一种iPS细胞培养上清液及其制备方法和应用与流程

本发明属于细胞技术领域，涉及一种ips细胞培养上清液及其制备方法和应用。

背景技术：

诱导多能干细胞(inducedpluripotentstemcell，ips细胞)的出现既解决了成体干细胞增殖分化能力有限的问题，又避免了胚胎干细胞的伦理学问题，为再生医学提供了一种可靠的种子细胞来源；干细胞是一种非成熟细胞，具有多向分化潜力。理论上，干细胞在组织损伤的内环境下具有定向诱导分化的能力，即实现损伤组织按需修复与再生的可能。目前以干细胞为基础的细胞疗法正成为再生医学研究领域中的热点和前沿(史桂东.ips细胞衍生的神经干细胞联合激活态雪旺细胞修复脊髓损伤的实验研究.msthesis.天津医科大学,2018)。

研究表明ips细胞具有组织修复的功能，目前ips细胞的应用基本是采用ips细胞提取物，但是ips细胞提取物的提取过程复杂，细胞培养周期长，细胞增殖慢，用细胞提取损耗细胞量太大，成本高，不利于大规模使用。而细胞会分泌多种因子(沈昕.吴国锋ips细胞外泌体对牙源性间充质干细胞的增殖效率及成骨、成脂分化能力的影响[a].中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会.2018全国口腔生物医学学术年会论文汇编[c].中华口腔医学会口腔生物医学专业委员会:中华口腔医学会,2018:2)。主要包括3大类：第一类，细胞外基质成分，如各种胶原蛋白和弹性蛋白等；第二类，生长因子类，如转化生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮生长因子和碱性成纤维细胞生长因子等；第三类，炎症因子及趋化因子类，如前列腺素e2、白细胞介素6(il-6)、白细胞介素8(il-8)等，可通过旁分泌途径在损伤修复、组织再生、机体免疫调节等方面具有重要作用。

技术实现要素：

针对现有技术中存在的问题，本发明提供一种ips细胞培养上清液及其制备方法和应用，ips细胞培养上清液的制备方法简单易行，且ips细胞培养上清液具有修复效果，可与不同药剂制备成复合物，方便用于多种组织修复，适合大规模生产。

本发明是通过以下技术方案来实现：

一种ips细胞培养上清液的制备方法，包括：

步骤1，将ips细胞接种在培养基中进行扩增培养3-7d，使ips细胞浓度为1～7×10⁵/ml，得到ips细胞培养液；

步骤2，收集ips细胞培养液的上清液，离心浓缩2-6次，离心速率为2000-20000r/min，得到ips细胞培养上清液。

所述的制备方法得到的ips细胞培养上清液。

所述的ips细胞培养上清液在制备修复组织损伤的药物中的应用。

优选的，组织损伤为骨组织损伤、皮肤损伤、神经组织损伤、肺组织损伤或肝组织损伤。

一种组合物，包括所述的ips细胞培养上清液以及第二药剂，第二药剂为烧伤药剂、修复药剂和医美药剂中的一种或几种。

优选的，组合物的剂型为液体、粉末、片剂或敷料。

优选的，医美药剂为美白剂、抗衰老制剂或消炎制剂。

优选的，第二药剂为维生素、蛋白质、酶、玻尿酸和激素的一种或几种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明通过ips细胞培养，分离上清液，离心浓缩，制备得到ips细胞培养上清液，无需提取ips细胞提取物，即通过一定速率浓缩得到的ips细胞培养上清液即具有组织修复的作用，不离心浓缩，会导致上清中的生物活性因子量不够而无法产生作用，且无免疫排斥反应，并可添加医美药剂，具有复合修复功能。本发明的细胞培养上清液易于获取，适合于大规模制备。

成纤维细胞是皮肤真皮层中主要的细胞，它可以产生大量的胶原蛋白、弹性纤维蛋白及多种细胞修复因子，并可通过血液系统进入全身各系统，具有强大的自我更新能力，在机体损伤修复中起着重要的作用。研究表明创伤会造成机体不同程度的细胞变性、坏死以及组织缺损，需要通过组织修复来愈合，在此修复过程中，需要一系列不同细胞的参与，如角质细胞、内皮细胞、成纤维细胞、巨噬细胞和血小板等，这些细胞通过增殖、迁移、炎症反应，与生长因子、信号通路共同作用修复重建皮肤。hsf(人皮肤成纤维细胞)的激活与增殖是皮肤损伤修复的中心环节，通过诱导hsf的增殖可达到促进皮肤修复的目的。本发明通过实验结证明，本发明制备的ips细胞培养上清液即具有诱导hsf细胞增殖的作用，因此能够修复皮肤损伤。

本发明还可以在ips细胞培养上清液中加入一些医美药剂，例如玻尿酸、美白相关物质，如：维生素c(vitaminc)具有防治坏血酸的功能，是一种水溶性的维生素，维生素c参加体内的氧化还原反应，起到解毒的作用；参与体内多种羟化反应，可以促进胶原蛋白的合成，促进胆同醇的代谢；刺激免疫系统，可防治感染，抑制病毒的增生，阻止致癌物质的生成。再如，抗氧化/衰老剂。自由基是一种生物在进行生命活动时所发生的生物化学反应的中间产物，而机体在正常生理状态下，体内的自由基数量处于一个动态平衡中。但随着生物年龄的增长，机体对自由基的清理能力逐渐减弱，而当自由基在人体内堆积时，就会在分子水平上对人体的细胞以及器官造成损伤，从而使机体的衰老速度加快。其中与机体老化程度有关的生物自由基往往是一种含氧自由基。氧自由基的堆积促进黑素合成，加速皮肤老化。而体内抗氧化酶的存在，可对抗或阻断氧自由基对细胞的危害，并及时修复受损细胞。因此相关抗氧化药剂加入ips培养液中，使其具有抗氧化效果。使得制剂不仅有伤痕修复、还有美白修复、抗炎、延缓组织衰老等多种修复作用；可以在多方面、多层面进行修复，产生复合效用

附图说明

图1为低速离心的ips-cm培养hsf细胞96h后的hsf细胞增殖情况。

图2为高速离心的ips-cm培养hsf细胞72h后的hsf细胞增殖情况。

图3为ips-cm培养hsf细胞72h的肿瘤坏死因子tnf-α表达情况。

图4ips-cm培养hsf细胞72h的成纤维细胞生长因子tgf-β表达情况。

具体实施方式

下面结合具体的实施例对本发明做进一步的详细说明，所述是对本发明的解释而不是限定。

本发明所述的ips细胞培养上清液(ipsculturemedium，ips-cm)的制备方法，包括：

步骤1，诱导多能干细胞(ips)的培养：matrigel基质胶37℃静置1h后，用mtesr+5×supplement培养基培养，接种诱导多能干细胞，并于37℃的co2培养箱中培养，扩增培养3-7d，使ips细胞浓度为1～7×10⁵个/ml，得到ips细胞培养液；

步骤2，ips细胞培养上清液的制备：收集ips细胞培养液的上清液，，-20℃冷藏保存，离心浓缩(低速离心或高速离心2-6次)，体积浓缩至原体积的1/8，即得ips细胞培养上清液。

还可以在ips细胞培养上清液中加入其他产生效应的制剂，与ips细胞培养上清液制成混合物，例如美白剂、抗衰老制剂、消炎制剂、玻尿酸等效应分子，使得该制剂不仅有伤痕修复、还有美白修复、抗炎、延缓组织衰老等多种修复作用；可以在多方面、多层面进行修复，产生复合效用。

以加入维生素c为例(或者维生素e、抗氧化剂、酶、金属离子、激素等)，使用时，称取0.1～2mg维生素c粉末，加入至10mlips细胞培养上清液中，漩涡振荡使其充分溶解，制成液体。维生素c的浓度0.1～10mg/ml。

可以将上述组合物加入药学上可接受的辅料制成复合制剂。

将ips细胞培养上清液用培养hsf细胞的dmem完全培养基稀释成不同体积浓度梯度(30％、50％、100％)，用于后续的效果验证实验。

以皮肤组织为例，dmem完全培养基稀释的ips细胞培养上清液加入hsf的培养体系中，对从hsf细胞的形态学观察、胶原蛋白含量测定、创伤组织中修复相关因子的表达(q-pcr法)(包括血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、转化生长因子β、表皮生长因子)，讨论是否对人皮肤成纤维细胞具有促进增殖、修复的作用。

结果证明ips细胞培养上清液可用于组织修复(图1，2)，所述组织修复为骨组织损伤、皮肤损伤、神经组织损伤、肺组织损伤、肝组织损伤后的组织修复。

还可进一步通过实施例来理解本发明，其中所述实施例说明了一些制备或使用方法。然而，要理解的是，这些实施例不限制本发明。现在已知的或进一步开发的本发明的变化被认为落入本文中描述的和以下要求保护的本发明范围之内。

制备实施例1ips细胞扩增和培养上清液制备

分别培养ips细胞3d，细胞浓度为1×10⁵个/ml，获取ips细胞培养液，收集并2000r/min低速离心10min浓缩三次，使体积浓缩至原体积的1/8，另一组实验采用20000r/min高速离心10min浓缩三次，使体积浓缩至原体积的1/8，分别得到ips-cm。

制备实施例2ips细胞扩增和培养上清液制备

分别培养ips细胞4d，细胞浓度为3×10⁵个/ml，获取ips细胞培养液，收集并2000r/min低速离心10min浓缩2次，得到ips-cm。

制备实施例3ips细胞扩增和培养上清液制备

分别培养ips细胞5d，细胞浓度为6×10⁵个/ml，获取ips细胞培养液，收集并10000r/min低速离心10min浓缩5次，得到ips-cm。

制备实施例4ips细胞扩增和培养上清液制备

分别培养ips细胞7d，细胞浓度为7×10⁵个/ml，获取ips细胞培养液，收集并20000r/min低速离心10min浓缩6次，得到ips-cm。

制备实施例4

检测ips-cm对hsf细胞产生胶原蛋白含量的影响，若ips-cm促进hsf细胞增殖，而hsf细胞本身是产生胶原蛋白的唯一细胞，据此可得知ips-cm促进hsf产生胶原蛋白。

应用实施例1ips细胞培养上清液对hsf细胞增殖的影响

将实施例1制备的ips-cm用培养人皮肤成纤维细胞hsf细胞的dmem完全培养基稀释成不同浓度梯度(30％、50％、100％)，置于4℃冰箱用于后续的实验。将hsf细胞接种于96孔板，每孔5×10⁴个/ml细胞，细胞贴壁24h后，弃掉培养基，用pbs清洗3次，换成含有ips-cm的dmem培养基继续培养，ips-cm体积浓度设置不同的梯度(30％、50％、100％)，对照组为只含有dmem的培养基培养细胞，3d后检测hsf细胞生长状态，按照试剂盒避光加入mtt，37℃孵育4h，加入辅助缓冲液震荡10min，490nm检测。

结果发现含有ips-cm的实验组，对hsf细胞均有增殖促进作用。如图1所示，低速离心收集的ips-cm，在不同稀释浓度(30％、50％、100％)下培养hsf细胞4d后的结果显示，hsf细胞在浓度100％的ips-cm处理下才显著促进增殖(p＜0.05)。

如图2所示，通过高速离心浓缩收集的ips-cm，在不同稀释浓度(30％、50％、100％)下培养hsf细胞3d后的结果显示，与对照组相比，hsf细胞在ips-cm处理下总体增殖比率升高，50％、100％的ips-cm即呈现显著促进人原代皮肤成纤维细胞增殖作用(p＜0.05)。

应用实施例2检测ips-cm对hsf细胞相关生长因子的影响

在应用实施例1的基础上，将培养3d的hsf接种于六孔板，细胞贴壁24h后弃掉培养基，pbs清洗3次，换高速离心浓缩收集的ips-cm在稀释浓度100％条件下培养hsf细胞3d后，测试hsf细胞的肿瘤坏死因子α(tnf-α)的表达情况，tnf-α对某些肿瘤细胞具有生长因子样作用，也可促进c-myc和c-fos等与癌细胞增殖密切相关原癌基因的表达。结果如图3所示，ips-cm的实验组中hsf细胞的肿瘤坏死因子α的表达显著低于对照组(p＜0.01)，

进一步，高速离心浓缩收集的ips-cm，在稀释浓度50％、100％条件下培养hsf细胞3d，检测hsf细胞的与皮肤再生相关的生长因子的表达。如图4所示，结果显示，hsf细胞的皮肤再生相关生长因子(纤维细胞生长因子，转化生长因子β(tgf-β))表达均显著高于对照组，差异具有统计学意义(p＜0.01)；tgf-β生长因子具有促进成纤维细胞生长的作用，tgf-β增多促进hsf生长，促进修复。

应用实施例3检测ips-cm对hsf细胞胶原蛋白含量的影响

根据应用实施例1结果，ips-cm促进hsf细胞增殖，而hsf细胞本身是产生胶原蛋白的唯一细胞，胶原蛋白作为细胞外基质的重要结构蛋白，具有促进细胞成活和生长、纤维再形成、促进血小板凝结，消除瘢痕，促进伤口愈合等作用，对皮肤创面的修复至关重要。因此，提示ips培养上清可促进人皮肤成纤维细胞胶原蛋白的表达，从而促进皮肤修复再生。