程的其它常规仪器、设备和设施。

实施例1、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族的克隆

本研究所用引物见表1。

表1、本研究所用引物

1、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝基因组总dna和总rna的提取

每个品系取典型植株的嫩叶，采用十六烷基三甲基溴化胺(ctab)法提取基因组总dna，采用1.0％琼脂糖凝胶电泳法和分光光度法评价核酸样品的质量和浓度。同时，以甘蓝型油菜品种zy821的根、茎、叶、花、花后30d的种子、花后20d的荚果皮为材料，采用柱式小量植物总rna抽提试剂盒按说明书提取总rna，用dnasei去除dna杂质，总rna乙醇沉淀后溶于纯水。核酸样品采用1％琼脂糖凝胶电泳检测质量，用nanodrop2000c紫外分光光度计测定浓度和纯度。

电泳结果表明，用ctab法提取的甘蓝型油菜、白菜、甘蓝基因组总dna的完整性好，rna消化完全，分光光度法检测的纯度也较高，可用于pcr扩增及southern杂交实验。电泳分析表明，获得的总rna特征条带清晰，无明显rna降解和dna污染，分光光度法检测评价的质量也较好，能够满足下游实验的要求。

2、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝各器官总cdna第一链的获得

将上述1中所提的rna等量混合后用takara公司的primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser(perfectrealtime)反转录试剂盒，得到甘蓝型油菜、白菜、甘蓝各器官总cdna第一链。

3、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族的电子克隆

拟南芥myb43基因(atmyb43)位于5号染色体(at5g16600)上，其cdna(at5g16600)为1329bp。将其cdna序列提交到ncbi(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)网站上进行核酸序列比对(nucleotideblast)，在organism中分别输入brassicanapus(taxid:3708)、brassicarapa(taxid:3711)和brassicaoleracea(taxid:3712)，在database中选择others和referencernasequence(refseq-rna)，在optimizefor选择somewhatsimilarsequences(blatsn)，然后点击blast进行比对，比对结果显示genbank中只有两条注释成bnmyb43的基因序列的基因同源分值较高，4条注释成其它油菜基因的序列的基因同源分值较高，2条注释成其它白菜基因的序列的基因同源分值较高，2条注释成其它甘蓝基因的序列的基因同源分值较高，将它们创建序列到拟南芥网站进行比对，发现这10条序列均为atmyb43的垂直同源基因，将它们进行多重比对发现，它们分成四组。所以推测甘蓝型油菜、白菜、甘蓝分别存在4条、2条和2条myb43基因，对应的独立基因分别命名为bnmyb43-1、bnmyb43-2、bnmyb43-3、bnmyb43-4、brmyb43-1、brmyb43-2、bomyb43-1和bomyb43-2。

4、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族全长cdna的克隆

分别以甘蓝型油菜、白菜、甘蓝混合器官总cdna第一链为模板，以表1所列的引物组合进行pcr扩增，pcr扩增产物的琼脂糖凝胶电泳显示，引物组合fbrmyb43-1+rbrmyb43-1、fbrmyb43-2+rbrmyb43-2、fbomyb43-1+rbomyb43-1和fbomyb43-2+rbomyb43-2均扩增出了1条约1200bp的条带(图1)。胶回收、ta克隆后，批量克隆子的菌液pcr检测表明插入片段长度出现了多态性，均送样测序，测序结果的blastn以及与atmyb43的比对表明它们均是甘蓝型油菜及其亲本物种的myb43基因，8条1200bp的条带测序获得的标准全长cdna的长度分别为1235bp、1236bp、1199bp、1217bp、1235bp、1202bp、1242bp和1215bp，分别命名为bnmyb43-1mrna、bnmyb43-2mrna、bnmyb43-3mrna、bnmyb43-4mrna、brmyb43-1mrna、brmyb43-2mrna、bomyb43-1mrna和bomyb43-2mrna，其核酸序列如seqidno.25～seqidno.32所示。

5、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族gdna序列的克隆

将模板替换成甘蓝型油菜、白菜、甘蓝基因组总dna，进行与前面一样的pcr扩增，电泳结果显示，引物组合fbrmyb43-1+rbrmyb43-1、fbrmyb43-2+rbrmyb43-2、fbomyb43-1+rbomyb43-1和fbomyb43-2+rbomyb43-2均扩增出了1条约2250bp的条带(图2)。胶回收、ta克隆后，菌液pcr检测没有多态性，测序获得的准确长度分别为2293bp、2252bp、2237bp、2256bp、2295bp、2240bp、2259bp和2258bp，分别命名为bnmyb43-1gene、bnmyb43-2gene、bnmyb43-3gene、bnmyb43-4gene、brmyb43-1gene、brmyb43-2gene、bomyb43-1gene和bomyb43-2gene，其核酸序列如seqidno.33～seqidno.40所示。

实施例2、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族的生物信息学分析

在vectorntiadvance11.5上进行序列比对、开放阅读框(orf)查找与翻译，在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/网站上进行blast和蛋白序列的cdd搜索，在http://bip.weizmann.ac.il/和www.expasy.org等网站提供链接的生物信息学网站上进行蛋白质结构分析，在http://prodes.toulouse.inra.fr/multalin/multalin.html和http://www.ebi.ac.uk/clustalw/等网站上进行基因和蛋白质序列多重比对和聚类分析。

1、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族的结构分析

(1)甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族的结构参数

甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族8个全长基因的dna序列为2237-2295bp，均有3个外显子和2个内含子，最长标准mrna均为1242bp，最长5′非编码区(5′utr)为126bp，最长3′utr为226bp，编码氨基酸为304-329个(表2)。

表2、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族结构和核酸特征

(2)甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族蛋白的基本参数、亚细胞定位和可能的转录后修饰

推导的甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族8个蛋白有304-329个氨基酸残基，分子量为37.67-37.72kd，等电点均为6.9，带电氨基酸占31.77-32.16％，酸性氨基酸占10.41-10.42％，碱性氨基酸占11.38-11.39％，极性氨基酸占37.4-37.76％，疏水氨基酸占26.68-26.71％，为碱性蛋白，单个氨基酸中以亮氨酸含量最高，其次是苏氨酸，然后是天冬酰胺或丝氨酸。

signalp5.0预测它们没有信号肽。softberry-procomp、wolfpsort和plant-mploc均预测它们定位于细胞核；tmpred预测它们没有任何跨膜域。netphos3.1预测它们有多个潜在的磷酸化位点，主要是丝氨酸磷酸化位点(表3)。

表3、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族编码蛋白的基本特征

表3(续)

(3)甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族蛋白的保守域、保守基序和高级结构

ncbi保守域搜索(ncbiconserveddomainsearch)表明，甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族8个蛋白均为sant保守域。

sopma软件预测，它们的二级结构主要为随机卷曲(37.7-44.08％)，其次是α-螺旋(33.2-36.4％)和延伸链(14.47-18.24％)，β-转角(5.59-9.27％)(表3，图3)。

swiss-model预测到它们完整三维结构(图4)。

2、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族的同源性和系统发生关系

(1)核酸与蛋白水平的同源性

vectorntiadvance11.5上的两两比对表明，甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族8个全长基因之间在gdna水平一致率为65.7％～99.6％，编码区水平的一致率为83.1～99.9％，编码蛋白水平的一致性和相似性分别为71.9～99.4％和76％～99.7％(表4)。在核酸水平，它们还一些其它myb基因有一定同源性。它们在编码区的保守性显著高于非编码区的保守性，但内含子在剪接边界处是保守的，5’utr和3’utr中也存在一些保守性的局部区域，应当与基因表达活动有关。在蛋白水平，它们还与许多其它myb蛋白有一定同源性(图5)。

表4、甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43家族核酸和蛋白序列同源性(％)

注：gdna一致率(斜体，上)、编码区一致率(斜体，下)、蛋白一致率(正体，上)和蛋白相似率(正体，下)

(2)系统发生关系

将blastp显示的与甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43有相似性的拟南芥myb蛋白下载，与甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43蛋白一起在vectorntiadvance上利用clustalw多重比对而构建系统树(图5)。系统树上揭示了甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43蛋白和拟南芥myb43首先聚为一类，表明甘蓝型油菜、白菜、甘蓝myb43蛋白是atmyb43的垂直同源基因(orthologs)。

实施例3、甘蓝型油菜myb43家族表达特征与抗菌核病的关系

选择甘蓝型油菜商业品种中油821的根、茎、叶、花、花后30d的种子、花后20d的荚果皮6个组织器官，以及叶片接种核盘菌0h、0.5h、3h、9h、24h和48h后病斑周围2cm组织的rna样品作为模板，采用primescriptrtreagentkitwithgdnaeraser反转录为总cdna，用荧光实时定量pcr(qrt-pcr)分析myb43基因家族表达的组织性特异性。用引物组合fbmyb43rt+rbmyb43rt检测各器官中myb43基因的总体表达水平。引物组合fbrmyb43-1rt+rbrmyb43-1rt、fbomyb43-1rt+rbomyb43-1rt、fbrmyb43-2rt+rbrmyb43-2rt和fbomyb43-2rt+rbomyb43-2rt分别用于检测成员基因bnmyb43-1、bnmyb43-2、bnmyb43-3和bnmyb43-4的表达水平。反应均在25μl标准faststartessentialdnagreenmaster-pcr体系中进行，pcr反应的程序皆为：95℃预变性10min→45个扩增循环(95℃变性10s→60℃/62℃退火30s)→熔解曲线65℃到95℃。

qrt-pcr结果表明，bnmyb43总体及其家族成员在以上器官都有表达，但在茎、根中的表达量远远高于其它器官(图6)。另外，bnmyb43的表达在接种核盘菌3h后迅速下调，说明bnmyb43参与油菜与核盘菌互作过程(图7)。

实施例4、敲降油菜及其亲本物种myb43基因家族在提高抗病性上的应用

1、油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族rna干扰片段的克隆

采用甘蓝型油菜zy821混合总cdna为模板，采用引物组合fbmyb43i+rbmyb43i扩增出bmyb43基因家族的干扰片段bmyb43i，电泳显示的产物片段大小与预期相同(图8，a)。将其分别回收，与pmd19-t连接，转化dh5α，挑选pcr阳性的单克隆菌液测序，结果显示bmyb43i的长度均为505bp，分别为seqidno.25所示的602-1081bp、seqidno.26所示的604～1084bp、seqidno.27所示的578～1058bp、seqidno.28所示的606～1086bp、seqidno.29所示的602～1081bp、seqidno.30所示的580～1060bp、seqidno.31所示的597～1077bp、seqidno.32所示的604～1084bp，与该基因家族的全长cdna序列相比没有突变。

2、油菜、白菜、甘蓝myb43基因家族rnai干扰载体的构建

bmyb43i反义片段采用ncoi+aatii完全双酶切亚克隆到pfgc5941m中camv35s启动子与bnpap2intronii之间，bmyb43i正义片段采用bamhi+xbai完全双酶切亚克隆到pfgc5941m中bnpap2intronii与ocs3’之间，形成rnai载体pfgc5941m-bmyb43i(图8，b)。将其转化dh5α，得到抗kan的克隆子，分别经各引物组合进行pcr检测，阳性克隆子提取质粒后转化根癌农杆菌lba4404，pcr阳性克隆子即为工程菌株。

3、农杆菌介导pfgc5941m-bmyb43i转化油菜商业品种

本发明中，pfgc5941m-bmyb43i转化油菜、白菜、甘蓝及其它植物后均可用于提高抗病性，本优选实施例选择了转化甘蓝型油菜作为代表，转化其它物种的应用原理与此类似。

所有组织培养操作均在标准的植物组织培养条件下进行，超净工作台、培养间、驯化间的洁净级别分别为100级、10000级和100000级，相应试剂、材料、器皿均按规程进行无菌处理。中双10号种子在清水中浸泡1～2h后，用75％乙醇表面消毒1min后用无菌水冲洗3次，然后用0.1％升汞浸泡15min，无菌水多次冲洗干净，然后接种于ms固体培养基[ms粉4.41g/l+phytagel2.6g/l+蔗糖30.0mg/l，ph5.8，灭菌锅温热灭菌；不加phytagel即为液体培养基]上，25℃、2000lux光照、16h/d光周期培养(后面的组培间培养条件除特别注明者外，均与此相同)。切取苗龄8天左右无菌苗的下胚轴切成长约0.5～1.0cm的小段，接种到预培培养基msp[ms培养基+1.0mg/l6-苄基氨基嘌呤(6-ba)+1.0mg/l2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)]上预培养3天。

-80℃保存的工程菌株在加有100.0mg/lkan+20.0mg/lstr+40.0mg/lrif的lb液体培养基中于28℃、250r/min振荡培养1～2天，使农杆菌生长至对数期，转接培养一次。5000rpm、10min室温离心收集菌体，用浸染培养基msm[ms液体培养基+1.0mg/l2,4-二氯苯氧基乙酸(2,4-d)+1.0mg/l6-苄基氨基嘌呤(6-ba)+100μm乙酰丁香酮(as)]调节细菌浓度至od600约0.5左右，即为浸染液。

将预培养后的下胚轴段浸入浸染液中5-10min，期间间歇性轻轻摇荡，然后将小胚轴段在灭菌纸上吸干多余的菌液，接种到共培培养基msc[ms固体培养基+1.0mg/l6-ba+1.0mg/l2,4-d+50μmas]中，23.5℃暗培养48小时。用杀菌液体培养基msk[ms液体培养基+1.0mg/l2,4-d+1.0mg/l6-ba+500mg/l头孢霉素(cef)]浸泡洗涤外植体3×10min，用灭菌纸吸干表面液体，转接到诱导筛选培养基msi[ms固体培养基+1.0mg/l6-ba+1.0mg/l2,4-d+500mg/lcef+15ppmbasta]中培养，约2周继代1次，至长出肉眼可见的抗性愈伤，再转接到分化培养基msd[ms固体培养基+4.0mg/l6-ba+2.0mg/l玉米素(zt)+5.0mg/lagno3+500mg/lcef+15ppmbasta]中培养14天以上，诱导愈伤组织分化出小芽，再转接到茎分化培养基mss(ms固体培养基+3.0mg/l6-ba+2.0mg/lzt+500mg/lcef+10ppmbasta)中培养至长出小茎，再转接到长茎培养基mse(m固体培养基+0.05mg/l6-ba+500mg/lcef+10ppmbasta)中培养至长完整的茎片，再转接到生根培养基msr[ms固体培养基+2mg/l萘乙酸(naa)]中培养至长出发达根系，生根后的小苗经驯化后，移栽到含有灭菌珍珠岩、蛭石、草炭土(质量比为1:1:1)混合物的盆钵中，按温室盆栽进行管理，最终获得转基因再生植株。

同时，以无basta筛选压的相同组培条件下获得的中双10号再生植株为非转基因阴性对照。

4、转基因植株的鉴定

(1)转基因植株的basta复检鉴定

用浓度为200ppm的basta溶液对转基因再生植株和对照植株的叶片进行涂染处理。

(2)转基因植株的pcr鉴定

分别取转基因再生植株和阴性对照植株的叶片，提取基因组总dna，采用rbmyb43i+rbnpap2i2和fbmyb43i+rocst5n这2对引物组合进行复合pcr检测。阳性转基因再生植株在2种引物组合的检测下，都能扩出与阳性对照(ck+，工程菌株)一样大小的条带，而阴性对照植株(wt)则无条带(图9)。

5、转基因植株性状的调查和理想株系的筛选

转基因植株与非转基因的对照植株相比，转基因植株的农艺学形态发生了一些变化：转基因植株略矮、分枝数略少略短、叶片略小、单株产量略有下降，但适当提高种植密度后产量不降反升(图10)。取盛花期中部茎秆，离体接种核盘菌96h后统计茎秆病斑长度。根据统计结果发现，病斑显著比非转基因(对照)植株小(图11)。

采用qrt-pcr对转基因植株茎杆中myb43家族的表达水平进行检测，发现过于矮小的株系中myb43家族的表达水平也很低即rna干扰效率最高，而株型被抑制程度低的植株中rna干扰效率也较低。相反，qrt-pcr还表明，myb43家族的表达水平与抗病性呈负相关，即rna干扰效率越高则抗病性越强，rna干扰效率越弱则抗病性越弱。很显然，作为一个调控基因，myb43处于植株生长发育与抗病性的交汇节点上，植株生长发育与抗病性是天平的两个法码，而myb43则是天平的平衡点。于是，本发明综合考虑了干扰效率、抗病性和株型三者之间的平衡，从众多转基因株系中寻找myb43家族rna干扰效率在20％-50％左右、抗病性显著增强、株型略变小但能密植增产的株系作为理想株系，而将那些干扰过高和过低的株系舍弃。

这些结果说明，适当敲降myb43的表达水平后，能显著提高植物的抗病性，略变小的株型在适当提高种植密度的情况下具有大田增产潜力。

应用形式的其它说明

1、本发明中的基因和其片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括来自于油菜、白菜、甘蓝的其它亚种、生态型或品种以及其它近缘物种的myb43基因序列，尽管它们与序列表中所列的核苷酸序列可能有小的差异。

2、本发明中的基因和其片段，除了序列表中所列的核苷酸序列以外，也包括与它们在连续80bp及以上有98.00％以上一致性的任意核苷酸序列。

3、本发明中所构建的干扰表达载体，除了像优先实施例中所举的转化pfgc5941m-bmyb43i以外，转化其它任意一个载体也可获得相似的效果。

4、本发明中的基因和其片段，除了像优先实施例中所举的用于甘蓝型油菜、白菜、甘蓝以外，还可以应用于其它物种。

5、本发明中的基因和其片段，除了像优先实施例中所举的采用rna干扰增强抗病性及改变株型，还可以采用反义rna、cres-t等技术取得类似效果。

6、本发明中的基因和其片段，除了像优先实施例中所举的采用pfgc5941m进行载体构建以外，还以采用其它平台载体来进行载体构建；本发明中的载体构建物，除了像优先实施例中所举的采用根癌农杆菌lba4404介导的改良叶盘法进行转化以外，也可以采用其它方法进行植物转化。

7、本发明中的myb43家族的敲降，既不是从染色体上将所有myb43基因完全敲除，也不是将整个myb43家族的表达水平进行100％或接近100％地沉默，因为这样虽然抗病性增加得更强，但生长发育被过度地抑制，植株过于矮小而影响产量。本发明的目的是适当降低myb43家族的表达水平，即rna干扰效率在20％-50％左右。因此，对于得到的多个独立转基因株系，需要通过qrt-pcr的筛查，鉴定出扰效率合适的敲降株系作为理想株系，干扰效率过低和过高的株系均要舍弃。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

序列表

<110>西南大学

<120>敲降甘蓝型油菜及其亲本物种myb43的表达在提高植物抗病性中的应用

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