一种适用于贝类软体动物卵的外源物质导入方法与流程

本发明涉及转基因技术领域，更具体地说是涉及一种适用于贝类软体动物卵的外源物质导入方法。

背景技术：

细胞作为生物体基本的组成单元和功能单元，是显微操作常见的研究对象。20世纪70年代，dna重组技术等基因工程试验手段为动物转基因技术的产生奠定了基础。近50年来，随着模式生物转基因技术研究的不断深入，越来越多的新方法被发明出来，例如显微注射法、电穿孔技术、逆转录病毒载体法、脂质体转染技术、精子载体法、体细胞核移植法等。

我国已跨越进入海洋生物基因组领域的国际前沿，然而，以基因编辑技术为核心的功能基因验证技术是制约后基因组时代深度开发和利用海洋生物基因资源的瓶颈。目前的贝类转基因研究中，利用化学或物理方法将外源基因导入细胞的方法：如电穿孔、精子载体法等，多存在转染效率较低的问题。病毒介导的转基因方法广泛应用于哺乳动物，特别是人和小鼠的细胞，但由于缺乏合适的病毒介导外源基因导入贝类等海洋生物细胞，制约了这一方法海洋生物基因编辑研究领域的应用。体细胞核移植法首先需要将目标基因转移到体外培育的体细胞中，然而，贝类的体外细胞培养技术一直未取得明显突破，因而无法进行阳性转基因体细胞的培养及筛选，且该技术操作程序复杂，对设备及技术要求较高，不适用于高繁殖力的贝类软体动物。

在显微镜视野内利用微注射针将外源物质引入单个细胞的显微注射技术已成为现代生物细胞工程及发育生物学研究的重要试验技术手段之一，尤其是转基因研究领域。与其他转基因技术相比，显微注射技术具备注射样品多样化，注射微量且定量、高效稳定、注射基因大小不受限制、无需载体等优点，在物种改良、细胞内核质研究及免疫学领域中得到广泛应用。因此，显微注射技术的广适用性使其有望成为海洋生物细胞工程及基因功能研究领域的重要工具。然而，由于双壳贝类等海洋生物卵细胞较小，多在微米级别，这也为研究者带来了一定的挑战，例如细胞载具的制备，注射针的硬度及拉制参数的选定等。

因此，如何提供一种适宜的显微注射方法并以此提高贝类软体动物卵的外源物质导入效率是本领域技术人员亟需解决的问题。

技术实现要素：

有鉴于此，本发明提供了一种规范化、操作简单且高效稳定的适用于贝类软体动物卵的外源物质导入方法，利用显微注射的方法，将外源物质导入卵细胞中，提高了外源基因的阳性率。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种适用于贝类软体动物卵的外源物质导入方法，包括下述步骤：

1)制备液体凝胶；

2)制备细胞载具：取洁净的盖玻片，先以具备与卵径相匹配直径的金属丝沿其宽度方向缠绕5圈，再将缠绕金属丝的盖玻片轻覆于步骤1)中的液体凝胶表面，使液体凝胶浸没盖玻片底面，待液体凝胶凝固后，将缠绕金属丝的盖玻片取下，得到细胞载具，备用；

3)拉针：对排布针及注射针进行系统拉针；

4)细胞排布：先将步骤3)所得排布针的针尖切除4-5mm，再以切除针尖后的排布针将卵细胞均匀排布于细胞载具内，并以海水覆盖整个细胞载具；

5)注射针预处理：先向注射针内加入外源基因溶液；然后切除注射针针尖20μm，备用；

6)显微注射：将细胞载具置于倒置显微镜载物台上，调节注射针与注射针操作臂的夹角，直至注射针与细胞载具所在平面的夹角呈30°，然后以微量显微注射仪对卵细胞进行显微注射。

以上技术方案达到的技术效果是：通过制备细胞载具、拉针、细胞排布及显微注射的一系列过程，显著提高了外源基因的导入率。

作为本发明优选的技术方案，步骤1)中液体凝胶的制备过程如下：

(11)将海水抽滤、灭菌，得到灭菌海水，备用；

(12)向步骤(11)得到的灭菌海水中加入灭菌海水体积5-15％的蒸馏水及灭菌海水质量0.5-1.5％的琼脂糖，得到混合体系；

(13)对步骤(12)所得混合溶液进行加热，得到混合溶液；将混合溶液倒入培养皿中，摇匀，得到液体凝胶。

作为本发明优选的技术方案，步骤3)中排布针的拉针的过程如下：

(31)将排布针安装到拉针仪上，设置拉针仪的参数为：heater650，pull70，vel65，time250；

作为本发明优选的技术方案，步骤3)中注射针的拉针过程如下：

将注射针安装到拉针仪上，设置拉针仪的参数为：heater650，fil4，pull200，vel50，del150，line1，prog90。

作为本发明优选的技术方案，步骤4)中每个凹槽内卵细胞的个数为100-200个。

作为本发明优选的技术方案，步骤6)中对卵细胞进行注射时，设置注射时间为500ms，补偿压力pc为50，在10倍或20倍镜视野下进行自动化微量注射。

作为本发明优选的技术方案，所述石英制注射针的内径为0.7mm。

经由上述的技术方案可知，与现有技术相比，本发明公开提供了以显微注射方法来实现贝类软体动物卵外源物质导入的技术方案，涉及细胞载具的制备，细胞排布玻璃针及显微注射石英针的标准化拉制，断针标准，注射针操作臂、显微镜以及微量显微注射仪的参数设置等，经验证，在卵径约50μm情况下，本发明提供的显微注射方法外源基因导入阳性率可达95％以上，荧光指示蛋白表达清晰，且并未影响卵裂及早期胚胎发育。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

图1a附图为50μm金属丝-盖玻片模具；

图1b附图为1％海水琼脂糖凝胶细胞载具；

图1c附图为细胞排布凹槽在20倍镜下的示意图；

图2a为排布针和注射针在0.65倍镜下的示意图，其中，上面为排布针，下面为注射针；

图2b附图为排布针针尖和注射针针尖在10倍镜下的示意图，其中，上面为排布针，下面为注射针；

图3a附图为排布针针尖切除后在4倍镜(上)和10倍镜(下)下的示意图；

图3b附图为在20倍镜下细胞排布在凝胶凹槽内的示意图；

图4a附图为注射针切除针尖后在10倍镜(上)和20倍镜(下)下的示意图；

图4b附图为在20倍镜下显微注射的示意图；

图5a附图为venus体外转录mrna的凝胶检测电泳图；(marker：100bpladder)；

图5b附图为32细胞荧光观察示意图；

图5c附图为将荧光物质导入侏儒蛤细胞中，担轮幼虫及d型幼虫发育时期的荧光观察示意图；

图6a附图为商业化斑马鱼卵细胞载具；

图6b附图为4倍镜下侏儒蛤卵细胞排布在商业化斑马鱼卵细胞载具凹槽内的示意图；

图6c附图为传统方法制备玻璃显微注射针切除针尖后在20倍镜下的示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实验室配备有侏儒蛤模式养殖系统，本试验以催产所得侏儒蛤的卵细胞(直径约50μm)为例对本发明做进一步详细说明，步骤如下：

(1)对海水以0.2μm滤膜抽滤，并在121℃环境中灭菌21min，备用；向灭菌海水中加入海水体积10％的三蒸水和海水质量1％的琼脂糖，得到混合体系；微波炉加热混合体系至溶液澄清，得混合溶液；取5ml混合溶液倒入60mm细胞培养皿盖中，摇匀以保证胶面平整，得到液体凝胶。

(2)将盖玻片无水乙醇擦净晾干，利用50μm金属丝沿着盖玻片的宽度方向缠绕5次(图1a)，并将缠绕着金属丝的盖玻片轻覆于海水琼脂糖液体凝胶中，以凝胶浸没盖玻片底面而不接触表面为宜；静置，待凝胶凝固(图1b)，用扁头镊子将盖玻片揭开，制成具备5行50μmx50μm(宽x高)凹槽的海水琼脂糖凝胶细胞载具(图1c)；

(3)将细胞排布玻璃针(tw100f-6)及显微注射石英针(q100-70-7.5)安装到拉针仪上(sutter公司)，运行系统进行拉针，针尖长度7-8mm(图2a)，可见由于玻璃针硬度低于石英针，针尖处明显弯曲(图2b)，不适用于显微注射；玻璃针设置拉针仪参数为：heater650，pull70，vel65，time250(仪器型号：sutterp-97)，石英针设置拉针仪参数为：heater650，fil4，pull200，vel50，del150，line1，prog90(仪器型号：sutterp-2000)；

(4)4倍体式镜下利用解剖刀(23号刀片)切掉细胞排布玻璃针针尖处4-5mm，切口内径约50μm(图3a)，利用口吸器(a5177，sigmaaldrich)将卵细胞吸至排布针中，并以排布针将卵细胞均匀排布于细胞载具凹槽内(图3b)，100-200个一组，海水覆盖于整个细胞载具；

(5)注射石英针内加入注射液，4倍体式镜下利用解剖刀(23号刀片)切掉针尖处20μm断针备用，切口内径约2-3μm(图4a)，将细胞载具置于倒置显微镜载物台上，将注射针与注射针操作臂转动连接，调整至与细胞载具所在平面呈30°的夹角；

(6)利用内置压缩机的femtojet4i程序化微量显微注射仪进行显微注射，设置注射时间为500ms，补偿压力pc为50，在10倍或20倍镜视野下进行自动化微量注射(图4b)。

试验1为了对本发明提供的显微注射方法进行评价，现利用绿色荧光指示蛋白venus进行导入阳性率及早期发育观察。通过体外mrna转录试剂盒，合成venusmrna，经检测，约750bp处mrna条带清晰可见(图5a)。将200ng/ul的venusmrna经本实施例提供的显微注射方法导入未受精侏儒蛤卵细胞后，细胞数为624个(2h)，进行体外受精，统计结果显示，卵裂率(以正常发育至8-32细胞期为标准)达到80％以上(表1)。经显微观察，venus荧光蛋白在多细胞期顺利起始表达(图5b)，且未影响胚胎早期发育(图5c)。经统计，导入(表达)阳性率达到95％以上(表1)。由此可见，本发明方法提供的显微注射方法完全适用于卵径微小、约50μm的海洋双壳贝类侏儒蛤。本发明提供的石英注射针硬度较普通玻璃注射针要高，即使拉制后针尖微小也可顺利穿透卵膜，适用范围广；此外，通过调整金属丝的直径，本发明提供的海水琼脂糖凝胶细胞载具可适用于不同尺寸的海洋生物细胞排布。

试验2-3

分别按照试验1的方法将200ng/ul的venusmrna经本实施例提供的显微注射方法导入未受精侏儒蛤卵细胞后，细胞数分别为659和689个，进行体外受精，结果见表1；

表1显微注射试验卵裂率及外源基因导入阳性率统计。

试验4-7

为了对本发明提供的关键参数进行评价，特以侏儒蛤的卵细胞进行试验：

本发明需利用具备与卵径相匹配直径的金属丝制备细胞载具，例如本实例中侏儒蛤卵径为50μm，因此试验1-3均选择50μm金属丝制备细胞载具。试验4-5分别利用30μm金属丝与70μm金属丝制备细胞载具，在细胞排布过程中发现，前者会导致细胞受到明显挤压，形成不自然方形，导入后卵裂率下降，导入阳性率未受明显影响；后者导致细胞易在凹槽内滑动，且起针时易带起细胞，增加注射困难，降低注射效率。试验6-7分别利用约3μm切口注射针及4μm切口注射针将200ng/ul的venusmrna导入卵细胞内，结果显示注射效率未受明显影响，但卵裂率明显降低；结果见表2；

表2显微注射试验卵裂率及外源基因导入阳性率统计。

试验8

利用斑马鱼模式生物系统传统的显微注射方法(细胞载具：商业化；注射针为普通玻璃针)进行对比实验，结果显示已有商业化细胞载具直径过宽，不适用于侏儒蛤卵细胞的排布(图6a，6b)；利用斑马鱼的玻璃针拉制参数制备显微注射针，切针后切口内径约6-7μm，约占卵细胞直径的13-14％(图6c)，且针头整体较为粗短，玻璃材质硬度不高难以入卵，无法进行微量适度注射；注射后卵裂率为0，实验失败。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。