二重荧光LAMP区分新城疫强弱毒检测试剂盒及其引物组的制作方法

本发明属于病毒检测技术领域，尤其涉及一种二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测试剂盒及其引物组。

背景技术：

新城疫(newcastledisease，nd)是由新城疫病毒(newcastlediseasevirus，ndv)引起的以感染禽类为主的一种急性、烈性传染病。尽管新城疫只有一个血清型，但是不同毒株之间的生物学特性存在明显差异。目前主要以ndvf蛋白的裂解位点为鉴别ndv强弱毒株的分子标记。

传统的检测方法需要使用昂贵的仪器和试剂等。环介导等温扩增技术(loop-mediatedisothermalamplification，lamp)是由notomi等于2000年建立的一种新型核酸扩增技术，该技术具有操作简便、反应快速、成本低廉和结果可视化等优点，目前在一些病原微生物的检测中被广泛运用。传统的lamp检测方法中，创新性的加入taqman探针，反应时特异性的taqman探针会与扩增产物杂合并随着扩增进行过程水解，发出荧光。

目前，国内外均未见有建立二重荧光lamp区分新城疫强弱毒可视化检测试剂盒和方法的相关报道。“新城疫病毒强弱毒株lamp鉴别检测方法的建立”虽然报道了通过lamp区分ndv强弱毒，但是该法需要3套不同的引物，并且检测时需要在3个不同反应管中进行并观测结果。

技术实现要素：

本发明要解决的技术问题是提供一种特异性强、灵敏度高、快速简便的二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测试剂盒及其引物组。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：

二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测引物组，包括引物1至引物6，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.6的碱基序列。

引物5和引物6为taqman探针，引物5在5’端和3’端分别标记5-fam荧光基团和淬灭基团bhq-1，引物6在5’端和3’端分别标记cy5荧光基团和淬灭基团bhq-3。

引物1至引物6的摩尔比为16:16:2:2:1:1。

上述二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测引物组在环介导等温扩增中的应用。

环介导等温扩增的条件为62℃反应60min，80℃作用5min灭活。

二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测试剂盒，包括引物1至引物6，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.6的碱基序列。

引物5和引物6为taqman探针，引物5在5’端和3’端分别标记5-fam荧光基团和淬灭基团bhq-1，引物6在5’端和3’端分别标记cy5荧光基团和淬灭基团bhq-3。

上述二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测试剂盒，还包括以下试剂：环介导等温扩增缓冲液、dna聚合酶、dntps、硫酸镁、钙黄绿素、甜菜碱、mncl2。

括引物1至引物6在环介导等温扩增试剂中的终浓度分别为40μmol/l、40μmol/l、5μmol/l、5μmol/l、2.5μmol/l和2.5μmol/l。

针对目前新城疫强弱毒检测存在的问题，发明人根据ndv的保守序列针对6个特异区域设计了二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测引物组，包括引物1至引物6，它们分别具有序列表seq.id.no.1至seq.id.no.6的碱基序列，其中引物5和引物6为taqman探针它们使扩增反应具有很高的特异性，能分别与ndv强毒和弱毒的f基因裂解位点杂合，反应后在不同波长的荧光下发出不同颜色的荧光(引物5与强毒株的特异性序列杂合，在延伸过程中再水解，发出绿色荧光；引物6与弱毒株的特异性序列杂合，在延伸过程中再水解，发出红色荧光)，从而实现快速敏感特异的鉴别ndv强弱毒株。

据此，通过优化反应体系和条件，发明人还研制了相应试剂盒并建立相应二重荧光lamp方法。该法只需要在62-64℃的水浴锅中反应60分钟即可完成，能特异的检测ndv，并且通过荧光区分强弱毒株，反应后，发出绿色荧光的为强毒株，发出红色荧光的为弱毒株，若样品中同时存在强弱毒株，则为黄色荧光。试验证实，本发明检测灵敏度非常高，每个反应体系能检测到100拷贝的ndvcdna样品。

本发明只需要用1套引物，即可扩增所有的ndvf基因，并通过针对强弱毒株的f基因裂解位点特异序列的taqman探针只分别与强毒株和弱毒株序列杂合，反应过程中杂合探针水解释放游离荧光基团。反应只需要在一个反应管中进行反应，就可以根据反应后在荧光核酸成像仪下的颜色进行读取结果。且通过taqman杂合的方法，特异性更高，不受非特异性扩增的影响，也不受引物二聚体扩增的影响。而“新城疫病毒强弱毒株lamp鉴别检测方法的建立”中用sybrgreenⅰ，则不能对这些非特异性扩增或引物二聚体导致的假阳性加以区分。

总之，本发明具有比常规检测方法更特异、更敏感的特点，仅需使用一台能控温的水浴锅和荧光成像仪，适合在基层兽医站和具备基本实验仪器的养殖场中进行快速检测，具有较好的应用前景。

附图说明

图1是本发明lamp方法检测ndv强弱毒的特异性结果图。

图2是本发明lamp方法检测ndv强弱毒的敏感性结果图。

图3是本发明lamp方法检测临床分离ndv毒株的结果图。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法，如无特殊说明均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。其中：

bstdna聚合酶(大片段)购自newenglandbiolabs公司。viraldna/rnakit购自北京全式金生物。reversetranscriptase[m-mlv，rnaseh-]购自北京全式金生物。

ndv、禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌，大肠杆菌，禽巴氏杆菌，鸡毒支原体等均为已知病毒，这些病毒为自留存，公众可从广西壮族自治区兽医研究所获得。

实施例1、引物的设计

根据genbank中ndv的f基因序列，使用在线软件primerexplorerv4(http：//primerexplorer.jp/e/v4-manual/index.html)设计lamp引物。引物由广州invitrogen公司合成，其具体序列见表1。

表1lamp引物序列

lf和lb引物不加也可以，加入可以提高检测的敏感性。

实施例2、引物在二重荧光lamp区分新城疫强弱毒的的应用

一、核酸的提取

参照viraldna/rnakitdna/rna共提试剂盒说明书，提取新城疫病毒，禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌，大肠杆菌，禽巴氏杆菌，鸡毒支原体的基因组dna/rna，并使用反转录试剂盒进行反转录。

二、优化lamp反应体系、反应条件和试剂盒的构建

25μllamp反应体系：1-4μldntps(10mmol/l，终浓度为0.4mmol/l-1.6mmol/l)、2.5μl10×bstbuffer、1μlbstdna聚合酶8u(终浓度为320u/l)、4-7μl甜菜碱betaine(5mmol/l，终浓度为0.8mmol/l-1.4mmol/l)、2-9μlmgso4(25mmol/l，终浓度为2mmol/l-9mmol/l)、1μl引物(fip40μmol/l、bip40μmol/l、b35μmol/l、f35μmol/l；终浓度为fip1.6μmol/l、bip1.6μmol/l、p10.1μmol/l、p20.1μmol/l、b30.2μmol/l、f30.2μmol/l)和1μl模板(ndv的基因组cdna)，加水至25μl。

反应条件：温度按60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃依次递增反应50h，80℃作用5min灭活。

分别按照上述的反应体系和反应条件进行摸索，获得下述的最佳反应体系和条件：

最佳反应体系如下：25μllamp反应体系：2μldntps(10mmol/l，终浓度为0.4mmol/l)、2.5μl10×bstbuffer、1μlbstdna聚合酶8u(终浓度为320u/l)、5μl甜菜碱betaine(5mmol/l，终浓度为1mmol/l)、3μlmgso4(25mmol/l，终浓度为3mmol/l)、1μl引物(fip40μmol/l、bip40μmol/l、lf20μmol/l、lb20μmol/l、b35μmol/l、f35μmol/l，其中各条引物的终浓度为fip1.6μmol/l、bip1.6μmol/l、lf0.8μmol/l、lb0.8μmol/l、b30.2μmol/l、f30.2μmol/l)、1μl钙黄绿素calcein(625μmol/l，终浓度为25μmol/l)、1ulmncl2(12.5mmol/l，终浓度为0.5mmol/l)、1μl模板dna，加水至25μl。

最佳反应条件：62℃反应60min，80℃作用5min灭活。

二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测试剂盒包括fip、bip、f3、b3、p1、p2的6条引物或上述最佳反应体系(除去模板)。

三、特异性检测

分别以上述一得到禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌，禽巴氏杆菌，鸡毒支原体dna或cdna为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行lamp反应。

lamp反应结果的判断：

1)使用荧光核酸成像仪：分别使用fam通道和cy5通道成像，若反应产物颜色变为绿色，则说明样品中含有ndv且为强毒株，若反应产物颜色变为红色，则说明样品中含有ndv且为弱毒株，若反应产物颜色变为黄色，则说明样品中含有ndv且为强毒株和弱毒株同时存在，若没荧光显色则说明样品中不含有ndv。

结果如图1所示，a图为浊度仪扩增结果，b图为荧光核酸成像仪观察结果，其中a-1为ndv强毒株扩增、a-2为ndv弱毒扩增、a-3为ndv强毒和弱毒混合扩增；b-1为ndv强毒株荧光图，1为ndv强毒株、为2为禽流感病毒、3为传染性支气管炎病毒、4为传染性喉气管炎病毒、5为副鸡嗜血杆菌、6为禽巴氏杆菌、7为鸡毒支原体、8为阴性对照(水)；b-2为ndv弱毒株荧光图，1为ndv弱毒株、为2为禽流感病毒、3为传染性支气管炎病毒、4为传染性喉气管炎病毒、5为副鸡嗜血杆菌、6为禽巴氏杆菌、7为鸡毒支原体、8为阴性对照(水)；b-3为ndv强毒株和弱毒株混合荧光图，1为强毒和弱毒混合、为2为禽流感病毒、3为传染性支气管炎病毒、4为传染性喉气管炎病毒、5为副鸡嗜血杆菌、6为禽巴氏杆菌、7为鸡毒支原体、8为阴性对照(水)。可以看出，a-1和b-1只有ndv强毒株检测为阳性结果(a-1浊度仪扩增ndv强毒株有扩增曲线，b-1只有ndv强毒株荧光下呈绿色荧光)，而对禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌，禽巴氏杆菌，鸡毒支原体的检测均为阴性(a-1浊度仪没有扩增曲线，b-1没有呈绿色荧光)。a-2和b-2只有ndv弱毒株检测为阳性结果(a-2浊度仪扩增ndv弱毒株有扩增曲线，b-2只有ndv弱毒株荧光下呈红色荧光)，而对禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌，禽巴氏杆菌，鸡毒支原体的检测均为阴性(a-2浊度仪没有扩增曲线，b-2没有呈红色荧光)。a-3和b-3只有ndv强毒株和弱毒株混合检测为阳性结果(a-3浊度仪扩增ndv强毒株和弱毒株混合有扩增曲线，b-3只有ndv强毒株和弱毒株混合荧光下呈黄色荧光)，而对禽流感病毒，传染性支气管炎病毒，传染性喉气管炎病毒，副鸡嗜血杆菌，禽巴氏杆菌，鸡毒支原体的检测均为阴性(a-3浊度仪没有扩增曲线，b-3没有呈黄色荧光)。

四、灵敏度检测

将ndv的cdna按10倍倍比稀释至100000copies/μl、10000copies/μl、1000copies/μl、100copies/μl、10copies/μl、1copies/μl和阴性对照(水)为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行lamp反应。

结果如图2所示，a-1图为ndv强毒株浊度仪扩增结果，b-1图为ndv强毒株荧光核酸成像仪观察结果，其中a-1中，1为100000copies/μl、2为10000copies/μl、3为1000copies/μl、4为100copies/μl，5为10copies/μl，6为1copies/μl，7为阴性对照(水)；b-1中，1为100000copies/μl、2为10000copies/μl、3为1000copies/μl、4为100copies/μl，5为10copies/μl，6为1copies/μl，7为阴性对照(水)。可以看出，lamp对ndv强毒株的cdna的最小检测限为100copies/μl(a-1浊度仪扩增有扩增曲线，b-1有绿色荧光)。同理，ndv弱毒株的cdna的最小检测限也为100copies/μl。

五、对ndv临床分离株的检测

将临床分离的ndv毒株，抽提基因组rna并反转录为cdna为模板，按照上述二中的最佳反应体系和最佳反应条件进行lamp反应。

结果如图3所示，2，3，9，10，12，13为ndv强毒株，1，4，5，7，8，11，16为弱毒株，6，14，15为强毒株和弱毒株混合感染，17为阴性对照(水)。

序列表

<110>广西壮族自治区兽医研究所

<120>二重荧光lamp区分新城疫强弱毒检测试剂盒及其引物组

<160>6

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>42

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

gtcgccaagaggagtgagcaaacaaaagccccattagaggca42

<210>2

<211>41

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>2

agggtctgtgtccacatctggagcaaccccaagagctacac41

<210>3

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

agggataaggaggcgtgtg19

<210>4

<211>19

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gctgctgttatctgtgccg19

<210>5

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>5

aggagrcararacgctttataggtgc26

<210>6

<211>26

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>6

gggaracagggrcgycttataggcgc26