本发明属于生物酶技术领域，特别涉及一种纯化木聚糖酶的方法。
背景技术：
木聚糖酶属于水解酶类，是将木聚糖降解为木寡糖的酶系，该酶系主要包括β-1,4-内切木聚糖酶（ec3.2.1.8）、β-d-木糖苷酶（ec3.2.1.37）、α-d-葡萄糖醛酸苷酶（ec3.2.1.139）、α-l-阿拉伯呋喃糖苷酶（ec3.2.1.55）和乙酰基木聚糖酶（ec3.3.1.72）等。其中，β-1,4-内切木聚糖酶是使木聚糖完全水解最关键的酶，它通过水解木聚糖分子的β-1,4-糖苷键，将木聚糖水解为小寡糖和木二糖等低聚木糖，以及少量的木糖和阿拉伯糖。木聚糖酶被广泛应用于医药、食品、能源、造纸和饲料等领域，是近年来发展最快的工业酶制剂之一，具有较高的商业价值和市场潜力。但是，市售的木聚糖酶制剂纯度低，无法满足制备高附加值产品（如医药领域）对酶的需求，限制了木聚糖酶的应用。
目前，木聚糖酶的纯化方法包括非特异性方法和特异性方法。非特异性纯化方法主要包括硫酸铵分级沉淀或离心，再经离子交换层析、双水相萃取、凝胶过滤层析和疏水层析等进一步纯化的方法。特异性纯化方法，主要是根据与木聚糖酶的特异性结合而发展的亲和层析方法。但是，由于纯化成本偏高，暂未实现规模化生产。因此，开发出一套低成本且适合工业化的木聚糖酶纯化方法将具有重要的应用价值。
现有纯化木聚糖酶的方法，例如《饲料研究》2017年15期的“木聚糖酶的纯化、鉴定及酶学性质研究”一文，公开的方法是：以市售的固体木聚糖酶为原料，经去离子水溶解、降温沉淀、离心、葡聚糖凝胶过滤层析等步骤纯化得到木聚糖酶酶液。该方法存在的主要缺点有：①葡聚糖凝胶过滤层析不仅操作成本高，而且生产能力有限，不便于工业化规模生产；②经洗脱得到的木聚糖酶酶液产品中木聚糖酶浓度低，不便于后续的工业化应用。又如《安徽农业科学》2010年38卷11期的“木聚糖酶的超滤纯化方法研究”一文，公开的方法是：以里氏木霉培养得到的木聚糖酶原液为原料，经过适当稀释后，用不同分子量超滤柱进行超滤，或木聚糖酶原液不经稀释，直接进行超滤，在超滤过程中添加柠檬酸缓冲剂进行稀释。该方法存在的主要缺点有：①没有对木聚糖酶原液原料进行预处理，资源利用率低，生产出的产品纯度低，不能满足制备高附加值产品的要求；②得到的产品为液体，不便于长期保存与运输。
技术实现要素：
本发明的目的是针对现有纯化木聚糖酶方法的不足之处，提供一种纯化木聚糖酶的方法，该方法具有生产工艺简单、便于生产，产品收率高，设备投资与运行成本低，资源综合利用率高等特点。采用本发明方法制备出的产品具有活性高、稳定性好等特点。
本发明的机理是：木聚糖酶是由多种水解酶构成的酶系，在木聚糖完全降解的过程中，需要多种水解酶的协同作用。但是，β-1,4-内切木聚糖酶发挥的作用是最为关键的。因此，本发明以提高木聚糖酶中β-1,4-内切木聚糖酶纯度为主要目标，基于木聚糖酶中水解酶结构不同导致的等电点和分子量差异，建立了相应分离纯化工艺。β-1,4-内切木聚糖酶的等电点多为酸性至中性，所以先将粗酶体系ph调节至碱性，使部分蛋白质溶解度降低，然后采用中空纤维膜过滤器进行分离，实现木聚糖酶的初步纯化。β-1,4-内切木聚糖酶的分子量多集中于15～50kda，经截留分子量为40～50kda的超滤膜可除去50kda以上的大分子蛋白质，然后用截留分子量为8～12kda的超滤膜可除去15kda以下的蛋白质、多糖、氨基酸等物质，经两级超滤分离进一步实现木聚糖酶的纯化。对于木聚糖酶浓缩液，经液氮进行预冻，既可实现超低温下酶蛋白分子的活性保持，又可实现酶的快速冻存。同时，液氮预冻时，在木聚糖酶浓缩液中添加少量甘油，可防止快速预冻时生成的大量冰晶损害酶的结构，进而起到保护酶的作用。
本发明的目的是这样实现的：一种纯化木聚糖酶的方法，以市售粗木聚糖酶粉末为原料，经ph调节、中空纤维膜过滤、超滤、冷冻干燥等步骤生产得到纯化木聚糖酶。其具体的方法步骤如下：
（1）制备粗木聚糖酶液
以市售粗木聚糖酶粉末为原料，按照粗木聚糖酶粉末的质量（g）︰纯化水的体积（ml）比为1︰100～200的比例，将粗木聚糖酶粉末分散于纯化水中，再用0.1～0.4mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至8.0～10.0，搅拌均匀后得到混合液；然后将混合液泵入中空纤维膜过滤器中过滤，控制滤膜孔径为0.2µm，泵入速度为500～1000ml/min，分别收集膜过滤液和膜截留液。对于收集的膜截留液主要含有蛋白质，经烘干粉碎后，可用作饲料添加剂；对于收集的膜过滤液，即为粗木聚糖酶液，用作下一步处理。
（2）制备木聚糖酶超滤液
第（1）步完成后，将第（1）步收集的粗木聚糖酶液泵入截留分子量为40～50kda的超滤膜分离装置中，在0.2～0.4mpa下，进行第一次超滤分离，直到第一次超滤截留液的体积减少至原体积的3～5%为止，分别收集第一次超滤透过液和第一次超滤截留液。对于收集的第一次超滤截留液主要含有大分子蛋白质，可与第（1）步收集的膜截留液合并，用于制备饲料添加剂；对于收集的第一次超滤透过液，即为木聚糖酶超滤液，用作下一步处理。
（3）制备木聚糖酶浓缩液
第（2）步完成后，将第（2）步收集的木聚糖酶超滤液泵入截留分子量为8～12kda的超滤膜分离装置中，在0.1～0.3mpa下，进行第二次超滤分离，直到第二次超滤截留液的体积减少至原体积的5～10%为止，分别收集第二次超滤透过液和第二次超滤截留液。对于收集的第二次超滤透过液主要为纯化水，含有少量小分子蛋白质、多糖、氨基酸等，可继续用于第（1）步粗木聚糖酶粉末的分散；对于收集的第二次超滤截留液，即为木聚糖酶浓缩液，用作下一步处理。
（4）制备纯化木聚糖酶
第（3）步完成后，按照甘油︰第（3）步收集的木聚糖酶浓缩液的体积比为1︰200～300的比例，将甘油加入到木聚糖酶浓缩液中，搅拌均匀后得到加有甘油的木聚糖酶浓缩液；再按照加有甘油的木聚糖酶浓缩液︰液氮的体积比为1︰30～100的比例，将加有甘油的木聚糖酶浓缩液泵入液氮中，控制泵入速度为10～50ml/min，然后快速过滤，分别收集滤渣和滤液。对于收集的滤液主要为液氮，可继续使用；对于收集的滤渣，放置于冷冻干燥装置中，在5～10pa、-55～-65℃下，进行冷冻干燥18～24h，就制备得到纯化木聚糖酶，纯化倍数为13.6～20.1，酶活力为70～103u/µg，收率为47.2～59.8%。
本发明采用上述技术方案后，主要有以下效果：
1、本发明方法以市售木聚糖酶粉末为原料，具有纯化过程与设备简单、易于控制的特点，适合规模化生产，也可推广应用于其他酶系的纯化生产。
2、在生产过程中，采用超滤分级处理，可有效提高纯化倍数和效率，降低生产成本。
3、在生产过程中，采用液氮可以实现酶液的快速冻存，降低由于缓慢预冻导致的酶晶体结构变化及酶活力的损失，提高产品性能。
4、本发明方法生产得到的产品，在4℃下储存半年，没有酶活力损失。
5、本发明方法无三废排放，资源利用率高，产品活性高，可满足医药行业对高纯度酶制剂的需求。
采用本发明方法制备的产品，可广泛应用于医药、食品、化工等行业。
四、具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步说明本发明。
实施例1
一种纯化木聚糖酶的方法，具体方法步骤如下：
（1）制备粗木聚糖酶液
以市售粗木聚糖酶粉末为原料，按照粗木聚糖酶粉末的质量（g）︰纯化水的体积（ml）比为1︰100的比例，将粗木聚糖酶粉末分散于纯化水中，再用0.1mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至8.0，搅拌均匀后得到混合液；然后将混合液泵入中空纤维膜过滤器中过滤，控制滤膜孔径为0.2µm，泵入速度为500ml/min，分别收集膜过滤液和膜截留液。对于收集的膜截留液主要含有蛋白质，经烘干粉碎后，可用作饲料添加剂；对于收集的膜过滤液，即为粗木聚糖酶液，用作下一步处理。
（2）制备木聚糖酶超滤液
第（1）步完成后，将第（1）步收集的粗木聚糖酶液泵入截留分子量为40kda的超滤膜分离装置中，在0.2mpa下，进行第一次超滤分离，直到第一次超滤截留液的体积减少至原体积的3%为止，分别收集第一次超滤透过液和第一次超滤截留液。对于收集的第一次超滤截留液主要含有大分子蛋白质，可与第（1）步收集的膜截留液合并，用于制备饲料添加剂；对于收集的第一次超滤透过液，即为木聚糖酶超滤液，用作下一步处理。
（3）制备木聚糖酶浓缩液
第（2）步完成后，将第（2）步收集的木聚糖酶超滤液泵入截留分子量为8kda的超滤膜分离装置中，在0.1mpa下，进行第二次超滤分离，直到第二次超滤截留液的体积减少至原体积的5%为止，分别收集第二次超滤透过液和第二次超滤截留液。对于收集的第二次超滤透过液主要为纯化水，含有少量小分子蛋白质、多糖、氨基酸等，可继续用于第（1）步粗木聚糖酶粉末的分散；对于收集的第二次超滤截留液，即为木聚糖酶浓缩液，用作下一步处理。
（4）制备纯化木聚糖酶
第（3）步完成后，按照甘油︰第（3）步收集的木聚糖酶浓缩液的体积比为1︰200的比例，将甘油加入到木聚糖酶浓缩液中，搅拌均匀后得到加有甘油的木聚糖酶浓缩液；再按照加有甘油的木聚糖酶浓缩液︰液氮的体积比为1︰30的比例，将加有甘油的木聚糖酶浓缩液泵入液氮中，控制泵入速度为10ml/min，然后快速过滤，分别收集滤渣和滤液。对于收集的滤液主要为液氮，可继续使用；对于收集的滤渣，放置于冷冻干燥装置中，在5pa、-55℃下，进行冷冻干燥18h，就制备得到纯化木聚糖酶，纯化倍数为13.6，酶活力为70u/µg，收率为47.2%。
实施例2
一种纯化木聚糖酶的方法，具体方法步骤如下：
（1）制备粗木聚糖酶液
以市售粗木聚糖酶粉末为原料，按照粗木聚糖酶粉末的质量（g）︰纯化水的体积（ml）比为1︰150的比例，将粗木聚糖酶粉末分散于纯化水中，再用0.2mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至9.0，搅拌均匀后得到混合液；然后将混合液泵入中空纤维膜过滤器中过滤，控制滤膜孔径为0.2µm，泵入速度为800ml/min，分别收集膜过滤液和膜截留液。对于收集的膜截留液主要含有蛋白质，经烘干粉碎后，可用作饲料添加剂；对于收集的膜过滤液，即为粗木聚糖酶液，用作下一步处理。
（2）制备木聚糖酶超滤液
第（1）步完成后，将第（1）步收集的粗木聚糖酶液泵入截留分子量为45kda的超滤膜分离装置中，在0.3mpa下，进行第一次超滤分离，直到第一次超滤截留液的体积减少至原体积的4%为止，分别收集第一次超滤透过液和第一次超滤截留液。对于收集的第一次超滤截留液主要含有大分子蛋白质，可与第（1）步收集的膜截留液合并，用于制备饲料添加剂；对于收集的第一次超滤透过液，即为木聚糖酶超滤液，用作下一步处理。
（3）制备木聚糖酶浓缩液
第（2）步完成后，将第（2）步收集的木聚糖酶超滤液泵入截留分子量为10kda的超滤膜分离装置中，在0.2mpa下，进行第二次超滤分离，直到第二次超滤截留液的体积减少至原体积的8%为止，分别收集第二次超滤透过液和第二次超滤截留液。对于收集的第二次超滤透过液主要为纯化水，含有少量小分子蛋白质、多糖、氨基酸等，可继续用于第（1）步粗木聚糖酶粉末的分散；对于收集的第二次超滤截留液，即为木聚糖酶浓缩液，用作下一步处理。
（4）制备纯化木聚糖酶
第（3）步完成后，按照甘油︰第（3）步收集的木聚糖酶浓缩液的体积比为1︰250的比例，将甘油加入到木聚糖酶浓缩液中，搅拌均匀后得到加有甘油的木聚糖酶浓缩液；再按照加有甘油的木聚糖酶浓缩液︰液氮的体积比为1︰60的比例，将加有甘油的木聚糖酶浓缩液泵入液氮中，控制泵入速度为30ml/min，然后快速过滤，分别收集滤渣和滤液。对于收集的滤液主要为液氮，可继续使用；对于收集的滤渣，放置于冷冻干燥装置中，在8pa、-60℃下，进行冷冻干燥20h，就制备得到纯化木聚糖酶，纯化倍数为18.3，酶活力为94u/µg，收率为53.4%。
实施例3
一种纯化木聚糖酶的方法，具体方法步骤如下：
（1）制备粗木聚糖酶液
以市售粗木聚糖酶粉末为原料，按照粗木聚糖酶粉末的质量（g）︰纯化水的体积（ml）比为1︰200的比例，将粗木聚糖酶粉末分散于纯化水中，再用0.4mol/l的氢氧化钠溶液调节ph至10.0，搅拌均匀后得到混合液；然后将混合液泵入中空纤维膜过滤器中过滤，控制滤膜孔径为0.2µm，泵入速度为1000ml/min，分别收集膜过滤液和膜截留液。对于收集的膜截留液主要含有蛋白质，经烘干粉碎后，可用作饲料添加剂；对于收集的膜过滤液，即为粗木聚糖酶液，用作下一步处理。
（2）制备木聚糖酶超滤液
第（1）步完成后，将第（1）步收集的粗木聚糖酶液泵入截留分子量为50kda的超滤膜分离装置中，在0.4mpa下，进行第一次超滤分离，直到第一次超滤截留液的体积减少至原体积的5%为止，分别收集第一次超滤透过液和第一次超滤截留液。对于收集的第一次超滤截留液主要含有大分子蛋白质，可与第（1）步收集的膜截留液合并，用于制备饲料添加剂；对于收集的第一次超滤透过液，即为木聚糖酶超滤液，用作下一步处理。
（3）制备木聚糖酶浓缩液
第（2）步完成后，将第（2）步收集的木聚糖酶超滤液泵入截留分子量为12kda的超滤膜分离装置中，在0.3mpa下，进行第二次超滤分离，直到第二次超滤截留液的体积减少至原体积的10%为止，分别收集第二次超滤透过液和第二次超滤截留液。对于收集的第二次超滤透过液主要为纯化水，含有少量小分子蛋白质、多糖、氨基酸等，可继续用于第（1）步粗木聚糖酶粉末的分散；对于收集的第二次超滤截留液，即为木聚糖酶浓缩液，用作下一步处理。
（4）制备纯化木聚糖酶
第（3）步完成后，按照甘油︰第（3）步收集的木聚糖酶浓缩液的体积比为1︰300的比例，将甘油加入到木聚糖酶浓缩液中，搅拌均匀后得到加有甘油的木聚糖酶浓缩液；再按照加有甘油的木聚糖酶浓缩液︰液氮的体积比为1︰100的比例，将加有甘油的木聚糖酶浓缩液泵入液氮中，控制泵入速度为50ml/min，然后快速过滤，分别收集滤渣和滤液。对于收集的滤液主要为液氮，可继续使用；对于收集的滤渣，放置于冷冻干燥装置中，在10pa、-65℃下，进行冷冻干燥24h，就制备得到纯化木聚糖酶，纯化倍数为20.1，酶活力为103u/µg，收率为59.8%。