一种维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法与流程

本发明属于胚胎干细胞培养技术领域，尤其涉及一种维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法。

背景技术：

胚胎干细胞(embryonicstemcell,esc)是一类具有自我更新能力的多潜能性细胞,在体外特定培养条件下能维持不分化状态并具有增殖能力，从囊胚期的内细胞团(icm)可以分离得到esc。自1981年evans和kaufman首次成功分离小鼠胚胎干细胞并在体外进行培养，这些细胞具有自我更新以及多向分化的潜能。目前研究得最为广泛的干细胞也是小鼠胚胎干细胞（mouseembryonicstemcells，mescs），这也是第一株在体外成功建立的干细胞系。目前体外培养小鼠胚胎干细胞的方法有两种：血清（serum）培养基加白血病抑制因子（leukemiainhibitoryfactor，lif）；无血清的n2b27加两个小分子抑制剂(2i)，即chir99021和pd0325901。这两种培养基通过不同的信号通路维持胚胎干细胞的自我更新。在mescs中，lif主要激活jak/stat3信号通路维持mescs自我更新。2i分别是通过抑制糖原合成酶激酶3β（gsk3β）和分裂原活化蛋白激酶激酶(mek)来维持小鼠胚胎干细胞的自我更新。

lif作为一种具有多种功能的细胞因子，是白细胞介素6（il-6）家族的成员之一，其最重要的应用是通过抑制自发分化来维持mescs的未自我更新状态。在培养时，如果撤掉lif，mescs会很快地向中内胚层分化。总之lif在维持小鼠胚胎干细胞自我更新中发挥着重要的作用。相对于在无血清的n2b27培养基和两个小分子抑制剂(2i)条件下培养的小鼠胚胎干细胞具有更加省时、省力、省钱的优点，在平时的小鼠胚胎干细胞培养中都会添加lif因子。

mk2是p38丝裂原活化蛋白激酶（mapk）的下游底物，控制着rna结合蛋白的激活和失活。p38/mk2信号转导通路与细胞周期调控，细胞迁移和炎症有关。实验证据表明，mk2是p38的主要靶标，它调节与p38有关的必需基因的稳定性。已经确定，mk2在多种细胞过程中发挥重要作用，如细胞骨架重组，染色质重塑，细胞周期调控等。

本发明研究人员发现mk2抑制剂(mk2-in-1、mk2iv、pf-3644022等)能够有效地提高mescs的自我更新能力，大大地改善了目前只用单一lif培养mescs的状况。在此种培养条件下，只需少量的lif即可维持小鼠胚胎干细胞的自我更新。并且可多次传代，不出现分化现象。因此本发明在小鼠胚胎干细胞的一般培养条件基础上，通过添加mk2抑制剂mk2-in-1(或mk2iii、mk2iv、pf-3644022等)及用少量的lif即可长期稳定地维持小鼠胚胎干细胞的自我更新状态。所以该方法不仅扩大了对小鼠胚胎干细胞培养条件的认识，更重要的是还有利于后续对于细胞内相关信号通路与分子机制的深入探究，对于促进干细胞基础与应用研究的顺利开展具有重要作用。

技术实现要素：

本发明目的就是为了弥补已有技术的缺陷，解决传统培养条件中单一lif培养条件等问题，提供一种维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法，该方法经济高效、效果稳定、利于开展后期小鼠胚胎干细胞培养条件和相关机制的研究。

为了实现上述的目的，本发明提供以下技术方案：

一种维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法，在含10%fbs的dmem培养基基础上，通过加入少量白血病抑制因子和mk2-in-1两种小分子化合物来维持小鼠胚胎干细胞的自我更新状态。

所述培养方法包括以下具体步骤：

（1）取1毫升0.1%的明胶于孔板中，放置于5%的co2、37℃的培养箱中培养30min；

（2）取生长至70-80%密度的小鼠胚胎干细胞，弃培养液，用pbs洗涤细胞1次，除去残留的培养液；

（3）吸净磷酸盐缓冲液pbs，并加入1毫升胰蛋白酶消化2-3min，待细胞边缘开始出现浮起，用枪头轻轻吹打细胞，使细胞呈一个个的单细胞状态，准备一个新的15毫升离心管，加入2毫升的血清培养液，将吹打下来的细胞悬液加入其中；

（4）以1000rpm离心3min，吸去上清后，加入适量培养液重悬细胞，在显微镜下利用血球计数板对悬液中的细胞进行计数，并以此计算出细胞的密度；

（5）取已包被好的培养皿，弃明胶，向培养皿孔内加入2mldmem培养基；

（6）向培养基中加入5×10⁴个细胞，水平十字形晃动，使细胞分布均匀；

（7）依次添加10u/ml白血病抑制因子和2μmmk2-in-1，水平十字形晃动，使其混合均匀；

（8）将细胞培养皿置于37℃、5%co2浓度的细胞培养箱内培养。

所述dmem培养基具体包括以下比例成分：450mldmem高糖，10%fbs，1%mem非必须氨基酸，2mml-glutamin，0.1mmβ-巯基乙醇，1mm丙酮酸钠，100单位的青霉素和100µg的链霉素。

本发明的优点是：

（1）本发明采用在10%fbs含量的dmem培养基中加入lif和mk2-in-1两种小分子的方法来培养小鼠胚胎干细胞，在此种培养条件下，细胞生长情况良好，能够维持自我更新的状态，可多次传代，不出现分化现象。

（2）与传统的需要单lif一定浓度的培养条件相比，本发明只需少量lif即可维持小鼠胚胎干细胞的自我更新，该方法效果稳定，使干细胞能在体外长时间培养，有利于人胚胎干细胞未来的基础和应用研究。

（3）与现有的单lif培养条件相比，由于该方法添加了mk2通路的抑制剂，这有利于后续对细胞内相关信号通路与分子调控机制展开深入探究。

（4）本发明所摸索出的培养条件，扩大了胚胎干细胞的自我更新机制，对于促进干细胞基础与应用研究的顺利开展具有重要作用。

附图说明

图1所示为两种条件下培养5代以后的小鼠胚胎干细胞在相差显微镜下的形态图，其中实验组（mk2-in-1+lif，左图）细胞处于自我更新状态，对照组（lif，右图）细胞则处于分化状态。

图2所示为两种条件下培养5代后的小鼠胚胎干细胞ap染色图，其中未分化的细胞染成红色，而分化的细胞不着色，图中左图为实验组（mk2-in-1+lif），右图为对照组（lif）。

具体实施方式

以下结合具体的实例对本发明的技术方案做进一步说明：

实验中所使用的小鼠的胚胎干细胞由美国南加州大学提供。

一种维持小鼠胚胎干细胞自我更新的培养方法，包括以下具体步骤：

（1）以六孔板为例，取1毫升0.1%的明胶于孔板中，放置于5%的co2、37℃的培养箱中培养30min；

（2）取生长至70-80%密度的小鼠胚胎干细胞，弃培养液，用pbs洗涤细胞1次，除去残留的培养液；

（3）吸净磷酸盐缓冲液pbs，并加入1毫升胰蛋白酶消化2-3min，待细胞边缘开始出现浮起，用枪头轻轻吹打细胞（切记不可吹打过猛，以免污染其他孔细胞），使细胞呈一个个的单细胞状态，准备一个新的15毫升离心管，加入2毫升的血清培养液，将吹打下来的细胞悬液加入其中；

（4）以1000rpm离心3min，吸去上清后，加入适量培养液重悬细胞，在显微镜下利用血球计数板对悬液中的细胞进行计数，并以此计算出细胞的密度；

（5）取已包被好的培养皿，弃明胶，向培养皿孔内加入2mldmem培养基，所述dmem培养基具体包括以下比例成分：450mldmem高糖，10%fbs，1%mem非必须氨基酸，2mml-glutamin，0.1mmβ-巯基乙醇，1mm丙酮酸钠，100单位的青霉素和100µg的链霉素。

（6）向培养基中加入5×10⁴个细胞，水平十字形晃动，使细胞分布均匀；

（7）依次添加10u/ml白血病抑制因子作为对照组，水平十字形晃动，使其混合均匀；

同时设置一组实验组：实验组在添加10u/ml白血病抑制因子的基础上再添加2μmmk2-in-1；

（8）将细胞培养皿置于37℃、5%co2浓度的细胞培养箱内培养。

自我更新与细胞特性检测：

（1）形态观察：使用leicadmil倒置相差显微镜对mk2-in-1+lif条件下、不同培养天数的小鼠的胚胎干细胞进行观察，以细胞形态特征进行检测，发现细胞逐渐形成扁平的单层或多层形态，细胞之间堆积紧密，集落边界清晰，符合自我更新的形态特征，如图1所示；

将细胞多次传代后，观察不同代数细胞的培养形态：实验组小鼠胚胎干细胞保持自我更新的特征；对照组细胞出现大部分分化情况。

（2）ap染色检测细胞自我更新情况，具体方法如下：

在实验组、对照组细胞传代培养5代后进行ap染色；

a、首先配置染色剂，将一个8523r胶囊（sigma-aldrich）溶入48ml的水中放在3-5℃避光保存，取适量，将其与slbj6060v(sigma-aldrich)按25：1的比例充分混合成染色剂；

b、将不同培养条件下培养好的干细胞，弃培养液，加pbs洗一遍，加0.9-1.2ml的3.8-4.2%多聚甲醛固定细胞1.5-2.5分钟；

c、弃多聚甲醛，加pbs洗两遍，把多聚甲醛残留洗掉，每个培养孔2ml的染色剂，避光静置38-43分钟；

d、弃染色液，用pbs洗两遍，加适量pbs后放在leicadmil倒置相差显微镜观察拍照，观察的着色状态，判断细胞的自我更新状态；

如图2所示，观察的着色状态，可以观察到对照组细胞无色，说明已经分化，实验组细胞被染成红色，符合自我更新的特征。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。