一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法与流程

(一)技术领域

本发明涉及一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法。

(二)

背景技术：

淀粉酶(amylase)广泛应用于粮食加工、食品工业、酿造、纺织和医药领域，是目前发酵工业上应用最广泛的一类酶。淀粉酶是一种水解酶，可以将淀粉水解为麦芽糊精、葡萄糖浆等物质，是生产葡萄糖、果糖等糖工业产品中必不可少的酶。淀粉酶也是饲料酶中的重要成分，可以降解大分子多糖，使动物能够更好地消化吸收营养，对于提高动物生产性能、节约饲料资源意义重大。此外，淀粉酶还是生产生物乙醇中必需的酶制剂，淀粉被淀粉酶降解为六碳糖后，才能进一步被酵母利用、合成乙醇。

淀粉酶可以通过在植物中表达生产，例如，美国专利us7102057b2披露了一种利用转基因玉米表达α-淀粉酶来生产生物酒精的方法，该专利披露了利用一种玉米内源的胚乳蛋白质启动子控制外源淀粉酶基因在玉米胚乳中表达的方法。从效率上来说，这种表达淀粉酶的玉米表达水平相对比较低，无法用于淀粉酶的工业化生产；从用途上来说，其主要用途是玉米淀粉自动降解，解决利用玉米大规模生产酒精过程中的液化问题。此外，在烟草(penetal,1992)、苜蓿(austinetal,1995)等多种植物上也已经报道了利用基因工程技术表达外源淀粉酶的研究。但是，利用植物生物反应器表达的淀粉酶，其单位重量中的酶活性仍然普遍比较低，需要大幅度提高植物中淀粉酶的表达量才能提高这种技术的商业价值。目前，工业上使用的淀粉酶仍然主要通过微生物发酵来生产，成本较高。

本发明披露了一种利用转基因玉米高效生产淀粉酶的方法。玉米是常见的农作物，生产成本低，产量较高。利用转基因玉米生产淀粉酶，可以获得高质量的淀粉酶，降低淀粉酶的生产成本，具有广泛的应用场景和较高的经济价值。本发明方法利用转基因玉米在玉米胚乳中表达高剂量的淀粉酶，这种转基因玉米种子中的淀粉酶活性较高，在转基因玉米种子中生产的淀粉酶无需经过分离浓缩就可以直接运用在粮食加工、饲料生产、食品工业、纺织等工业过程中。本发明的特点是使用了水稻谷蛋白gt1的启动子控制淀粉酶基因在转基因玉米中的胚乳中高效表达，利用这种方法获得的转基因玉米，能够稳定、高效、低成本地生产各种用途的淀粉酶。

(三)

技术实现要素：

本发明的目的提供一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法，能够稳定、高效、低成本地生产各种用途的淀粉酶，直接运用在粮食加工、饲料生产、食品工业、纺织等工业过程中。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法，所述方法是将淀粉酶的编码基因在gt1启动子作用下转入玉米基因组中，构建产淀粉酶的转基因玉米；所述淀粉酶是指α-淀粉酶，能够催化水解直链淀粉中的α-1,4-葡萄糖苷键，生成α-麦芽糖、葡萄糖等物质，优选以下四种中的任意一种：嗜热脂肪芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilus)淀粉酶，其氨基酸序列为seqidno:1；解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliqefacients)淀粉酶，其氨基酸序列为seqidno:2；地衣芽孢杆菌(bacilluslichiformmis)淀粉酶，其氨基酸序列为seqidno:3；米曲霉菌(aspergillusoryzae)淀粉酶，其氨基酸序列为seqidno:4。

进一步，所述的淀粉酶在转基因玉米中的表达由一个来自水稻谷蛋白gt1(genbank:ap014966)的启动子控制，所述的gt1启动子的核苷酸序列为seqidno:5所示。

本发明涉及由所述淀粉酶的编码基因构建的玉米遗传转化t-dna载体。所述的t-dna载体是包含了由gt1启动子启动淀粉酶基因的表达框，所述表达框包括gt1启动子、淀粉酶基因、终止子和载体；所述载体为pcambia1300。淀粉酶基因的核苷酸序列与上述gt1启动子拼接至同一表达框中，用于构建t-dna载体。所述的t-dna载体可以用于玉米的遗传转化。由于一种氨基酸可以由不同的核苷酸密码子编码，因此，只要一段核苷酸序列编码的氨基酸序列与seqidno:1-4中的任意一种相同，且使用了本发明所涉及的遗传转化载体构建方法，均应视为本发明的内容。对于终止子序列无特殊要求，研究人员可以选用常用的终止子，如农杆菌nos终止子、玉米pepc终止子、camv35s终止子等来终止淀粉酶基因的转录。

本发明选用来自细菌或真菌的淀粉酶基因，使用一种水稻谷蛋白gt1启动子序列，构建玉米转化载体进行遗传转化，使淀粉酶基因能够特异性地在转基因玉米种子的胚乳中高效表达。利用本发明所述的方法，将包含有gt1启动子启动淀粉酶基因表达框的外源t-dna整合到玉米基因组中，通过筛选，得到能够稳定遗传、在胚乳中高表达淀粉酶的转基因玉米株系，是实现大规模生产应用的基础。

本发明优选t-dna载体构建方法为：将淀粉酶基因5’端被设计上bamhi位点，3’端被设计上saci位点，酶切获得bamhi-saci酶切片段，与5’端设计saci位点，3’端设计kpni位点的玉米pepc终止子的saci-kpni片段连接，获得包括淀粉酶基因和终止子的bamhi-kpni片段；gt1启动子序列5’端设计hindiii位点，3’端设计bamhi位点，经酶切后获得hindiii-bamhi片段；将bamhi-kpni片段和hindiii-bamhi片段插入至玉米转化载体pcambia1300的多克隆位点的hindiii和kpni位点之间，即可获得用于玉米转化的t-dna载体。

本发明还包括一种玉米细胞，所述玉米细胞的基因组上整合了所述的t-dna载体。

本发明创造性地提出并实现了一种利用转基因玉米高效生产淀粉酶的方法。与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：(1)从功能效率的角度，本发明的转基因玉米在胚乳中实现淀粉酶的高表达，所生产的淀粉酶的活性极高，达到每克种子8000单位以上；(2)从生产应用的角度，本发明的转基因玉米生产的淀粉酶无需经过分离浓缩，可以直接应用于饲料生产、食品加工、纺织工业等生产过程；(3)本发明利用玉米生物反应器生产淀粉酶，生产成本低廉，是一种环境友好型的生产方式。

(四)附图说明

图1、用于玉米遗传转化的载体p1300-gt1-as示意图。

图2、麦芽糖标准曲线。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

本发明以下实施例中所使用的分子生物学和生物化学方法均为已知的技术。在ausubel编写的johnwileyandsons公司出版的currentprotocolsinmolecularbiology，和j.sambrook等编写的coldspringharborlaboratorypress(2001)出版的molecularcloning:alaboratorymanual,3^rded.等文献均有详细的说明。

实施例1、构建玉米遗传转化载体

本发明涉及的编码基因均由上海生工公司进行人工合成。玉米遗传转化载体是基于pcambia1300(ncbi序列编号af234296)载体而构建的，唯一的不同是将原始pcambia1300上的潮霉素筛选基因hptii(位于两个xhoi位点之间)替换为本课题组自主研发的抗草甘膦筛选基因g10-evo(仅用于阳性玉米转化株系的筛选)(zhao,qc.,liu,mh.,zhang,xw.etal.generationofinsect-resistantandglyphosate-tolerantricebyintroductionofat-dnacontainingtwobtinsecticidalgenesandanepspsgene.j.zhejianguniv.sci.b16,824–831(2015))，该载体命名为1300-g10evo，在-80℃冰箱中保存。上述载体仅仅是举例，而非本发明的内容，研究者可以直接使用原始的pcambia1300载体(使用潮霉素筛选)，也可以将潮霉素编码基因hptii替换为其他合适的筛选基因，均能实现同样的效果。

对于本发明所提及的四种淀粉酶的编码基因，它们的遗传转化载体的构建方式完全一致，各个遗传转化载体之间的区别仅在于淀粉酶编码基因的不同。以嗜热脂肪芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilus)淀粉酶(氨基酸序列为seqidno:1)为例：将人工合成的嗜热脂肪芽孢杆菌淀粉酶基因(命名为as，5’端被设计上bamhi位点，3’端被设计上saci位点，bamhi-saci酶切片段)与玉米的pepc终止子(genebankno:x15239，5’端被设计上saci位点，3’端被设计上kpni位点，saci-kpni片段)连接，获得包括基因和终止子的bamhi-kpni片段；gt1启动子序列(seqidno:5)5’端被设计上hindiii位点，3’端被设计上bamhi位点，经酶切后获得hindiii-bamhi片段；将上述基因片段(bamhi-kpni片段)和启动子片段(hindiii-bamhi片段)插入连接至玉米转化载体1300-g10evo的多克隆位点的hindiii和kpni位点之间，即可获得用于玉米转化的t-dna载体p1300-gt1-as(如图1所示)。

将嗜热脂肪芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilus)淀粉酶(氨基酸序列为seqidno:1)分别替换为编码解淀粉芽孢杆菌(bacillusamyloliqefacients)淀粉酶(氨基酸序列为seqidno:2)、地衣芽孢杆菌(bacilluslichiformmis)淀粉酶(氨基酸序列为seqidno:3)、米曲霉菌(aspergillusoryzae)淀粉酶(氨基酸序列为seqidno:4)的核苷酸序列，即可构建得到t-dna载体，上述载体分别记作p1300-gt1-ba、p1300-gt1-bl、p1300-gt1-ao。

将上述t-dna载体通过电击转化法转入根癌农杆菌(agrobacteriumtumefaciens)lba4404菌株的感受态细胞中，筛选单克隆菌株并进行酶切鉴定(例如，用hindiii和kpni双酶切后能够获得与预期大小一致的目标片段)，即可制备得到用于玉米遗传转化的根癌农杆菌菌株。

实施例2、转基因玉米的获得

玉米的转化方法已经比较成熟，例如frame等描述了利用农杆菌转化玉米的方法(frameetal.,(2002)plantphysiol,129:13-22)。取实施例1方法构建的含载体p1300-gt1-as的根癌农杆菌lba4404菌株划板，挑单菌落接种，准备转化用的农杆菌。取授粉后8-10天的农大178玉米穗。收集所有的未成熟胚(大小为1.0-1.5mm)。将上述根癌农杆菌与未成熟胚共培养2-3天(遮光，22℃)。随后转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上(含200mg/ltimentin，用于杀灭农杆菌，参照(frameetal.,(2002)plantphysiol,129:13-22))，28℃暗培养10-14天。随后将所有的愈伤转到带有终浓度2mm草甘膦的筛选培养基上(frameetal.,(2002)plantphysiol,129:13-22)，28℃暗培养2-3周。

转移所有的组织到新鲜的含终浓度2mm草甘膦的筛选培养基上进行继代培养，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上(frameetal.,(2002)plantphysiol,129:13-22)，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上(frameetal.,(2002)plantphysiol,129:13-22)，26℃光照培养直到根发育完全，然后移植到温室中单株培养。单株植株成活2～3周后，用稀释200倍的农达(41％的草甘膦)水剂喷洒，7天后叶片发黄，枯死的为阴性；和喷清水对照长势一样的为阳性植株。将阳性植株保留并编号，以便后续的鉴定和检测。

上述方法获得的玉米转化株系命名为as。对于由其他淀粉酶基因构建的t-dna载体，其遗传转化方法与as完全一致，区别仅在于农杆菌与未成熟胚共培养的过程中使用的是包含有不同t-dna载体的根癌农杆菌，获得的玉米转化株系命名为ba、bl、ao。

实施例3、转基因玉米种子中表达的淀粉酶活性测定

采用dns法(miller,1959)，测定淀粉酶的活性。具体的实验方法如下：

麦芽糖标准液：用去离子水配制10mm的麦芽糖标准液；

麦芽糖标准曲线的制作，按如下表1加入不同的试剂。

表1麦芽糖标准曲线的制作

摇匀后沸水煮5min，取出后冷却，测定540nm波长下的吸光度，以麦芽糖含量为横坐标，吸光度为纵坐标绘制标准曲线，如图2所示。

酶液的制备：取表达淀粉酶的玉米种子每10mg加入1ml缓冲液(20mm乙酸钠，ph5.4，250mmnacl)研磨，研磨后的混合液为酶液。

底物的准备：取1g可溶性淀粉溶于5ml乙酸缓冲液(20mm乙酸钠，ph5.4)中，另取95ml乙酸缓冲液加热煮沸，将溶解可溶性淀粉的乙酸缓冲液加入煮沸的乙酸缓冲液中，边加边搅拌，直至淀粉呈透明的胶体状。

酶活性的测定：将酶液用乙酸缓冲液(20mm乙酸钠，ph5.4)稀释100倍后，取50μl稀释酶液加到450μl的底物中，70℃反应1h后加入1mldns溶液终止反应，沸水中煮5min后测定od540，以在70℃每分钟水解产生1μmol还原糖所需的酶为一个酶单位(unit)，根据前面绘制的麦芽糖标准曲线计算酶活性。

采用以上方法对t1代转基因玉米种子进行淀粉酶活性的测定，筛选出酶活较高的转基因玉米株系。测定结果如表2所示。

表2t1代转基因玉米的淀粉酶活性测定

根据测定结果，as-34的单位酶活最高，达到了每克种子8206单位。

对as-34转基因玉米的后代进行淀粉酶活性的进一步测试。结果表明，as-34玉米的t2、t3和t4代玉米中，淀粉酶的活性均在每克种子8000单位以上(表3)，该性状能够稳定遗传，该转化体具有广阔的生产应用前景。

表3转基因玉米as-34后代的淀粉酶活性测定

序列表

<110>浙江大学

<120>一种利用转基因玉米生产淀粉酶的方法

<160>5

<170>siposequencelisting1.0

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<212>prt

<213>嗜热脂肪芽孢杆菌(geobacillusstearothermophilus)

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