一种快速筛选的肾癌核酸适体及其制剂在制备检测中的应用的制作方法

本发明涉及一种核酸适体及其应用，特别是涉及一种可用于肾癌细胞及早期临床肾癌组织样本检测的核酸适体及其制备检测试剂的应用方法。
背景技术：
：肾癌是一种由肾脏细胞癌变而引发的癌症，肾癌在所有新发恶性肿瘤中占3.8%左右。世界卫生组织按照肾肿瘤细胞的起源、形态学、免疫组织学、分子学和流行病学特征对肾癌进行分类，其中肾透明细胞癌（rcc）为肾癌中最普遍的肿瘤类型。肾癌多发于40岁—80岁中老年男性人群中，肾癌在女性以及儿童中发生的可能性相比中老年男性偏低，大多数肾癌患者为散发性病例，少部分则是由遗传性癌症综合征引起的。早期局限性肾癌一般无明显症状，晚期转移性肾癌病人会出现血尿、侧腹有痛感且在腰腹部可触及肿块。有少数肾癌患者会出现副瘤综合征，出现恶心呕吐、多处出血等恶性症状。肾癌根据体内肿瘤发展的严重程度进行分期分型。不同阶段的肾癌患者其治疗后生存率存在较大差异，根据数据统计，早期肾癌患者治疗后五年内的生存率高达92%，而晚期转移性肾癌患者的生存率低于23%。目前肾癌的检测手段主要有（1）整体健康检查是了解患者个人以及家族的相关病史。（2）影像学检查则通过体内成像来发现和诊断肾癌。主要应用超声波、mri（核磁共振成像）扫描、ct（腹部ct、胸部ct等）、pet-ct检查等，影像学检查手段对于发现晚期肾癌的转移肿瘤比较有效。（3）血检可检测血液中是否含有ctc细胞，还可以通过全血细胞计数结果的异常来评估肾脏肿瘤。还可检测血液中包括的与肾癌相关dna、微小rna、非编码rna等分子。（4）尿检则是其通过对肾癌患者尿液中的成分进行分析鉴定，通过发现尿液中的异常物质来进行评估，比如尿液中可能含有脱落的肾癌细胞等。（5）肾穿刺活检检查是从患者体内取出组织样本进行化验检测，通过检测肿瘤标志物如vegf、pten等对肾癌患者进行确诊。核酸适体是指在体外从人工合成的随机序列库中通过筛选技术（selex）所获得的一种可以高特异性、高亲和性识别靶标并与之结合的单链dna或者rna分子。核酸适体可以折叠形成多种三维结构与靶标结合。核酸适体由于具有与抗体类似甚至更加优越的特性使得其在生物成像探针、疾病诊断检测、靶向治疗等生物医学领域具有广泛的应用。技术实现要素：本发明的目的是提供一种高特异性、高稳定性且可用于人肾癌细胞检测的适体及其制备检测试剂的应用方法。本发明主要通过tissue-selex技术获得一种检测人肾透明细胞腺癌细胞的核酸适体，序列选自seqidno.1至seqidno.8任一所示序列，或将其进行标记修饰或改造。而最优选是下述序列5’-aacacgactcatctgtgacgggcacagttatgcaacgtgggc-3’（seqidno.5），和5’-aacacgactgcgctgtgaatcccgaacaacacgcacgtgggc-3’(seqidno.8)，该检测人肾透明细胞腺癌细胞的核酸适体，为42个碱基的短链核酸序列，主要通过对该核酸序列进行荧光基团标记，通过荧光强弱检测其与人肾透明细胞癌细胞的结合能力。此外还可在该核酸序列上连接放射性物质、治疗性物质、生物素、或者酶标记基团，推进该核酸适体在肾癌诊断与治疗中的应用。将所述的核酸适体成为制备检测人肾透明细胞癌细胞的制剂。绝大多数肾癌患者在晚期癌细胞发生转移后才被诊断。目前针对晚期转移性肾癌的治疗手段单一，而肾癌含抗性基因使得其治疗预后差且复发率高。虽然早期肾癌治愈率较高，但是由于早期肾癌缺乏特异性的肿瘤标志物，导致目前早期治疗肾癌难以实现。因此本发明中所提到的可特异性识别并结合肾透明细胞腺癌细胞的核酸适体，其具有免疫原性低、毒性低、组织渗透性强、稳定性好、制备成本低等优势，可发展为检测肾癌的新型分子探针，为肾癌的准确诊断、快速定位、靶向治疗和预后提供有效的工具。本发明是基于tissue-selex技术，以临床肾癌组织为正筛样本，从2294398条序列中，进一步通过对实验组以及对照组的测序结果中选取丰度排名前100的核酸序，最后在不同的进化树家族中挑选丰度较高的8条候选序列。后续实验进一步证明了其功能和效果，最终才得到本发明。附图说明图1为8条候选序列与人肾透明细胞癌细胞786-o细胞的结合情况，其中（a）为8条候选序列与786-o细胞的结合情况流式验证图，（b）为8条候选序列与786-o细胞的结合情况共聚焦验证图；图2为8条候选序列与人肾癌细胞achn细胞的结合情况，其中（a）为8条候选序列与achn细胞的结合情况流式验证图，（b）为8条候选序列与achn细胞的结合情况共聚焦验证图；图3为8条候选序列与人胚肾细胞hek293细胞的结合情况，其中（a）为8条候选序列与hek293细胞的结合情况流式验证图，（b）为8条候选序列与hek293细胞的结合情况共聚焦验证图；图4为候选序列中所挑选出的核酸适体wcq-5与786-o（a）、achn（b）细胞的解离平衡常数。具体实施方式以下的实施例便于更好的理解本发明，但并不限定于本发明。以下实施例中的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下属实施例中所用的实验材料如无特殊说明，均来自常规生化试剂商店购买所得到的。细胞来源：本实验所用到的细胞系人肾透明细胞癌细胞（786-o）、人肾细胞腺癌细胞（achn）以及正常的人胚肾细胞（hek293）均来源于中科院上海细胞库。肾癌组织以及肾癌癌旁组织来源于临床样本。实施例1：临床肾癌组织核酸适体筛选基于tissue-selex技术，以临床肾癌组织为正筛样本，肾癌癌旁组织为负筛样本进行筛选。首先合成具有亲和基团修饰x-aptamer文库，随后将初始文库与肾癌癌旁组织孵育，孵育后保留并分离与癌旁组织结合的核酸序列。同时将不结合的核酸序列与临床肾癌组织孵育。孵育后再保留并分离与肾癌组织结合的核酸序列。然后在第2轮筛选中，将上一轮中所保留的正筛、负筛文库分别分为三组依次与灭菌水（空白对照组），肾癌组织（实验组）、肾癌癌旁组织（实验对照组）再次孵育。孵育后分离纯化得到单链ssdna，并进行pcr扩增富集核酸序列。最后将扩增后的6组核酸序列库送往上海生工进行二代测序以及对比分析。本次筛选通过二代测序实验组共测出2294398条序列，随后，本发明人从实验组以及对照组的测序结果中选取丰度排名前100的核酸序列。同时对各组进行对比分析，挑选出只与临床肾癌组织结合的且丰度较高的核酸序列，随后通过mega6对只结合肾癌组织的核酸序列进行同源性比对并构建进化树将同源性接近的序列划归为一个家族。最后在不同的家族中挑选出丰度较高的8条候选序列进行后续实验（见表1）（wcq-1至wcq-8序列分别与seqidno.1至seqidno.8所示序列相对应）。表1针对临床肾癌组织核酸适体筛选所挑选的8条候选序列cloneidsequenceofrandomregion(5’to3’)wcq-1aagcccacgtagctgtggctcgcgaacgccgtggctgtcgtgwcq-2aagcccactacgctgtggatcacacagagatgggatgtcgtgwcq-3aacacgactcgagttcgtctcccgaaccacacgcgtgtgggcwcq-4aacacgaccacactgtggctcgcgaacgtcgccagagtcgtgwcq-5aacacgactcatctgtgacgggcacagttatgcaacgtgggcwcq-6aacacgactcgggttcgaatctcacagaccgttgcagtcgtgwcq-7aagcccacgtcgctgtgcatcgcacagtgtgcggccgtcgtgwcq-8aacacgactgcgctgtgaatcccgaacaacacgcacgtgggc实施例2：确定与786-o细胞系特异性结合能力最强的序列首先，对8条候选序列以及对照文库链进行预处理。用灭菌水将候选序列以及对照文库稀释到终浓度为250nm，然后在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min，然后将其置于常温。其次，对786-o细胞进行预处理。用dpbs清洗细胞2-3次；再用0.2%edta分别将贴壁状态的786-o细胞从培养皿上消化下来，然后通过洗涤缓冲液（washingbuffer，含0.45%的葡萄糖，5mm氯化镁）吹打细胞并收集到离心管中。最后往处理后的细胞中加入候选序列和结合缓冲液（bindingbuffer：dpbs，0.45%的葡萄糖，5mm氯化镁，100mg/ltrna，1g/lbsa）。振荡混匀后放置于4℃摇床孵育1h。孵育完成之后再用洗涤缓冲液（washingbuffer，含0.45%的葡萄糖，5mm氯化镁）离心清洗3次，再通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图1（a））。首先，对8条候选序列、对照文库链进行预处理。用灭菌水将其稀释到终浓度为250nm，然后在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min，然后置于常温。其次，对786-o细胞进行预处理。用dpbs清洗786-o细胞2-3次。最后在786-o细胞中分别加入预处理后的候选序列和结合缓冲液（bindingbuffer：dpbs，0.45%的葡萄糖，5mm氯化镁，100mg/ltrna，1g/lbsa）。然后将处理好的细胞样品放置于4℃摇床孵育1h。孵育完成之后再用洗涤缓冲液（pbs，含0.45%的葡萄糖，5mm氯化镁）清洗3次，并通过激光共聚焦进行荧光检测（结果见图1（b））。根据图1（a）流式结果显示8条候选序列能与786-o细胞结合，且出现不同程度的荧光偏移现象。同时，图1（b）共聚焦结果也与流式结果基本相符，各候选序列与786-o细胞结合，且在细胞膜表面甚至细胞内检测到fitc标记的绿色荧光。结合流式与共聚焦验证结果表明其中核酸适体wcq-5与786-o细胞的结合能力最强。实施例3：确定与achn细胞系特异性结合能力最强的序列首先，对8条候选序列以及对照文库链进行预处理。将候选序列以及对照文库稀释到终浓度为250nm，然后在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min，然后将其置于常温。其次，对achn细胞进行预处理。用dpbs清洗细胞2-3次；再用0.2%edta分别将贴壁状态的achn细胞从培养皿上消化下来，然后通过洗涤缓冲液吹打细胞并收集。最后往处理后的细胞中加入准备好的核酸序列和结合缓冲液。振荡混匀后放置于4℃摇床孵育1h。孵育完成之后再用洗涤缓冲液离心清洗3次，再通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图2（a））。首先，对8条候选序列、对照文库链进行预处理。用灭菌水稀释到终浓度为250nm，然后在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min，然后将其置于常温。其次，对achn细胞进行预处理。用dpbs清洗光学皿中的细胞2-3次。最后在achn细胞中分别加入准备好的核酸序列和结合缓冲液。然后将处理好的细胞样品放置于4℃摇床孵育1h。孵育完成之后再用洗涤缓冲液清洗3次，并通过激光共聚焦进行荧光检测（结果见图2（b））。根据图2（a）流式结果显示8条候选序列中部分核酸序列能与achn细胞结合，且出现不同程度的荧光偏移现象，其中wcq-5、wcq-8的荧光偏移相比其他核酸序列大。同时，图2（b）共聚焦结果也与流式结果基本相符，部分候选序列与achn细胞结合，且在细胞膜表面显示绿色荧光，而核酸适体wcq-7与achn细胞不结合，没有出现荧光偏移现象，同时也没有检测到绿色荧光。结合流式与共聚焦验证结果发现核酸适体wcq-5以及wcq-8与achn细胞的结合能力最强。实施例4：wcq-5不与肾正常细胞hek293细胞结合首先，对8条候选序列以及对照文库链进行预处理。将候选序列以及对照文库稀释到终浓度为250nm，然后在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min，然后将其置于常温。其次，对hek293细胞进行预处理。用dpbs清洗细胞2-3次；再用0.2%edta分别将贴壁状态的hek293细胞从培养皿上消化下来，然后通过洗涤缓冲液吹打细胞并收集。最后往处理后的细胞中加入准备好的核酸序列和结合缓冲液。振荡混匀后放置于4℃摇床孵育1h。孵育完成之后再用洗涤缓冲液离心清洗3次，再通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图3（a））首先，对8条候选序列、对照文库链进行预处理。用灭菌水稀释到终浓度为250nm，然后在95℃金属浴中变性5min，冰上复性10min，然后将其置于常温。其次，对hek293细胞进行预处理。用dpbs清洗光学皿中的hek293细胞2-3次。最后在hek293细胞中分别加入准备好的核酸序列和结合缓冲液。然后将处理好的细胞样品放置于4℃摇床孵育1h。孵育完成之后再用洗涤缓冲液清洗3次，并通过激光共聚焦进行荧光检测（结果见图3（b））根据图3（a）流式结果显示8条候选序列不与肾正常细胞hek293结合，没有明显的偏移，图3（b）共聚焦结果也与流式结果基本相符，候选序列均不与hek293细胞结合。结合流式与共聚焦结果发现核酸适体wcq-5与肾癌细胞具有较强的结合能力，而与肾正常细胞不结合。实施例5：核酸适体wcq-5与肾癌细胞的结合亲和力强弱以核酸适体wcq-5为例进一步研究其与肾癌细胞的结合亲和力强弱。首先对wcq-5进行预处理。我们将wcq-5设置成不同的浓度梯度：0nm、20nm、40nm、60nm、80nm、100nm、120nm、160nm、200nm、250nm、300nm、350nm、400nm、450nm、550nm。95℃高温变性5min，4℃复性10min，复性完后置于常温。其次，对786-o、achn细胞进行预处理。丢弃细胞培养皿中的原有培养基，加入dpbs润洗细胞2-3次。再用0.2%edta室温消化1min分别将贴壁状态的786-o、achn细胞从培养皿上消化下来，然后通过洗涤缓冲液（washingbuffer，含0.45%的葡萄糖，5mm氯化镁）分别吹打细胞并收集到离心管中。最后，振荡混匀放置于4℃摇床孵育1h。孵育后再用洗涤缓冲液离心清洗3次，再通过流式细胞仪进行荧光检测（结果见图4）。根据通过流式得出不同浓度下的平均荧光强度，扣除非特异性的背景荧光，再根y=bmaxx/（kd+x）公式，通过graphpadprism5.0计算出核酸适体wcq-5与786-o细胞的解离平衡常数，并以x轴为核酸适体不同梯度浓度，y轴为平均荧光强度构建解离曲线图。如图4所示核酸适体wcq-5与786-o细胞（a）以及achn细胞（b）的解离平衡常数均在纳摩尔级别，说明该核酸适体与肾癌细胞的结合亲和力较高，将来具有发展为识别肾癌的亲和分子。<110>湖南大学<120>一种快速筛选的肾癌核酸适体及其制剂在制备检测中的应用<160>8<210>1<211>42<212>dna<400>1aagcccacgtagctgtggctcgcgaacgccgtggctgtcgtg42<210>2<211>42<212>dna<400>2aagcccactacgctgtggatcacacagagatgggatgtcgtg42<210>3<211>42<212>dna<400>3aacacgactcgagttcgtctcccgaaccacacgcgtgtgggc42<210>4<211>42<212>dna<400>4aacacgaccacactgtggctcgcgaacgtcgccagagtcgtg42<210>5<211>42<212>dna<400>5aacacgactcatctgtgacgggcacagttatgcaacgtgggc42<210>6<211>42<212>dna<400>6aacacgactcgggttcgaatctcacagaccgttgcagtcgtg42<210>7<211>42<212>dna<400>7aagcccacgtcgctgtgcatcgcacagtgtgcggccgtcgtg42<210>8<211>42<212>dna<400>8aacacgactgcgctgtgaatcccgaacaacacgcacgtgggc42当前第1页12